HIV-1 tropism and CD4 T lymphocyte recovery in a prospective cohort of patients initiating HAART in Ribeir��o Preto, Brazil

While human immunodeficiency virus (HIV)-1 chemokine co-receptors 5 tropism and the GWGR motif in the envelope third variable region (V3 loop) have been associated with a slower disease progression, their influence on antiretroviral response remains unclear. The impact of baseline V3 characteristics on treatment response was evaluated in a randomised, double blind, prospective cohort study with patients initiating highly active antiretroviral therapy with lopinavir or efavirenz plus azithothymidine/3TC (1:1) over 48 weeks. Similar virological and immunological responses were observed for both treatment regimens. The 43 individuals had a mean baseline CD4 T cell count of 119 cells/mm�� [standard deviation (SD) = 99] and a mean viral load of 5.09 log10 copies/mL (SD = 0.49). The GWGR motif was not associated with a CD4 T cell response, but predicted R5 tropism by the geno2pheno[clinical20%] algorithm correlated with higher CD4 T cell levels at all monitoring points (p < 0.05). Moreover, higher false-positive rates (FPR) values from this analysis revealed a strong correlation with CD4 T cell recovery (p < 0.0001). Transmitted drug resistance mutations, documented in 3/41 (7.3%) cases, were unrelated to the assigned antiretroviral regimen and had no impact on patient outcomes. In conclusion, na��ve HIV-1 R5 infected patients exhibited higher CD4 T cell counts at baseline; this difference was sustained throughout therapy. The geno2pheno[clinical] option FPR positively correlated with CD4 T cell gain and may be useful in predicting CD4 T cell recovery.

Bicistronic DNA vaccines simultaneously encoding HIV, HSV and HPV antigens promote CD8��� T cell responses and protective immunity

Millions of people worldwide are currently infected with human papillomavirus (HPV), herpes simplex virus (HSV) or human immunodeficiency virus (HIV). For this enormous contingent of people, the search for preventive and therapeutic immunological approaches represents a hope for the eradication of latent infection and/or virus-associated cancer. To date, attempts to develop vaccines against these viruses have been mainly based on a monovalent concept, in which one or more antigens of a virus are incorporated into a vaccine formulation. In the present report, we designed and tested an immunization strategy based on DNA vaccines that simultaneously encode antigens for HIV, HSV and HPV. With this purpose in mind, we tested two bicistronic DNA vaccines (pIRES I and pIRES II) that encode the HPV-16 oncoprotein E7 and the HIV protein p24 both genetically fused to the HSV-1 gD envelope protein. Mice i.m. immunized with the DNA vaccines mounted antigen-specific CD8��� T cell responses, including in vivo cytotoxic responses, against the three antigens. Under experimental conditions, the vaccines conferred protective immunity against challenges with a vaccinia virus expressing the HIV-derived protein Gag, an HSV-1 virus strain and implantation of tumor cells expressing the HPV-16 oncoproteins. Altogether, our results show that the concept of a trivalent HIV, HSV, and HPV vaccine capable to induce CD8��� T cell-dependent responses is feasible and may aid in the development of preventive and/or therapeutic approaches for the control of diseases associated with these viruses.

