Isolierung, Charakterisierung und Nachweis methanogener Archaea aus laufenden Praxis-NawaRo-Biogasanlagen unter besonderer Beruecksichtigung der Gattung Methanobacterium

Im Verlauf der Forschungsarbeit wurden Proben aus fünf, mit nachwachsenden Rohstoffen (NawaRo) beschickten, landwirtschaftlichen Biogasanlagen (BGA) auf die Biozönose methanogener Archaea hin molekularbiologisch untersucht. Über „amplified rDNA restriction analysis“-Screening (ARDRA) von Bibliotheken auf Basis von 16S rRNA-Genfragmenten konnte anhand zweier beispielhafter BGA das Vorkommen von Vertretern der Gattungen Methanoculleus (Mcu.), Methanobacterium (Mb.), Methanosarcina (Msc.) und Methanosaeta (Mst.) nachgewiesen werden. Mittels denaturierender Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) wurde das Vorkommen dieser Mikroorganismen auch in den übrigen Anlagen gezeigt. Ergänzend dazu wurde in drei Anlagen Methanospirillum hungatei nachgewiesen. Nach Ausarbeitung gattungsspezifischer Isolierungsstrategien konnten insgesamt zehn Vertreter der Gattung Methanobacterium (Isolate Mb1 bis Mb10) und jeweils ein Vertreter der Gattungen Methanoculleus (Isolat Mcu(1)), Methanosarcina (Isolat NieKK) und Methanosaeta (Isolat Mst1.3) aus den BGA-Proben isoliert werden. Durch in silico-Abgleich der partiellen 16S rRNA-Gensequenzen wurden diese als Verwandte von Mb. formicicum MFT, Mcu. bourgensis MS2T, Msc. mazei S-6T und Mst. concilii FE mit einer Sequenzidentität > 97% identifiziert. Im Laufe weiterer molekularbiologischer Untersuchungen mittels DGGE und ARDRA-Analyse konnten die Isolate den Referenzstämmen zugeordnet werden. In Bezug auf die Gattung Methanobacterium ergaben sich jedoch leichte Abweichungen. Diese bestätigten sich in vergleichenden Analysen des genomischen Fingerabdrucks in der „specifically amplified polymorphic DNA“-PCR (SAPD-PCR), welche im Rahmen dieser Arbeit erstmalig erfolgreich auf archaeelle Organismen angewandt wurde. Hier zeigten die Isolate zwei von den Fingerabdrücken der untersuchten Referenzstämme verschiedene Hauptamplifikationsmuster. Aufgrund der Vielzahl der Isolate sowie dem signifikanten Vorkommen in qPCR-Analysen und Klonbibliotheken fokussierten sich die weiteren Arbeiten zur genauen Untersuchung dieser Abweichungen auf phylogenetische Analysen der Gattung Methanobacterium und die Entwicklung von Nachweissystemen. Die Aufklärung eines Großteils der 23S rRNA-Gensequenzen der Isolate und von ausgewählten Typstämmen ermöglichte ergänzende phylogenetische Untersuchungen zu durchgeführten 16S rRNA-Analysen. Dabei wurden die Isolate jeweils in einem eigenen Cluster abseits der meisten Referenzstämme aus der Gattung Methanobacterium positioniert. Analog zur Musterbildung im Rahmen der SAPD-Analyse zeigte sich eine Differenzierung in zwei Äste und ergab in Übereinstimmung mit den in silico-Sequenzabgleichen den höchsten Verwandtschaftsgrad mit Mb. formicicum MFT. Die Eignung der SAPD-PCR zur Ableitung spezifischer Primerpaare konnte erstmals auch für methanogene Archaea gezeigt werden. Die Ableitung zweier Primerpaare mit Spezifität für die Methanobacterium-Isolate Mb1 bis Mb10 sowie für den Typstamm Mb. formicicum MFT gelang und konnte im Rahmen eines Direkt-PCR-Nachweises erfolgreich auf Reinkulturen und Fermenterproben angewandt werden. Unter Einbezug der sequenzierten 23S rRNA-Genfragmente gelang die Erstellung von Oligonukleotid-Sonden für den Einsatz in Fluoreszenz in situ-Hybridisierungsexperimenten. Im Praxistest ergab sich für diese Sonden eine Spezifität für alle getesteten Vertreter der Gattung Methanobacterium sowie für Methanosphaera stadtmanae MCB-3T und Methanobrevibacter smithii PST.rnSomit konnten im Laufe der Arbeit die dominanten methanogenen Archaea in NawaRo-BGA in mehrphasigen Experimenten nachgewiesen, quantifiziert und auf nur wenige Gattungen eingegrenzt werden. Vertreter der vier dominanten Gattungen wurden isoliert und Nachweissysteme für Arten der Gattung Methanobacterium erstellt.rn

