Preserving the B-Cell Compartment Favors Operational Tolerance in Human Renal Transplantation

Transplanted individuals in operational tolerance (OT) maintain long-term stable graft function after completely stopping immunosuppression. Understanding the mechanisms involved in OT can provide valuable information about pathways to human transplantation tolerance. Here we report that operationally tolerant individuals display quantitative and functional preservation of the B-c ell compartment in renal transplantation. OT exhibited normal numbers of circulating total B cells, naive, memory and regulatory B cells (Bregs) as well as preserved B-cell receptor repertoire, similar to healthy individuals. In addition, OT also displayed conserved capacity to activate the cluster of differentiation 40 (CD40)/signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling pathway in Bregs, in contrast, with chronic rejection. Rather than expansion or higher activation, we show that the preservation of the B-cell compartment favors OT. Online address: http://www.molmed.org doi: 10.2119/molmed.2011.00281

Maternal LAMP/p55gagHIV-1 DNA Immunization Induces In Utero Priming and a Long-Lasting Immune Response in Vaccinated Neonates

Infants born to HIV-infected mothers are at high risk of becoming infected during gestation or the breastfeeding period. A search is thus warranted for vaccine formulations that will prevent mother-to-child HIV transmission. The LAMP/gag DNA chimeric vaccine encodes the HIV-1 p55gag fused to the lysosome-associated membrane protein-1 (LAMP-1) and has been shown to enhance anti-Gag antibody (Ab) and cellular immune responses in adult and neonatal mice; such a vaccine represents a new concept in antigen presentation. In this study, we evaluated the effect of LAMP/gag DNA immunization on neonates either before conception or during pregnancy. LAMP/gag immunization of BALB/c mice before conception by the intradermal route led to the transfer of anti-Gag IgG1 Ab through the placenta and via breastfeeding. Furthermore, there were an increased percentage of CD4+ CD25+ Foxp3+ T cells in the spleens of neonates. When offspring were immunized with LAMP/gag DNA, the anti-Gag Ab response and the Gag-specific IFN-gamma-secreting cells were decreased. Inhibition of anti-Gag Ab production and cellular responses were not observed six months after immunization, indicating that maternal immunization did not interfere with the long-lasting memory response in offspring. Injection of purified IgG in conjunction with LAMP/gag DNA immunization decreased humoral and cytotoxic T-cell responses. LAMP/gag DNA immunization by intradermal injection prior to conception promoted the transfer of Ab, leading to a diminished response to Gag without interfering with the development of anti-Gag T- and B-cell memory. Finally, we assessed responses after one intravenous injection of LAMP/gag DNA during the last five days of pregnancy. The intravenous injection led to in utero immunization. In conclusion, DNA vaccine enconding LAMP-1 with Gag and other HIV-1 antigens should be considered in the development of a protective vaccine for the maternal/fetal and newborn periods.

Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites

Although the role of regulatory T cells (Tregs) during malaria infection has been studied extensively, such studies have focused exclusively on the role of Treg during the blood stage of infection; little is known about the detailed mechanisms of Tregs and sporozoite deposition in the dermis by mosquito bites. In this paper we show that sporozoites introduced into the skin by mosquito bites increase the mobility of skin Tregs and dendritic cells (DCs). We also show differences in MHC class II and/or C086 expression on skin-resident dendritic cell subtypes and macrophages. From the observed decrease of the number of APCs into draining lymph nodes, suppression of CD28 expression in conventional CD4 T cells, and a low homeostatic proliferation of skin-migrated CD4 T found in nude mice indicate that Tregs may play a fundamental role during the initial phase of malaria parasite inoculation into the mammalian host. (C) 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.

Dual effect of Lutzomyia longipalpis saliva on Leishmania braziliensis infection is mediated by distinct saliva-induced cellular recruitment into BALB/c mice ear