Identifizierung von T-Zell-erkannten Nierenzellkarzinom-Antigenen

Eine Voraussetzung f��r die Entwicklung neuer immunmodulatorischer Therapieverfahren ist die Kenntnis immunogener Tumorantigene, die von tumorreaktiven T-Zellen erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL, cytotoxic T-lymphocytes) aus dem Blut eines HLA (human leukocyte antigen)-kompatiblen Fremdspenders generiert. Methodisch wurden hierzu CD8-selektionierte periphere Blutlymphozyten repetitiv mit der klarzelligen Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC (RCC, renal cell carcinoma) in einer allogenen gemischten Lymphozyten-Tumorzell Kultur (MLTC, mixed lymphocyte tumor cell culture) stimuliert. Aus den Responderlymphozyten wurden mit Hilfe des Grenzverd��nnungsverfahrens klonale zytotoxische T-Zellen generiert und expandiert. Die CTL-Klone wurden anschlie��end ph��notypisch mittels Durchflu��zytometrie sowie funktionell mittels HLA-Antik��rper-Blockadeexperimenten und Kreuzreaktivit��tstests detailliert charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, da�� aus dem Blut eines allogenen gesunden Spenders CD8+ T-Zellen isoliert werden k��nnen, welche Reaktivit��t gegen Nierenzellkarzinome (NZK) aufweisen und ��ber verschiedene HLA-Klasse-I-Allele restringiert sind. Die von den einzelnen CTL-Klonen erkannten Zielstrukturen zeigten entweder ubiquit��re (z.B. HLA-Cw*0704-reaktiver CTL-Klon E77) oder eine tumorspezifische (z.B. HLA-B*0702-restringierter CTL-Klon A4) Gewebeexpression. Zur Identifizierung der nat��rlich prozessierten Peptidliganden wurden die HLA-B/C-Allele unter Verwendung des monoklonalen Antik��rpers B123.2 aus einem zuvor hergestellten Detergenslysat der Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC immunchromatographisch aufgereinigt. Aus den so isolierten HLA-Peptid-Komplexen wurden die tumorassoziierten Peptidliganden nach S��ureeluation und Filtration abgespalten und ��ber eine ���reverse phase���-HPLC (high performance liquid chromatography) fraktioniert. Die ��berpr��fung der einzelnen HPLC-Fraktionen auf Bioaktivit��t erfolgte mit den korrespondierenden CTL-Klonen in 51Cr-Zytotoxizit��tstests. Dabei wurde eine HPLC-Fraktion identifiziert, die die lytische Funktion des HLA-B*0702-restringierten CTL-Klons A4 ausl��sen konnte. Die bioaktive HPLC-Fraktion wurde dazu durch eine zweite (second dimension) Kapillar-Fl��ssigkeitschromatographie (Cap-LC, capillar liquid chromatography) in Subfraktionen geringerer Komplexit��t aufgetrennt und die darin enthaltenen Peptidepitope durch das MALDI-TOF/TOF (matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight/time of flight)-Analyseverfahren sequenziert. Innerhalb dieser HPLC-Fraktion wurden eine Vielzahl von HLA-B/C-assoziierten Peptidliganden erfolgreich sequenziert, was die Effektivit��t dieser Verfahrenstechnik zur Identifizierung nat��rlich prozessierter HLA-Klasse-I-bindender Peptide unter Beweis stellt. Leider war es mit dieser Methode bisher nicht m��glich, das von CTL-Klon A4 detektierte Peptidepitop zu sequenzieren. Dies liegt m��glicherweise in der unzureichenden Konzentration des Peptidepitops in der bioaktiven HPLC-Fraktion begr��ndet. In Folgearbeiten soll nun mit erh��hter Probenmenge beziehungsweise verbesserter Analytik der erneute Versuch unternommen werden, das Zielantigen des CTL-Klons A4 zu identifizieren. Die Kenntnis von Antigenen, die tumorspezifisch exprimiert und von CD8+ CTL aus gesunden Spendern erkannt werden, er��ffnet neue therapeutische M��glichkeiten, das spezifische Immunsystem des Stammzellspenders nach allogener Blutstammzelltransplantation gezielt zur Steigerung von Tumorabsto��ungsreaktionen (z.B. durch Vakzinierung oder adoptivem T-Zelltransfer) zu nutzen.

Untersuchungen zur Lymphozytotoxizit��t gegen Tumoren in Nierenzellkarzinom-Patienten und HLA-kompatiblen gesunden Spendern

In der vorliegenden Arbeit wurden Blutlymphozyten, die aus allogenen, serologisch HLA (humanes Leukozytenantigen)-identischen gesunden Geschwisterspendern von Nierenzellkarzinom (RCC, engl. renal cell carcinoma)-Patienten isoliert wurden, auf ihre antitumorale Reaktivit��t in vitro untersucht. Dazu war die vorangehende Generierung von stabil in vitro wachsenden Tumorzelllinien der Patienten zwingende Voraussetzung. Insgesamt wurden aus prim��rem Tumorgewebe von 65 Nierenzellkarzinom-Patienten Tumorzellen isoliert und daraus Zellkulturen angelegt. In 28 % der F��lle gelang es, eine konstant in Zellkultur wachsende Tumorzelllinie zu etablieren. Daneben wurden aus 56 Tumorpatienten auch die aus dem angrenzenden Nierengewebe gewonnenen nicht-malignen Nierenzellen ��ber wenige Zellkultur-Passagen expandiert. In vier Patienten mit stabil in vitro wachsender Tumorzelllinie war ein allogener HLA-identischer Geschwisterspender verf��gbar. In diesen Modellsystemen wurden in gemischten Lymphozyten-Tumorzell-Kulturen (MLTCs, engl. mixed lymphocyte tumor cell cultures) die Blutlymphozyten der Patienten und der gesunden Geschwisterspender mit der jeweiligen Nierenzellkarzinom-Zelllinie stimuliert und tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs, engl. cytotoxic T-lymphocytes) generiert. Wenn m��glich wurden aus den so gewonnenen ���Responder���-Massenkulturen CD8+ T-Zellklone isoliert und hinsichtlich ihrer Funktionalit��t in IFN-��-ELISpot-Assays und 51Chrom-Zytotoxizit��tstests untersucht. Durch Blockade der HLA-Molek��le mit monoklonalen Antik��rpern wurden die HLA-Restriktionselemente sowie weitere an der Erkennung beteiligte Oberfl��chenmolek��le analysiert. Kreuzreaktivit��tsuntersuchungen mit einem breiten Zielzell-���Panel��� gaben Aufschluss ��ber die Reaktivit��t der CTLs gegen RCC, nicht-maligne Nierenzellen, h��matopoetische Zielzellen von Patient und Geschwisterspender und weitere Tumorzelllinien aus Nierenzellkarzinomen und anderen Tumorentit��ten. Interessanterweise zeigten die Geschwister-MLTC-���Responder���-Lymphozyten im Vergleich zu den autologen MLTC-���Responder���-Lymphozyten eine st��rkere Proliferation und Zytotoxizit��t nach Stimulation mit Tumorzellen. Die allogenen tumorreaktiven ���Responder���-Lymphozyten entstammten der CD8+ CD62L(high)+ Subpopulation, die naive Vorl��ufer- und ���central memory���-T-Zellen enth��lt. Im Gegensatz zu autologen MLTC-Lymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten konnte aus nahezu allen allogenen MLTCs mithilfe des Grenzverd��nnungsverfahrens ein breites Spektrum an tumorreaktiven CTL-Klonen expandiert werden. Diese lysierten entweder ausschlie��lich die autologe RCC-Zelllinie oder kreuzreagierten mit autologen nicht-malignen Nierenzellen. Eine Minderheit der CTL-Klone erkannte au��erdem h��matopoetische Zellen des Patienten oder allogene Tumorzellen. Als HLA-Restriktionselemente der allogenen tumorreaktiven CD8+ CTL-Klone wurden HLA-A2, -A3, -A11, -A24 und -B7 identifiziert. Weiterhin wurden in einem Modellsystem bisher unbekannte, stark proliferierende CD3+ CD16+ CD57+ CTL-Klone mit nicht-HLA-restringierter Tumorreaktivit��t isoliert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmals, dass allogene Blutlymphozyten von HLA-identischen gesunden Geschwistern eine Vielfalt von tumorreaktiven CD8+ CTL-Klonen enthalten. Im direkten Vergleich mit autologen Blutlymphozyten der betroffenen Patienten besitzen allogene Blutlymphozyten der Geschwister eine st��rkere proliferative und zytotoxische Tumorreaktivit��t. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermutigen weitere Bem��hungen, tumorreaktive T-Zellen aus dem Blut von HLA-identischen gesunden Geschwisterspendern in vitro zu generieren. Solche T-Zellen w��ren in zweierlei Hinsicht von Interesse: Zum einen erm��glichen sie die Identifizierung der Zielantigene, die von T-Zellen aus gesunden Individuen auf Tumoren erkannt werden und als Zielstrukturen von antigenspezifischen Immuntherapien (z. B. Vakzination) dienen k��nnten. Zum anderen k��nnten diese T-Zellen m��glicherweise f��r eine adoptive Immuntherapie der betroffenen Tumorpatienten verwendet werden.