From defined polymer architectures to structure-property relationships in vivo

Makromolekulare Wirkstoffträgersysteme sind von starkem Interesse bezüglich der klinischen Anwendung chemotherapeutischer Agenzien. Um ihr klinisches Potential zu untersuchen ist es von besonderer Bedeutung das pharmakokinetische Profil in vivo zu bestimmen. Jede Veränderung der Polymerstruktur beeinflusst die Körperverteilung des entsprechenden Makromoleküls. Aufgrund dessen benötigt man detailliertes Wissen über Struktur-Eigenschaftsbeziehungen im lebenden Organismus, um das Nanocarrier System für zukünftige Anwendungen einzustellen. In dieser Beziehung stellt das präklinische Screening mittels radioaktiver Markierung und Positronen-Emissions-Tomographie eine nützliche Methode für schnelle sowie quantitative Beobachtung von Wirkstoffträgerkandidaten dar. Insbesondere poly(HPMA) und PEG sind im Arbeitsgebiet Polymer-basierter Therapeutika stark verbreitet und von ihnen abgeleitete Strukturen könnten neue Generationen in diesem Forschungsbereich bieten.rnDie vorliegende Arbeit beschreibt die erfolgreiche Synthese verschiedener HPMA und PEG basierter Polymer-Architekturen – Homopolymere, Statistische und Block copolymere – die mittels RAFT und Reaktivesterchemie durchgeführt wurde. Des Weiteren wurden die genannten Polymere mit Fluor-18 und Iod-131 radioaktiv markiert und mit Hilfe von microPET und ex vivo Biodistributionsstudien in tumortragenden Ratten biologisch evaluiert. Die Variation in Polymer-Architektur und darauffolgende Analyse in vivo resultierte in wichtige Schlussfolgerungen. Das hydrophile / lipophile Gleichgewicht hatte einen bedeutenden Einfluss auf das pharmakokinetische Profil, mit besten in vivo Eigenschaften (geringe Aufnahme in Leber und Milz sowie verlängerte Blutzirkulationszeit) für statistische HPMA-LMA copolymere mit steigendem hydrophoben Anteil. Außerdem zeigten Langzeitstudien mit Iod-131 eine verstärkte Retention von hochmolekularen, HPMA basierten statistischen Copolymeren im Tumorgewebe. Diese Beobachtung bestätigte den bekannten EPR-Effekt. Hinzukommend stellen Überstrukturbildung und damit Polymergröße Schlüsselfaktoren für effizientes Tumor-Targeting dar, da Polymerstrukturen über 200 nm in Durchmesser schnell vom MPS erkannt und vom Blutkreislauf eliminiert werden. Aufgrund dessen wurden die hier synthetisierten HPMA Block copolymere mit PEG Seitengruppen chemisch modifiziert, um eine Verminderung in Größe sowie eine Reduktion in Blutausscheidung zu induzieren. Dieser Ansatz führte zu einer erhöhten Tumoranreicherung im Walker 256 Karzinom Modell. Generell wird die Körperverteilung von HPMA und PEG basierten Polymeren stark durch die Polymer-Architektur sowie das Molekulargewicht beeinflusst. Außerdem hängt ihre Effizienz hinsichtlich Tumorbehandlung deutlich von den individuellen Charakteristika des einzelnen Tumors ab. Aufgrund dieser Beobachtungen betont die hier vorgestellte Dissertation die Notwendigkeit einer detaillierten Polymer-Charakterisierung, kombiniert mit präklinischem Screening, um polymere Wirkstoffträgersysteme für individualisierte Patienten-Therapie in der Zukunft maßzuschneidern.rn

TBX3-Mutationsanalysen und Konstruktion einer Zelllinie für TBX2-Inhibitorscreenings