Abstract Background Leishmania parasites are transmitted to their vertebrate hosts by infected Phlebotomine sand flies during the blood meal of the flies. Sand fly saliva is known to enhance Leishmania spp. infection, while pre-exposure to saliva protects mice against parasitic infections. In this study, we investigated the initial inflammatory leucocyte composition induced by one or three inocula of salivary gland extract (SGE) from Lutzomyia longipalpis in the presence or absence of Leishmania braziliensis. Results We demonstrated that inoculating SGE once (SGE-1X) or three times (SGE-3X), which represented a co-inoculation or a pre-exposure to saliva, respectively, resulted in different cellular infiltrate profiles. Whereas SGE-1X led to the recruitment of all leucocytes subtypes including CD4+ T cells, CD4+CD25+ T cells, dendritic cells, macrophages and neutrophils, the immune cell profile in the SGE-3X group differed dramatically, as CD4+ T cells, CD4+CD25+ T cells, dendritic cells, macrophages and neutrophils were decreased and CD8+ T cells were increased. The SGE-1X group did not show differences in the ear lesion size; however, the SGE-1X group harbored a higher number of parasites. On the other hand, the SGE-3X group demonstrated a protective effect against parasitic disease, as the parasite burden was lower even in the earlier stages of the infection, a period in which the SGE-1X group presented with larger and more severe lesions. These effects were also reflected in the cytokine profiles of both groups. Whereas the SGE-1X group presented with a substantial increase in IL-10 production, the SGE-3X group showed an increase in IFN-�� production in the draining lymph nodes. Analysis of the inflammatory cell populations present within the ear lesions, the SGE-1X group showed an increase in CD4+FOXP3+ cells, whereas the CD4+FOXP3+ population was reduced in the SGE-3X group. Moreover, CD4+ T cells and CD8+ T cells producing IFN-�� were highly detected in the ears of the SGE-3X mice prior to infection. In addition, upon treatment of SGE-3X mice with anti-IFN-�� monoclonal antibody, we observed a decrease in the protective effect of SGE-3X against L. braziliensis infection. Conclusions These results indicate that different inocula of Lutzomyia longipalpis salivary gland extract can markedly modify the cellular immune response, which is reflected in the pattern of susceptibility or resistance to Leishmania braziliensis infection.

Liver accumulation of Plasmodium chabaudi-infected red blood cells and modulation of regulatory T Cell and dendritic cell responses

It is postulated that accumulation of malaria-infected Red Blood Cells (iRBCs) in the liver could be a parasitic escape mechanism against full destruction by the host immune system. Therefore, we evaluated the in vivo mechanism of this accumulation and its potential immunological consequences. A massive liver accumulation of P. c. chabaudi AS-iRBCs (PciRBCs) was observed by intravital microscopy along with an over expression of ICAM-1 on day 7 of the infection, as measured by qRT-PCR. Phenotypic changes were also observed in regulatory T cells (Tregs) and dendritic cells (DCs) that were isolated from infected livers, which indicate a functional role for Tregs in the regulation of the liver inflammatory immune response. In fact, the suppressive function of liver-Tregs was in vitro tested, which demonstrated the capacity of these cells to suppress naive T cell activation to the same extent as that observed for spleen-Tregs. On the other hand, it is already known that CD4+ T cells isolated from spleens of protozoan parasite-infected mice are refractory to proliferate in vivo. In our experiments, we observed a similar lack of in vitro proliferative capacity in liver CD4+ T cells that were isolated on day 7 of infection. It is also known that nitric oxide and IL-10 are partially involved in acute phase immunosuppression; we found high expression levels of IL-10 and iNOS mRNA in day 7-infected livers, which indicates a possible role for these molecules in the observed immune suppression. Taken together, these results indicate that malaria parasite accumulation within the liver could be an escape mechanism to avoid sterile immunity sponsored by a tolerogenic environment.

ATG based combination therapy - a novel clinically relevant approach to promote regulation and induce long-term allograft survival

Regulatory T cells (Treg) actively regulate alloimmune responses and promote transplantation tolerance. Polyclonal anti-thymocyte globulin (ATG), a widely used induction therapy in clinical organ transplantation, depletes peripheral T cells. However, resistance to tolerance induction is seen with certain T cell depleting strategies and is attributed to alterations in the balance of na��ve, memory and regulatory T cells. Here we report a novel reagent, murine ATG (mATG), depletes T cells but preferentially spares CD25+ natural Tregs which limit skewing of T cell repertoire toward T-effector-memory (Tem) phenotype among the recovering T cells. T-cell depletion with mATG combined with CTLA4Ig and Sirolimus synergize to prolong graft survival by tipping the Treg/Tem balance further in favor of Tregs by preserving Tregs, facilitating generation of new Tregs by a conversion mechanism and limiting Tem expansion in response to alloantigen and homeostatic proliferation. These results provide the rationale for translating such novel combination therapies to promote tolerance in primate and human organ transplantation.