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual���s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Studying MHC I-dependent CD8 + T cell responses in the model of murine cutaneous leishmaniasis

Der Ausheilung von Infektionen mit Leishmania major liegt die Sekretion von IFN-��� von sowohl CD4+ als auch CD8+ T Zellen zugrunde.rnAktuell konnte in der Literatur nur ein Epitop aus dem parasit��ren LACK Protein f��r eine effektive CD4+ T Zell-vermittelte Immunantwort beschrieben werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, m��gliche MHC I abh��ngige CD8+ T Zell Antworten zu untersuchen. rnF��r diesen Ansatz wurde als erstes der Effekt einer Vakzinierung mit LACK Protein fusioniert an die Protein-Transduktionsdom��ne des HIV-1 (TAT) analysiert. Die Effektivit��t von TAT-LACK gegen��ber CD8+ T Zellen wurde mittels in vivo Protein-Vakzinierung von resistenten C57BL/6 M��usen in Depletions-Experimenten gezeigt.rnDie Prozessierung von Proteinen vor der Pr��sentation immunogener Peptide gegen��ber T Zellen ist unbedingt erforderlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Rolle des IFN-���-induzierbaren Immunoproteasoms bei der Prozessierung von parasit��ren Proteinen und Pr��sentation von Peptiden gebunden an MHC I Molek��le durch in vivo und in vitro Experimente untersucht. Es konnte in dieser Arbeit eine Immunoproteasom-unabh��ngige Prozessierung aufgezeigt werden.rnWeiterhin wurde Parasitenlysat (SLA) von sowohl Promastigoten als auch Amastigoten fraktioniert. In weiterf��hrenden Experimenten k��nnen diese Fraktionen auf immunodominante Proteine/Peptide hin untersucht werden. rnLetztlich wurden Epitop-Vorhersagen f��r CD8+ T Zellen mittels computergest��tzer Software von beiden parasit��ren Lebensformen durchgef��hrt. 300 dieser Epitope wurden synthetisiert und werden in weiterf��hrenden Experimenten zur Charakterisierung immunogener Eigenschaften weiter verwendet. rnIn ihrer Gesamtheit tr��gt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verst��ndnis ��ber die komplexen Mechanismen der Prozessierung und letztendlich zur Identifikation von m��glichen CD8+ T Zell Epitopen bei. Ein detailiertes Verst��ndnis der Prozessierung von CD8+ T Zell Epitopen von Leishmania major ��ber den MHC Klasse I Weg ist von h��chster Bedeutung. Die Charakterisierung sowie die Identifikation dieser Peptide wird einen ma��geblichen Einfluss auf die weiteren Entwicklungen von Vakzinen gegen diesen bedeutenden human-pathogenen Parasiten mit sich bringen. rn

Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter tumorassoziierter Antigene im Melanommodell D41

In der vorliegenden Arbeit wurden Zielstrukturen autologer, tumorreaktiver CD8+ T-Zellen im Modell des Melanompatienten D41 charakterisiert, der im metastasierten Stadium nach Vakzinierung mit autologen dendritischen Zellen und bestrahlten Tumorzellen eine dauerhafte komplette Remission erreichte (O��Rourke et al., Melanoma Res. 17:316, 2007). Aus kryokonservierten Blutlymphozyten verschiedener Zeitpunkte wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen (D41-MEL) in unabh��ngigen gemischten Lymphozyten-/Tumorzell-Kulturen (MLTCs) tumorreaktive CD8+ T-Zellen angereichert. Als Erstes wurde ��berpr��ft, ob sie gegen bekannte Melanomantigene in Assoziation mit den HLA-Klasse I-Allelen des Patienten gerichtet waren. Dabei zeigten sich Reaktivit��ten gegen das melanosomale Differenzierungsantigen Melan-A mit HLA-A*0201 und dar��ber hinaus gegen die Cancer/Testis-Antigene (CTA) MAGE-A3 und MAGE-A6 mit HLA-A*0101, sowie NY-ESO-1, MAGE-A4 und MAGE-A10 mit HLA-A*0201. In einem zweiten Schritt wurde mit T-Zell-Klonen aus D41-MLTC 2, die keines dieser Antigene erkannten, eine cDNA-Expressionsbank von D41-MEL gescreent. Dies f��hrte zur Klonierung einer f��r TSPY 1 (testis-specific protein Y-encoded 1) kodierenden cDNA mit einem der T-Zell-Klone. Er erkannte mit hoher Affinit��t die synthetischen TSPY 1-Peptide LLDDIMAEV (Aminos��urepositionen 66-73) und LLLDDIMAEV (Aminos��urepositionen 65-73) in Assoziation mit HLA-A*0201. Serologische Immunantworten gegen das als CTA einzustufende TSPY 1 sind bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine T-Zell-Antwort gegen TSPY 1 nachgewiesen. TSPY 1 tr��gt mutma��lich zu Entstehung des Gonadoblastoms bei, seine Expression wurde jedoch z.B. auch in Seminomen, Leberzellkarzinomen und Melanomen nachgewiesen. Die Expression von TSPY 1 in der Zelllinie D41-MEL-Zellen war sehr heterogen. Einzelne Klone der Linie exprimierten TSPY 1 auf stabil hohem, andere Klone auf ebenso stabil intermedi��rem bzw. nicht detektierbarem Niveau. Die Expression und die Erkennung durch TSPY 1-reaktive T-Zell-Klone wurde durch die demethylierende Substanz 5-Aza-2��-deoxycytidine gesteigert. Dies spricht f��r eine Promotor-Hypermethylierung als Ursache fehlender bzw. niedriger Expression, wie dies f��r verschiedene CTA zutrifft. Die im Blut des Patienten D41 detektierbare antitumorale T-Zell-Reaktivit��t war bereits vor der Vakzinierung mit Tumorzellen nachweisbar und hatte sich somit spontan entwickelt. Ihre Individualit��t war vorgegeben durch das Antigenexpressionsmuster der D41-Tumorzellen, sowie durch den HLA-Ph��notyp und mutma��lich auch das T-Zellrepertoire des Patienten. Die detaillierte Analyse komplexer antitumoraler T-Zellantworten legt den Grundstein f��r eine Immuntherapie, die sich auf das tats��chliche Potential des individuellen T-Zellsystems st��tzen kann.

Exploring the function of IL-10, BTLA and DCs as regulators of immune responses

This thesis focuses on different aspects of immune regulation, both at the cellular and molecular levels. More specifically, this work concentrates on the importance of Interleukin-10, B and T Lymphocyte Attenuator (BTLA), and dendritic cells in respect to immune regulation, with special emphasis on autoimmunity. In this thesis, we show that the cellular source of IL10 production can dramatically influence the outcome of an autoimmune response. We show that T cell-derived IL10 plays an important role in controlling the viability of recently activated T cells, allowing them to become fully functional T effector cells. T cell-specific IL10-deficient mice failed to induce EAE when immunized with MOG peptide. Furthermore, when re-challenged with MOG or other stimuli, these T cells exhibited increased apoptosis rates. Here we report for the first time the generation of a novel mouse model that allows the conditional over-expression of BTLA. We show that BTLA can negatively regulate CD4+ T cells responses, when expressed by the T cells themselves. BTLA over-expression by CD8+ T cells or dendritic cells, however, resulted in enhanced viral clearance. In this study, we show that depletion of DCs, either early on from birth or later in adulthood, does not prevent EAE induction, but instead leads to a lower state of tolerance and stronger immune response. We also show that DCs are responsible for the upregulation of PD-1 on antigen-specific T cells and subsequently induce the formation of Tregs during immune responses.

In vitro characterization of human AML-reactive CTL clones generated from the naive subset of healthy donors and adoptive transfer into leukemia-engrafted NSG mice

Acute myeloid leukemia (AML) is a very aggressive cancer of the hematopoietic system. Chemotherapy and immunotherapeutical approaches including hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) are the only curative options available. The beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effect of cellular immunotherapy is mostly mediated by donor-derived CD8+ T lymphocytes that recognize minor histocompatibility antigens (mHags) and leukemia-associated antigens (LAAs) presented on the surface of AML blasts (Falkenburg et al. 2008; Kolb 2008). A main complication is graft-versus-host disease (GVHD) that can be induced when cytotoxic T lymphocytes (CTLs) recognize broadly expressed antigens. To reduce the risk of GVHD, specific allogeneic T-cell therapy inducing selective GVL responses could be an option (Barrett &amp;amp; Le Blanc 2010; Parmar et al. 2011; Smits et al. 2011). This requires efficient in vitro strategies to generate AML-reactive T cells with an early differentiation phenotype as well as vigorous effector functions and humanized mouse models to analyze the anti-leukemic potential of adoptively transferred T cells in vivo. In this study, AML-reactive CTL clones and oligoclonal T-cell lines could be reliably generated from the naive subset of healthy HLA-class I-identical donors by stimulation with primary AML blasts in mini-mixed-lymphocyte / leukemia cultures (MLLCs) in eight different patient / donor pairs. These CTLs were promising candidates for cellular immunotherapy because of their relatively early differentiation phenotype and strong proliferative and lytic capabilities. The addition of the common ��-chain cytokine IL-21 to the stimulation protocol enabled more precursors to develop into potent leukemia-reactive CTLs, presumably by its beneficial effects on cell survival and antigen-specific proliferation during the first weeks of cultures. It also strengthened the early-stage phenotype. Three long-term cultured CTLs exemplarily transferred into leukemia-engrafted immunodeficient NSG mice mediated a significant reduction of the leukemic burden after a single transfusion. These results demonstrate that CTL clones with reactivity to patient-derived AML blasts can be isolated from the naive compartment of healthy donors and show potent anti-leukemic effects in vivo. The herein described allo-MLLC approach with in vitro ���programmed��� naive CTL precursors independent of a HSCT setting is a valuable alternative to the conventional method of isolating in vivo primed donor CTLs out of patients after transplantation (Kloosterboer et al. 2004; Warren et al. 2010). This would make leukemia-reactive CTLs already available at the time point of HSCT, when residual leukemia disease is minimal and the chances for complete leukemia eradication are high. Furthermore, leukemia-reactive CTLs effectively expanded by this in vitro protocol can be used as screening populations to identify novel candidate LAAs and mHags for antigen-specific immunotherapy.

Etablierung eines humanisierten Mausmodells zur In-vivo-Analyse von DC-adressierenden Nanopartikeln