I linfociti T regolatori nella patologia epatica da HCV: dall'epatite cronica al trapianto

La storia naturale dell���epatopatia HCV-relata passa dall���epatite cronica alla cirrosi ed eventualmente all���epatocarcinoma fino ad arrivare alla possibile necessit�� del trapianto di fegato. HCV non esercita citolisi diretta, pertanto i fattori immunologici giocano il duplice ruolo di determinare l���evoluzione dell���infezione e il danno epatico. All���interno del sistema immunitario esistono linfociti in grado di inibire l���attivazione delle cellule effettrici modulando la risposta immunitaria; la popolazione regolatoria meglio conosciuta �� costituita dai cosiddetti T-reg caratterizzati dal fenotipo CD4+CD35hiFoxp3+. Scopo di questo studio �� stato determinare fenotipo e funzione dei T-reg, valutandone le correlazioni con caratteristiche cliniche e parametri biochimici e virologici, nelle diverse fasi della malattia epatica da HCV, a partire dall���epatite cronica, passando per la cirrosi, l���epatocarcinoma e terminando con il follow-up post-trapianto di fegato. Sono stati reclutati 80 pazienti con infezione cronica da HCV non in trattamento antivirale, di cui 52 con epatite cronica, 12 con cirrosi e 16 con epatocarcinoma. Di questi, 11 sono andati incontro a trapianto di fegato e sono stati poi seguiti fino a 36 mesi di follow up. Ventinove soggetti avevano transaminasi persistentemente nella norma e 28 mostravano ALT costantemente oltre 2.5x i valori normali. Quaranta donatori di sangue sono stati utilizzati come controlli sani. Marcatori di superficie (CD4, CD25) ed intracellulari (Foxp3) sono stati valutati in citofluorimetria su sangue intero periferico per tutti i soggetti al basale ed ogni 2-4 settimane dopo trapianto. In una quota di pazienti i T-reg sono stati estratti dai linfociti del sangue periferico con metodi immunomagnetici e la loro funzione valutata come percentuale di inibizione di proliferazione e produzione di IFN-�� da parte delle cellule bersaglio CD4+CD25- in esperimenti di co-coltura effettuati al basale e dopo 24-36 settimane dal trapianto. La percentuale di T-reg e l���espressione del Foxp3 sono risultate aumentate nei soggetti con HCV rispetto ai controlli sani, in particolare in coloro con cirrosi, HCC e nei pazienti con transaminasi normali indipendentemente dallo stadio di malattia, correlando inversamente con i livelli di transaminasi e direttamente con il punteggio MELD. La produzione di IFN-�� �� incrementata in tutti i pazienti HCV ma efficacemente controllata solamente dai T-reg dei pazienti con transaminasi normali. Dopo il trapianto di fegato, si verifica una precoce e reversibile riduzione delle T-reg circolanti. Alla 24ma e 36ma settimana dal trapianto la percentuale dei T-reg circolanti �� sovrapponibile al basale e i loro effetti, sia in termini di proliferazione che di produzione di IFN-��, sulle cellule bersaglio, gi�� dotate di una ridotta attivit�� intrinseca, appaiono particolarmente incisivi. In conclusione, l���epatopatia cronica da HCV �� caratterizzata da una popolazione di T-reg espansa che per��, con l���eccezione dei soggetti con transaminasi normali, non appare in grado di limitare il danno epatico immuno-mediato e potrebbe favorire lo sviluppo e la crescita di lesioni tumorali nei pazienti con malattia avanzata. Il trapianto di fegato, probabilmente a causa della terapia immunosoppressiva, si associa ad un marcato e transitorio declino dei T-reg le cui numerosit�� e funzione vengono completamente recuperate a sei mesi dall���intervento. La migliore conoscenza dei meccanismi alla base delle cinetica e della funzione delle cellule regolatorie potr�� fornire utili strumenti per il loro utilizzo come adiuvanti nella terapia dell���epatopatia cronica HCV relata.

Charakterisierung verschiedener Reifungsstadien humaner dendritischer Zellen und ihr Einfluss auf die T-Zelldifferenzierung

Diese Zusammenfassung der kumulativen Habilitationsschrift bezieht sich auf folgende Originalarbeiten:

Nuovi meccanismi di regolazione dell'autoimmunit�� nella piastrinopenia immune

La Piastinopenia Immune (PTI) �� una patologia autoimmune ad eziologia ignota caratterizzata da piastrinopenia. I linfociti T regolatori (Tregs) sono coinvolti nei meccanismi di tolleranza immunologica e agiscono regolando l���attivit�� delle cellule T autoreattive e delle cellule dendritiche (DCs). Viceversa, le DCs, che esprimono Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), partecipano al mantenimento della tolleranza agli auto-antigeni attraverso l���espansione dei Tregs. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che i linfociti T helper 17 (Th17) sono coinvolti nell���autoimmunit�� e che l���espressione di Interleuchina (IL)-17 �� associata a numerose patologie autoimmuni. Il ruolo dell���interazione fra DCs e Tregs ed il ruolo dei Th17 nella patogenesi della PTI non sono mai stati studiati in maniera approfondita. Gli obiettivi principali di questa tesi sono stati: a) caratterizzare fenotipicamente e funzionalmente i linfociti Tregs e DCs; b) valutare il ruolo patogenetico dell���interazione tra Tregs e DCs; c) quantificare i Th17 circolanti. I risultati dimostrano che: 1) il numero dei Tregs circolanti dei pazienti, identificati tramite i marcatori Foxp3 e CD127, �� significativamente ridotto rispetto alla controparte normale; 2) la conversione in vitro delle cellule CD4+CD25- in linfociti Tregs (CD4+CD25+Foxp3+) dopo stimolazione con DCs mature �� significativamente ridotta nei pazienti rispetto ai controlli; 3) sia l���espressione dell���enzima IDO nelle DCs mature (mRNA) che i livelli di chinurenine prodotte (indice di attivit�� enzimatica) sono risultati significativamente ridotti nei pazienti rispetto alla controparte normale. Questi risultati suggeriscono quindi che il ridotto numero dei Tregs circolanti nei pazienti con PTI pu�� essere, almeno in parte, attribuito alla scarsa capacit�� di conversione delle DCs, in quanto tali cellule esprimono meno IDO. I risultati dimostrano inoltre che: 1) i Tregs dei pazienti con PTI hanno una capacit�� soppressoria che �� significativamente inferiore rispetto ai soggetti normali; tale dato �� stato confermato dal dosaggio di IFN-��� nel surnatante della coltura; 2) i Tregs di pazienti con PTI non sono in grado di inibire la maturazione delle DCs, a differenza di quanto avviene nei soggetti sani: infatti, l���espressione delle molecole costimolatorie CD80 e CD86 sulle DCs �� risultata invariata in seguito a cocoltura con DCs immature; 3) il dosaggio delle citochine nel surnatante delle cocolture dimostra che la concentrazione di IL-10 e IL-6 �� significativamente ridotta nei pazienti rispetto ai controlli. La scarsa abilit�� dei Tregs di inibire la maturazione delle DCs e l���alterato pattern di secrezione di citochine potrebbero quindi contribuire all��� insorgenza del fenotipo pi�� maturo delle DCs nei pazienti con PTI. I linfociti Th17 circolanti di pazienti e controlli sono stati identificati in citofluorimetria come cellule CD4+CD161+CD196+. Da tale analisi �� emerso che la frequenza dei Th17 circolanti non �� significativamente diversa nei due gruppi. Questi dati dimostrano quindi che nella PTI l���interazione bidirezionale tra Tregs e DCs risulta alterata e svolge un ruolo patogenetico, in quanto, da un lato, ci sono Tregs con un deficit numerico e funzionale e, dall���altro, DCs con maggiore capacit�� immunogenica. Il numero dei Th17 non risulta invece alterato.

Die Rolle regulatorischer T-Zellen im experimentellen allergischen Asthma

Im ersten Teil der Dissertation wurde in einem experimentellen Asthmamodell demonstriert, dass die Signaltransduktion ��ber IL-6 das Gleichgewicht zwischen Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen durch verschiedene Rezeptorkomponenten kontrolliert. Hierbei zeigte sich, dass speziell das IL-6 Trans-Signaling ��ber den sIL-6R die TH2 Cytokinproduktion steuert. Dagegen f��hrt die Blockade des mIL-6R zur Expansion regulatorischer T-Zellen mit suppressiven Eigenschaften. Diese CD4+CD25+ Tregs induzieren au��erdem IFN gamma produzierende CD4+ T-Zellen in der Lunge und verbessern daneben die AHR. Im ��berblick konnte in der vorliegenden Dissertation demonstriert werden, dass IL-6 die Balance zwischen der Funktion von Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen in der Lunge ��ber unterschiedliche Wege kontrolliert, dem sIL-6R und dem mIL-6R. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die lokale Blockade der IL-2R alpha- und IL-2R beta-Kette untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass die Blockade der IL-2R beta-Kette zur Verbesserung der AHR als auch der Rekrutierung eosinophiler Granulozyten in den Atemwegen f��hrt. Beide Blockaden f��hren zur Reduktion der TH2 Cytokine IL-4 und IL-5, wohingegen IL-13 nur nach Blockade der IL-2R beta-Kette vermindert sezerniert wird. In diesem Zusammenhang wurde auch die Rolle CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen untersucht, wobei eine Induktion dieser Population in den Lymphknoten nach Blockade der IL-2R beta-Kette nachgewiesen werden konnte. Die Blockade der IL-2R beta-Kette wirkt sich positiv auf experimentelle Asthmastudien aus und stellt somit ein m��gliches therapeutisches Potential dar, erfordert aber teilweise noch weitere Untersuchungen.