In dieser Arbeit wurde zun��chst ein humanisiertes Mausmodell entwickelt f��r die Analyse von humanen DCs in vivo. Dar��ber hinaus wurden erste Versuche mit Nanopartikelbeladenen DCs durchgef��hrt, mit der Intention, durch diese Kombination humane DCs zu untersuchen. Es wurden immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R (NSG) M��use verwendet und mit humanen CD34+ PBSCs transplantiert. Es wurden insgesamt 14 Modelle getestet, mit einer durchschnittlichen Humanisierungsrate von 76 %. In allen Modellen konnten ab Woche sechs nach Transplantation humane CD45+ Zellen sowie humane Bund NK-Zellen und CD14+ Monozyten gefunden werden. Dar��ber hinaus waren myeloide DC-Vorl��uferzellen, konventionelle HLA DR CD11c DCs (cDCs) und plasmazytoide DCs (pDCs) vorhanden. Humane T-Zellen konnten nicht vor Woche 18 nach Transplantation beobachtet werden. Neben der Rekonstitution humaner DCs in peripheren Organen, wurde ebenfalls nach gewebsst��ndigen DCs, insbesondere den Langerhans Zellen (LCs) der Epidermis geschaut. Waren humane LC vorhanden, konnten diese ab Woche zw��lf nach Transplantation in der murinen Epidermis detektiert werden. Diese waren konstant bis in Woche 30 nach Transplantation nachweisbar. In Hinblick auf die Etablierung der DCs in diesem humanisierten Mausmodells wurden verschiedene Einflussgr����en getestet. IL-7 f��hrte zu keiner ver��nderten H��matopoese, wohingegen Flt3L zu einer Zunahme von CD14+ Monozyten und cDCs f��hrte. Dar��ber hinaus konnte eine drastische Abnahmernhumaner B-Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass der Zeitpunkt der Flt3LrnApplikation einen entscheidenen Faktor f��r den Effekt von Flt3L auf die Rekonstitution humaner Zellen darstellt. F��r die in dieser Arbeit durchgef��hrten funktionellen in vivo Studien, wurden humanisierten M��usen alloreaktive CD8+ T-Zellen appliziert. Somit sollte die Funktionalit��t der rekonstituierten humanen APCs getestet werden. Es wurde deutlich, dass Monozyten und DCs ihre Funktionalit��t erst ab Woche 14 nach Transplantation zu entwickeln schienen,rnwohingegen B-Zellen bereits zu fr��heren Zeitpunkten als Zielzellen f��r die alloreaktiven T-Zellen dienten. Dies wurde durch den R��ckgang der jeweiligen Zellen nach Applikation der T-Zellen sichtbar. Zu erw��hnen ist, dass das Anwachsen einer humanen H��matopoese stark spenderabh��ngig ist und somit keine allgemeing��ltigen Aussagen hinsichtlich der in vivo Funktion getroffen werden k��nnen. Um im Gewebe verbliebende APCs zu manipulieren gibt es verschiedene M��glichkeiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Polystyren-basierende Nanopartikel getestet. Die verwendeten Partikel hatten eine Gr����e von 80 bis 160 nm und waren unfunktionalisiert oder mit Amino- bzw. Carboxy-Gruppen versehen. Zus��tzlich wurden die Partikel mit BODIPY (Durchflusszytometrie und kLSM-Messungen), einem Infrarotnahem Farbstoff IR 780 (BFI-Messungen) und Platin (in vivo Messungen) beladen. Der Carboxy-funktionalisierte Partikel zeigte den geringsten Einfluss auf die Vitalit��t von humanen DCs, wohingegen der Amino-funktionalisierte Partikel bei steigender Konzentration toxisch wirkte. Bei unfunktionalisierten Partikeln stieg die Toxizit��t bei zunehmender Konzentration. Hinsichtlich der Expression diverser DC spezifischer Oberfl��chenmolek��le nach Beladung mit Nanopartikeln zeigte sich, dass allein der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestellte Partikel zu einer leichten Hochregulation von MHC-Klasse-II Molek��len f��hrte. Die Expression von CD86 wurde im Gegenzug nur durch die Beladung mit den Amino-, bzw. Carboxy funktionalisierten Partikeln und dem unfunktionalisierten, mit SDS hergestellten Partikel leicht gesteigert. Trotz der teilweise leicht ver��nderten Expression von Oberfl��chenmarkern, konnte mit Hilfe von IFN-g ELISpots keine Beeinflussungrnder Funktion als APCs von Nanopartikel-beladenen DCs beobachtet werden. In den in vivo Untersuchungen zeigten alle vier Partikel eine konstante Zirkulation imrnOrganismus und konnten bis 96 h nach Applikation nachgewiesen werden. Alle Partikel konnten prim��r in der Leber detektiert werden, wobei der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestelle Partikel das weiteste Verbreitungsmuster zeigte. Erste Versuche im humanisierten Mausmodell zeigten keine Beeinflussung der Verteilung und Kinetik von Nanopartikeln durch die humane H��matopoese. Mit dem in dieser Arbeit etablierten humanisierten Mausmodell ist es m��glich, die Entwicklung, Differenzierung, Aktivierung und Funktionalit��t humaner DCs in vivo zu untersuchen. Dar��ber hinaus kann das gezielte Adressieren von DCs in vivo analysiert werden, was sowohl die M��glichkeit der Manipulation von DCs zur Vermeidung einer akuten GvHD bietet als auch Verwendung in anderen DC-vermittelten Therapien (z.B.Vakzinationsstudien) findet.

CD137-selektierte leuk��miereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leuk��miepatienten = CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients

Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leuk��mie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollst��ndige Leuk��mieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen k��nnte die Infusion von leuk��miereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leuk��mie gerichtete Immunantwort und Immunit��t vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leuk��miereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivit��t gegen akute myeloische Leuk��mie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf m��gliche GVHD Zielstrukturen zeigen. F��r die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufw��ndig, wobei vor allem eine erhebliche Verk��rzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verk��rzung der in vitro Kulturzeit k��nnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder fr��hen effector memory Ph��notyp f��rdern, f��r die eine bessere in vivo Effektorfunktion und l��ngere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass daf��r das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien k��nnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leuk��miespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifit��t des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leuk��mie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und w��chentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation ��ber den Marker CD137 positiv isoliert und anschlie��end separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zus��tzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste w��hrend der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalf��rbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen k��nnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen f��r peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind m��gliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein k��nnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antik��rper-beschichteten magnetischen beads untersucht. F��r Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren f��r eine Stimulation w��hrend der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zus��tzliches CD137-Signal f��r die l��nger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung n��tzlich sein k��nnte. Die bead-Expansion ver��nderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine m����ige Verschlechterung der Zytotoxizit��t im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabh��ngigen zellsch��digenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads f��hrte. Unerw��nschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalit��t durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Ver��ffentlichungen, die eine fundierte Erkl��rung f��r den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten k��nnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolek��l f��r die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein k��nnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass f��r diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist.