Induktion regulatorischer T-Zellen zur Inhibition allergenspezifischer Immunantworten im Mausmodell der Typ I-Allergie

Die Induktion regulatorischer T-Zellen (Treg) spielt im Zusammenhang mit der Kontrolle allergenspezifischer Reaktionen, insbesondere auch im Rahmen einer erfolgreichen Hyposensibilisierung mit hohen Allergendosen, eine zentrale Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Rekrutierung allergenspezifischer Treg daher in einem Mausmodell untersucht, in dem analog zur spezifischen Immuntherapie (SIT) die repetitive Verabreichung von hohen Antigendosen einen IgE-spezifischen Suppressionsmechanismus aktiviert, w��hrend die Injektion niedriger Antigendosen eine potente IgE-Antwort induziert. Th1-Zellen sowie konventionelle CD4+CD25+ oder CD8+CD28- Treg konnten als Vermittlerpopulationen des suppressiven Effektes in hochdosig immunisierten M��usen ausgeschlossen werden. Mittels Transferexperimenten wurden erstmals CD4-CD8- doppelt negative Treg als eine die IgE-Suppression vermittelnde Zellpopulation identifiziert. Desweiteren wurden DNA-Transferexperimente durchgef��hrt, mit dem Ziel, adaptive Treg zum Zwecke der Inhibition allergenspezifischer Immunreaktionen zu induzieren. Dazu wurden IL-10- bzw. TGF-��-kodierende Plasmide (pCMV-IL-10, pCMV-TGF-��) hergestellt und in Kombination mit einem Plasmid, welches das Modellallergen ��-Galaktosidase (��Gal) unter der Kontrolle des DC-spezifischen Fascin-Promotors (pFascin-��Gal) kodierte, M��usen mit der Genpistole appliziert. Die Expression des Modellallergens in Verbindung mit der konstitutiven Produktion von immunsuppressiven Zytokinen sollte bei den mit den transfizierten DC interagierenden antigenspezifischen T-Zellen zu einer verst��rkten Differenzierung von Treg f��hren. Die Experimente zeigten, dass die Koapplikation von IL-10-kodierenden Plasmiden eine Immunsuppression induziert, die sich in einer verminderten antigenspezifischen Antik��rperproduktion, Zytokinproduktion und CTL-Induktion zeigt, die jedoch bei nachfolgender Sensibilisierung mit ��Gal-Protein nicht aufrechterhalten werden kann. Dahingegen f��hrte die Koapplikation von TGF-��-kodierenden Plasmiden verbunden mit einer nachfolgenden Sensibilisierung zu einer leichten Inhibition der IgG1- und IgG2a-Produktion verglichen mit der Vakzinierung mit pFascin-��Gal allein. Dieser inhibitorische Effekt von pCMV-TGF-�� wurde interessanterweise nicht bereits nach der DNA-Immunisierung, sondern erst nach Sensibilisierung mit dem Protein beobachtet.

Generierung und Charakterisierung tolerogener muriner dendritischer Zellen

Mechanismen der zentralen und der peripheren Toleranz sch��tzen den K��rper vor Immunreaktionen gegen k��rpereigenes Gewebe oder gegen harmlose Umweltantigene. An der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz sind tolerogene Dendritische Zellen (DC) beteiligt. Tolerogene DC k��nnen in vitro u.a. mit Hilfe von immunsuppressiven und antiinflammatorischen Substanzen, aber auch durch virale Transduktionen, die zur Denovo- oder ��berexpression toleranzassoziierter Molek��le f��hren, generiert werden. rnDa die Wirkung einiger immunmodulatorischer Substanzen ��ber den intrazellul��ren sekund��ren Botenstoff cAMP vermittelt wird, sollte getestet werden, welchen Einfluss eine direkte Erh��hung des intrazellul��ren cAMP-Niveaus mittels Dibutyryl-cyclo-Adenosin-3��,5��-Mono-Phoshat (db-cAMP) auf die ph��notypischen und funktionellen Eigenschaften von BM-DC (���bone marrow derived dendritic cells���) hat.rnIm Vergleich zu unbehandelten BM-DC wiesen db-cAMP-DC ein vermindertes T-Zell-Stimulierungs-potenzial auf. Dieses verminderte T-Zell-Stimulierungspotenzial wird teilweise ��ber die Proteinkinase A, nicht aber ��ber Cyclooxygenase-2 (Cox-2) vermittelt. rnAnhand der FACS-Analyse mit DC- und MDSC- (���myeloid derived suppressor cells���) spezifischen Markern konnte gezeigt werden, dass es sich bei den db-cAMP-DC um CD11c-positive DC mit einer vergleichsweise niedrigen Expression von MHCII und kostimulatorischen Oberfl��chenmolek��len handelt. Des Weiteren zeigte sich, dass sie verglichen mit BM-DC eine vermehrte mRNA-Expression der koinhibitorischen Molek��le B7-H1 und LIGHT und der toleranzassoziierten Molek��le Fc��RIIB, HO-1 und Cox-2 aufweisen. Mittels ELISA konnte eine gesteigerte Expression der HO-1- und eine moderat gesteigerte PGE2-Synthese beobachtet werden. PGE2 wird mit Hilfe der Cox-2 aus Arachidons��ure gebildet.rnIm Gegensatz zu BM-DC wiesen db-cAMP-DC in beiden Reifungsstadien ein ver��ndertes Zytokinprofil auf: Auf mRNA-Ebene zeigte sich, dass db-cAMP-DC verglichen mit BM-DC vermehrt IL-1RA und IL-10 exprimieren. Dieser Unterschied konnte f��r IL-10 auch mittels ELISA best��tigt werden. In den Kultur��berst��nden der stimulierten db-cAMP-DC konnte, im Gegensatz zu denen stimulierter BM-DC, kaum bioaktives IL-12 nachgewiesen werden. rnDb-cAMP-DC induzierten des Weiteren in kokultivierten allogenen T-Zellen ein differenzielles Zytokinprofil: Sie f��rderten die INF��- und IL-17-Sezernierung durch T-Zellen, w��hrend die IL-5-Sezernierung geringer war, wenn T-Zellen mit stimulierten db-cAMP-DC kokultiviert wurden. Db-cAMP-DC hatten hingegen keinen Einfluss auf die IL-10-Produktion. Au��erdem f��hrte eine Kokultur der db-cAMP-DC mit allogenen T-Zellen nicht zu einer gesteigerten Induktion von FoxP3+ Treg. rnIn einem zweiten Ansatz sollte getestet werden ob es m��glich ist die murine DC-Linie SP37A3 lentiviral mit dem toleranzassoziierten Oberfl��chenprotein B7-H3 zu transduzieren. Dies ist von Interesse, da die SP37A3-Zellen einige Vorteile gegen��ber BM-DC aufweisen, wie z.B. ihren homogeneren Ph��notyp und die M��glichkeit sie in einer Expansionskultur zu halten.rnEs konnte gezeigt werden, dass SP37A3-Zellen als Modell f��r myeloide DC f��r die Transduktion mit lentiviralen Partikeln geeignet sind. Hierbei zeigte es sich aber, dass darauf geachtet werden muss, mit konzentriertem Virus zu arbeiten und dass die Reportergen-Expression der Zielzellen ��ber mehr als 3 Tage (mindestens 7 Tage) untersucht werden muss. Nur so kann eine eventuell auftretende Pseudotransduktion erkannt und verhindert werden. Ab einer MOI (���multiplicity of infection���) von 50 konnte in SP37A3-Zellen eine Transgen-Expression nachgewiesen werden.rn

Evaluation eines humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentz��ndung