The role of dendritic cells (DC) in Friend retrovirus-induced immunosuppression and immunotherapeutic applications of functionalized nanoparticles

Friend murine leukemia Virus (FV) infection of immunocompetent mice is a well- established model to acquire further knowledge about viral immune suppression mechanisms, with the aim to develop therapeutics against retrovirus-induced diseases. Interestingly, BALB/c mice are infected by low doses of FV and die from FV-induced erythroleukemia, while C57/BL6 mice are infected by FV only at high viral dose, and remain persistently infected for their whole life. Due to the central role of dendritic cells (DC) in the induction of anti-viral responses, we asked for their functional role in the genotype-dependent sensitivity towards FV infection. In my PhD study I showed that bone marrow (BM)-derived DC differentiated from FV-infected BM cells obtained from FV-inoculated BALB/c (FV susceptible) and C57BL/6 (FV resistant) mice showed an increased endocytotic activity and lowered expression of MHCII and of costimulatory receptors as compared with non-infected control BMDC. FV-infected BMDC from either mouse strain were partially resistant towards stimulation-induced upregulation of MHCII and costimulators, and accordingly were poor T cell stimulators in vitro and in vivo. In addition, FV-infected BMDC displayed an altered expression profile of proinflammator cytokines and favoured Th2 polarization. Ongoing work is focussed on elucidating the functional role of proteins identified as differentially expressed in FV-infected DC in a genotype-dependent manner, which therefore may contribute to the differential course of FV infection in vivo in BALB/c versus C57BL/6 mice. So far, more than 300 proteins have been identified which are differently regulated in FV-infected vs. uninfected DC from both mouse strains. One of these proteins, S100A9, was strongly upregulated specifically in BMDC derived from FV-infected C57BL/6 BM cells. S100A9-/- mice were more sensitive towards inoculation with FV than corresponding wild type (WT) mice (both C57BL/6 background), which suggests a decisive role of this factor for anti-viral defense. In addition, FV-infected S100A9-/- BMDC showed lower motility than WT DC. The future work is aimed to further elucidate the functional importance of S100A9 for DC functions. To exploit the potential of DC for immunotherapeutic applications, in another project of this PhD study the usability of different types of functionalized nanoparticles

Einfluss subviraler Partikel des humanen Cytomegalovirus auf die Induktion der antiviralen Immunantwort

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der insbesondere bei Patienten mit unreifem oder geschw��chtem Immunsystem schwere, teilweise lebensbedrohliche Erkrankungen verursacht. Aufgrund der klinischen Relevanz wird die Entwicklung einer Impfung gegen HCMV mit gro��em Nachdruck verfolgt. Subvirale Partikel des HCMV, sogenannte Dense Bodies (DB), stellen eine vielversprechende Impfstoff-Grundlage dar. Die innere Struktur der Partikel besteht aus viralen Proteinen, die als dominante Antigene der zellul��ren Immunantwort gegen HCMV identifiziert wurden. Die ��u��ere H��lle der Partikel entspricht der Virush��lle, sie enth��lt die viralen Oberfl��chenproteine als Zielantigene der neutralisierenden Antik��rper (NTAk)-Antwort in ihrer nat��rlichen Konformation. Die f��r ein Totantigen au��ergew��hnlich hohe Immunogenit��t der Partikel wurde bereits in Vorarbeiten dokumentiert. Ein Ziel dieser Arbeit war es, den molekularen Hintergrund f��r die herausragenden, immunogenen Eigenschaften von DB aufzukl��ren. Im ersten Teil der Arbeit wurde daher die Hypothese gepr��ft, dass DB geeignet sind, die Ausreifung und Aktivierung von dendritischen Zellen (DC) zu vermitteln und damit deren F��higkeit zur Antigenpr��sentation zu stimulieren. Derart aktivierten DC kommt eine wichtige Rolle beim Priming der T-lymphozyt��ren Immunantwort zu. In der Tat konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von unreifen dendritischen Zellen (iDC) mit DB zu verst��rkter Expression von solchen Molek��len auf der DC-Oberfl��che f��hrt, die mit Ausreifung der Zellen verkn��pft sind. Der Nachweis der verst��rkten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine belegte die Aktivierung der Zellen im Sinne einer entz��ndlichen Reaktion. Die erfolgreiche Stimulation von CD4 und CD8 T-Lymphozyten durch DB-behandelte DC belegte schlie��lich die funktionelle Relevanz der Ergebnisse. Zusammengefasst konnten in diesem Abschnitt der Arbeit die molekularen Grundlagen der adjuvanten Wirkung von DB aufgekl��rt werden. rnIn einem zweiten Abschnitt wurde die NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung n��her untersucht. Der humoralen Immunantwort kommt eine entscheidende Bedeutung bei der Pr��vention der HCMV-��bertragung zu. Hier galt es zu pr��fen, welchen Einfluss stammspezifische Unterschiede in der Expression viraler Oberfl��chenproteine auf die Induktion der NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung nehmen. Im Fokus stand dabei die variable Expression des pentameren Proteinkomplexes aus den viralen Proteinen gH/gL/pUL128-UL131A. Dieser Komplex wird nur von kliniknahen HCMV-St��mmen (HCMVKlin) exprimiert und ist f��r deren breiten Zelltropismus verantwortlich. Der pentamere Komplex fehlte in allen bisherigen Analysen der DB-Immunogenit��t, die auf der Grundlage von Laborst��mmen des HCMV (HCMVLab) durchgef��hrt worden waren. Ein erster Versuchsansatz zeigte, dass die NTAk-Antwort, die durch DB von HCMVLab (DBLab) induziert wird, auch gegen die Infektion mit HCMVKlin einen gewissen Schutz vermittelt. Dies war ein ��berraschender Befund, da Antik��rpern gegen den pentameren Komplex eine entscheidende Rolle bei der Neutralisation von HCMVKlin zugeschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass Antik��rper gegen andere Zielstrukturen zur Neutralisation von HCMVKlin beitragen. Hieraus resultierte unmittelbar die Frage, inwieweit eine Aufnahme des pentameren Komplexes in einen DB-basierten Impfstoff ��berhaupt notwendig war. Um dies zu beantworten war es notwendig, DB herzustellen, die den pentameren Komplex enthielten. Hierzu wurde ein HCMVLab durch Mutagenese des 235 kpb Genoms so modifiziert, dass von dem resultierenden Stamm der pentamere Komplex exprimiert wurde. In gereinigten DB dieses Stammes konnten die Komponenten des pentameren Komplexes nachgewiesen werden. Die Seren von Tieren, die mit DB dieses neuen Stammes immunisiert wurden, zeigten in der Tat eine deutlich gesteigerte Kapazit��t zur Neutralisation von HCMVKlin auf verschiedenen Zielzellen. Diese Ergebnisse unterstreichen schlussendlich, dass die Expression des pentameren Komplexes einen Vorteil bei der Induktion der antiviralen NTAk-Antwort erbringt. Zusammengefasst liefern die Erkenntnisse aus dieser Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verst��ndnis der immunogenen Wirkung von DB. Auf dieser Grundlage war es nunmehr m��glich, ein Projekt zur Austestung der DB-Vakzine in einer ersten klinischen Studie zu initiieren.