Aus der zunehmenden Pr��valenz allergischer Erkrankungen vor allem in den Industrienationen ergibt sich ein erh��hter Bedarf an Grundlagenforschung im Bereich von Allergie und Asthma sowie der Entwicklung innovativer Therapiestrategien. In der vorliegenden Dissertation wurden die immundefizienten Mausst��mme NOD-Scid und NOD-Scid gc als vielversprechender translationaler Schritt zwischen dem reinen Tiermodell und der Erprobung neuer Therapieans��tze an Probanden in klinischen Studien beleuchtet. Im experimentellen Verlauf der Arbeit wurde ein humanisiertes Mausmodell der allergischen Atemwegsentz��ndung zun��chst in immundefizienten NOD-Scid und darauffolgend in NOD-Scid gc M��usen etabliert. Diese Mausst��mme zeichnen sich durch das Nichtvorhandensein von B- und T-Zellen aus. Im NOD-Scid gc Stamm resultiert aus einer zus��tzlichen Mutation des Gens f��r die gamma-Kette des IL-2 Rezeptors der Verlust von nat��rlichen Killerzellen (NK-Zellen), was die Immunit��t in diesem Stamm weiter herabsetzt und eine Humanisierung erleichtert. Die Humanisierung der M��use erfolgte durch die intraperitoneale Injektion von mononukle��ren Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die unter Anwendung der Ficoll-Dichtezentrifugation aus dem Blut von Probanden isoliert wurden. F��r die Gewinnung der PBMCs wurden zum einen Asthma-Patienten mit einer hochgradigen Sensibilisierung gegen Birkenpollen herangezogen. Zum anderen wurden in Kontrollexperimenten PBMCs nicht-allergischer Probanden verwendet. W��hrend sich f��r den NOD-Scid Stamm 80 Millionen PBMCs als angemessene Transferzahl erwiesen, reichten f��r die Rekonstitution des NOD-Scid gc Stammes 5 Millionen PBMCs aus. Eine Analyse der Tiere erfolgte 24 Tage nach Injektion der humanen Zellen. Der Transfer der PBMCs allergischer Asthmatiker f��hrte besonders nach additiver Applikation des Birkenallergens sowie des humanen rekombinanten Zytokins IL-4 und darauffolgender nasaler allergener Provokation zu einer starken pulmonalen Entz��ndung in den M��usen. Die nasale Allergenprovokation an den Tagen 20-22 nach PBMC-Transfer erwies sich f��r das Aufkommen der Inflammation als unbedingt erforderlich. Die nasale Provokation mit Phosphat-gepufferter Salzl��sung (PBS) m��ndete in einer herabgesetzten Inflammation ohne Auspr��gung einer Atemwegs��berempfindlichkeit (AHR), reduzierten Zellzahlen in der bronchoalveol��ren Lavage (BAL) sowie verminderten Frequenzen humaner Zellen in den Lungen von Versuchstieren, die mit atopischen PBMCs supplementiert mit Birkenallergen und IL-4 rekonstituiert wurden. Die Allergenabh��ngigkeit des etablierten Modells wurde anhand von Experimenten untermauert, die verdeutlichten, dass ein Transfer von PBMCs nicht-allergischer Probanden trotz Zugabe des Allergens und humanem IL-4 keine Atemwegsinflammation ausl��ste. Bei den humanen Zellen, die an Tag 24 nach Rekonstitution in den M��usen detektiert werden konnten, handelte es sich haupts��chlich um T-Zellen. Innerhalb dieser CD3+ T-Zellen konnten CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert werden. Depletionsexperimente, in denen nach Gewinnung der PBMCs aus dem Blut der Probanden verschiedene T-Zellsubpopulationen (CD3+, CD4+, CD8+) eliminiert wurden, f��hrten zu dem Befund, dass die allergische Atemwegsentz��ndung in dem System von humanen CD4+ T-Zellen abh��ngig war. Nach der Etablierung des humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentz��ndung wurde das System zur Analyse des suppressionsf��rdernden Potentials des HIV-1 - H��llproteins gp120 genutzt. Die Applikation von gp120 f��hrte zu einer Reduktion der Atemwegsinflammation. Dies ��u��erte sich in einer Aufhebung der AHR, verminderten Zellzahlen in der BAL sowie dem reduzierten Einstrom humaner T-Zellen in die Lungen der rekonstituierten Tiere. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die anti-inflammatorische Wirkung des gp120 strikt von der Anwesenheit regulatorischer T-Zellen (Tregs) innerhalb der f��r die Humanisierung genutzten PBMCs abh��ngig war. Eine Depletion der Tregs vor Transfer in die M��use f��hrte zum Verlust der anti-inflammatorischen Effekte des gp120. Diese Ergebnisse sprechen f��r die Modulation regulatorischer T-Zellen als hoffnungsvolle Ma��nahme in der Behandlung allergischer Erkrankungen. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse er��ffnen innovative Ans��tze zur Analyse neuer Therapiestrategien in einem Testsystem, dass die Erforschung humaner Zellinteraktionen sowie die Wirkung potentieller Arzneistoffe auf humane Zellen unter in vivo Bedingungen erlaubt.

Funktionelle Charakterisierung der Casein Kinase 2 in der Etablierung und Aufrechterhaltung peripherer Toleranz durch dendritische Zellen

Dendritische Zellen (DCs) nehmen eine Schl��sselrolle in unserem Immunsystem ein, indem DCs sowohl Immunit��t, als auch Toleranz induzieren k��nnen. Im Falle der Immunit��t sind DCs in der Lage die Differenzierung der verschiedenen T-Helferzellen, wie Th1-, Th2- und Th17-Zellen zu steuern und tragen so zu der Qualit��t einer Immunantwort bei. Auf der anderen Seite k��nnen DCs in Gegenwart von TGF-��, IDO und Retins��ure die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen induzieren und tragen somit zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz bei. Insbesondere in den Darm-assoziierten lymphatischen Geweben (GALT) m��ssen DCs unverh��ltnism����ige Immunantworten gegen harmlose Antigene aus der Nahrung und kommensale Bakterien verhindern, w��hrend gegen Pathogene sch��tzende Immunantworten induziert werden m��ssen. Auf Grund dieser entgegengesetzten Funktionen der DCs wollten wir die molekularen Mechanismen der DCs untersuchen, die der Regulation von Immunit��t und Toleranz zu Grunde liegen. Insbesondere der Wnt-Signalweg ist f��r die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz im GALT von Bedeutung. Da die Casein Kinase 2 in diesem Signalweg entscheidend beteiligt ist, haben wir die CK2-Funktion konditionell, unter der Kontrolle des CD11c-Promotors, deletiert. Hierf��r haben wir CD11c-cre M��use mit M��usen verpaart, welche ein von loxP-Signalsequenzen flankiertes Ck2�� Gen (CK2��-fl/fl) tragen. Die konditionelle Deletion der CK2-Funktion in DCs, f��hrte zu einer verst��rkten Expression der kostimulatorischen Molek��le (wie CD40, CD80, CD86) und der Zytokine IL-6 und IL-12 unter ���steady-state��� Bedingungen. Detaillierte Untersuchungen der T-Zellen in CD11c-cre x CK2��-fl/fl M��usen zeigte eine deutlich reduzierte naive T-Zellpopulation, einhergehend mit einer erh��hten Th1- und Th17-Differenzierung. Speziell in den mesenterialen Lymphknoten konnte eine h��here Frequenz von T-bet+ und Ror��t+ CD4+ T-Zellen gefunden werden, welche gro��e Mengen der Zytokine IFN-�� und IL-17 nach ex vivo Stimulation produzierten. Weiterf��hrende in vivo Versuche, hier wurde das Modell der oralen Toleranz gew��hlt, zeigten das eine CK2-Deletion in DCs die Induktion einer oralen Toleranz verhindert. Unsere Daten zeigen eindeutig, dass die CK2 entscheidend in der Regulation der DC Hom��ostase und der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz beteiligt ist.

Regulatory T cell-mediated suppression of Th9 cell development and effector function

T helper (Th) 9 cells are an important subpopulation of the CD4+ T helper cells. Due to their ability to secrete Interleukin-(IL-)9, Th9 cells essentially contribute to the expulsion of parasitic helminths from the intestinal tract but they play also an immunopathological role in the course of asthma. Recently, a beneficial function of Th9 cells in anti-tumor immune responses was published. In a murine melanoma tumor model Th9 cells were shown to enhance the anti-melanoma immune response via the recruitment of CD8+ T cells, dendritic cells and mast cells. In contrast to Th9 effector cells regulatory T cells (Tregs) are able to control an immune response with the aid of different suppressive mechanisms. Based on their ability to suppress an immune response Tregs are believed to be beneficial in asthma by diminishing excessive allergic reactions. However, concerning cancer they can have a detrimental function because Tregs inhibit an effective anti-tumor immune reaction. Thus, the analysis of Th9 suppression by Tregs is of central importance concerning the development of therapeutic strategies for the treatment of cancer and allergic diseases and was therefore the main objective of this PhD thesis.rnIn general it could be demonstrated that the development of Th9 cells can be inhibited by Tregs in vitro. The production of the lineage-specific cytokine IL-9 by developing Th9 cells was completely suppressed at a Treg/Th9 ratio of 1:1 on the transcriptional (qRT-PCR) as well as on the translational level (ELISA). In contrast, the expression of IRF4 that was found to strongly promote Th9 development was not reduced in the presence of Tregs, suggesting that IRF4 requires additional transcription factors to induce the differentiation of Th9 cells. In order to identify such factors, which regulate Th9 development and therefore represent potential targets for Treg-mediated suppressive mechanisms, a transcriptome analysis using ���next-generation sequencing��� was performed. The expression of some genes which were found to be up- or downregulated in Th9 cells in the presence of Tregs was validated with qRT-PCR. Time limitations prevented a detailed functional analysis of these candidate genes. Nevertheless, the analysis of the suppressive mechanisms revealed that Tregs probably suppress Th9 cells via the increase of the intracellular cAMP concentration. In contrast, IL-9 production by differentiated Th9 cells was only marginally affected by Tregs in vitro and in vivo analysis (asthma, melanoma model). Hence, Tregs represent very effective inhibitors of Th9 development whereas they have only a minimal suppressive influence on differentiated Th9 cells.rn