Einfluss Zelltod-inhibierender Proteine des murinen Cytomegalovirus auf die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort

Die Inhibition des programmierten Zelltods ist ein essentieller Faktor der viralen Replikationsf��higkeit. Das murine Cytomegalovirus kodiert deshalb f��r verschiedene Zelltod-inhibierende Gene, um dem programmierten Zelltod zu entgehen bis die Virusproduktion abgeschlossen ist. Da die Expression des viralen anti-apoptotischen Gens M36 infizierte Makrophagen vor der Apoptose sch��tzt (Menard et al., 2003), wurde in der vorliegenden Arbeit unter Verwendung der Deletionsmutante mCMV-��M36 (��M36) der Einfluss von Apoptose auf das Priming Epitop-spezifischer CD8 T-Zellen untersucht.rnInteressanterweise waren die Frequenzen mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen nach Infektion mit ��M36 f��r alle getesteten Epitope sowohl im Haplotyp H-2d als auch im Haplotyp H-2b deutlich erh��ht. Zus��tzlich konnte mit Hilfe der mCMV-ORF-Library eine Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoire nach Infektion mit ��M36 nachgewiesen werden, was neben der quantitativen auch eine qualitative Steigerung des CD8 T-Zell-Primings aufzeigt.rnIn der funktionellen Revertante ��M36-FADDDN wird die anti-apoptotische Funktion durch eine dominant-negative Form des zellul��ren Adapterproteins FADD (FADDDN) substituiert (Cicin-Sain et al., 2008), die das Apoptose-Signaling verhindert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von FADDDN nicht nur den Apoptose-Ph��notyp wieder revertiert, sondern auch die Verbesserung des CD8 T-Zell-Primings aufhebt. Diese Beobachtung belegt eindeutig, dass das verbesserte CD8 T-Zell-Priming auf einer verst��rkten Apoptose-Induktion beruht.Bemerkenswerterweise konnte das verbesserte Priming auch nach Deletion des anti-nekroptotischen Gens M45 nachgewiesen werden. So konnte nach Infektion mit mCMV-M45-BamX (M45-BamX) (Brune et al., 2001) gezeigt werden, dass auch die Induktion der Nekroptose zu einem verbesserten CD8 T-Zell-Priming sowie zu einer Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoires f��hrt.Nach Infektion von Cross-Priming-defizienten 3d-M��usen (Tabeta et al., 2006) konnte eine Steigerung mCMV-spezifischer CD8 T-Zell-Frequenzen in Abwesenheit von M36 oder M45 nicht beobachtet werden. Dieser Befund l��sst auf ein erh��htes Cross-Priming von CD8 T-Zellen durch ��M36 oder M45-BamX infolge einer verst��rkten Induktion des programmierten Zelltods schlie��en.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Inhibition des programmierten Zelltods durch die mCMV-Gene M36 und M45 das CD8 T-Zell-Priming limitiert. Somit f��rdern virale Zelltod-inhibierende Gene die virale Replikationsf��higkeit, indem sie die Virusproduktion per se in der individuellen Zelle steigern und zus��tzlich die Immunkontrolle reduzieren, was wiederum eine verbesserte Dissemination in vivo erm��glicht.