Die nahe verwandten T-box Transkriptionsfaktoren TBX2 und TBX3 werden in zahlreichen humanen Krebsarten überexprimiert, insbesondere in Brustkrebs und Melanomen. Die Überexpression von TBX2 und TBX3 hat verschiedene zelluläre Effekte, darunter die Unterdrückung der Seneszenz, die Förderung der Epithelialen-Mesenchymalen Transition sowie invasive Zellmotilität. Im Gegensatz dazu führt ein Funktionsverlust von TBX3 und der meisten anderen humanen T-box-Gene zu haploinsuffizienten Entwicklungsdefekten. Durch Sequenzierung des Exoms von Brustkrebsproben identifizierten Stephens et al. fünf verschiedene Mutationen in TBX3, welche allesamt die DNA-bindende T-box-Domäne betrafen. Die In-Frame-Deletion N212delN wurde zweimal gefunden. Aus der Anhäufung der Mutationen innerhalb der T-box-Domäne wurde geschlossen, dass TBX3 bei Brustkrebs ein Treibergen ist. Da Mutationen innerhalb der T-box-Domäne im Allgemeinen zu einem Funktionsverlust führen, aber die onkogene Aktivität von TBX3 meist auf eine Überexpression zurückzuführen ist, wurden die potentiellen Treibermutationen hinsichtlich einer verminderten oder gesteigerten TBX3-Funktion geprüft. Getestet wurden zwei In-Frame Deletionen, eine Missense- sowie eine Frameshift-Mutante bezüglich der DNA-Bindung in vitro und der Zielgen-Repression in Zellkultur. Zusätzlich wurde eine in silico Analyse der im The Cancer Genome Atlas (TCGA) gelisteten somatischen TBX-Brustkrebsmutationen durchgeführt. Sowohl die experimentelle als auch die in silico Analyse zeigten, dass die untersuchten Mutationen vorwiegend zum Verlust der TBX3-Funktion führen. Um den Mechanismus der Genrepression durch TBX3 besser zu verstehen, wurden weitere TBX3-Mutanten bezüglich ihrer Wirkung auf die p21-Promotoraktivität (p21-Luc-Reporter und endogene p21-Expression) analysiert. Wildtypische p21-Luc-Repression zeigten die zwei Mutationen S674A (Phosphorylierung) und D275K (SUMOylierung), welche posttranslationale Modifikationen verhindern, sowie die Interaktion mit dem Tumorsuppressor Rb1 unterbindende M302A/V304A-Mutation. Erstaunlicherweise war die endogene p21-Repression dieser Mutanten stärker als die des wildtypischen TBX3-Proteins. Alle drei Mutationen führten zu einer Stabilisierung des TBX3-Proteins. Die ursprünglich in Patienten mit Ulna-Mamma Syndrom identifizierte, DNA-bindungsdefekte Y149S-Mutante konnte weder p21-Luc noch endogenes p21 reprimieren. Mutationen in potentiellen Interaktionsdomänen für die Bindung der Co-Repressoren Groucho und C-terminalem Bindeprotein zeigten sowohl auf p21-Luc als auch auf endogenes p21-Gen wildtypische Repressoraktivität, so dass diese Co-Repressoren in COS-7-Zellen wahrscheinlich nicht an der Repression dieses Gens beteiligt sind. Da TBX2 und TBX3 interessante Ziele zur direkten Krebsbekämpfung darstellen, sollte ein zelluläres Reportersystem zur Identifikation TBX2-inhibierender, pharmakologisch aktiver Substanzen etabliert werden. Dazu sollte eine stabile Zelllinie mit vom p21-Promotor reguliertem d2EGFP-Reporter und Doxyzyklin-induzierbarem TBX2-Protein erzeugt werden, da ektopische Expression von TBX2 genetische Instabilität und Toxizität induzieren kann. In dieser Zelllinie sollte die TBX2-Expression zur Reduktion der d2EGFP-Fluoreszenz führen. Zur Erzeugung der Zelllinie wurden die folgenden drei Konstrukte Schritt-für-Schritt stabil in das Genom der Zielzelllinie COS-7 integriert: pEF1alpha-Tet3G, pTRE3G-TBX2 und p21-d2EGFP. Während die Herstellung der doppelt stabilen COS-7-Zelllinie gelang, scheiterte die Herstellung der dreifach stabilen Zelllinie.

Genome-wide association study in German patients with attention deficit/hyperactivity disorder

The heritability of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is approximately 0.8. Despite several larger scale attempts, genome-wide association studies (GWAS) have not led to the identification of significant results. We performed a GWAS based on 495 German young patients with ADHD (according to DSM-IV criteria; Human660W-Quadv1; Illumina, San Diego, CA) and on 1,300 population-based adult controls (HumanHap550v3; Illumina). Some genes neighboring the single nucleotide polymorphisms (SNPs) with the lowest P-values (best P-value: 8.38 × 10(-7)) have potential relevance for ADHD (e.g., glutamate receptor, metabotropic 5 gene, GRM5). After quality control, the 30 independent SNPs with the lowest P-values (P-values ≤ 7.57 × 10(-5) ) were chosen for confirmation. Genotyping of these SNPs in up to 320 independent German families comprising at least one child with ADHD revealed directionally consistent effect-size point estimates for 19 (10 not consistent) of the SNPs. In silico analyses of the 30 SNPs in the largest meta-analysis so far (2,064 trios, 896 cases, and 2,455 controls) revealed directionally consistent effect-size point estimates for 16 SNPs (11 not consistent). None of the combined analyses revealed a genome-wide significant result. SNPs in previously described autosomal candidate genes did not show significantly lower P-values compared to SNPs within random sets of genes of the same size. We did not find genome-wide significant results in a GWAS of German children with ADHD compared to controls. The second best SNP is located in an intron of GRM5, a gene located within a recently described region with an infrequent copy number variation in patients with ADHD.

Expression of ADAMTS1 in endothelial cells is induced by shear stress and suppressed in sprouting capillaries

ADAMTS1 inhibits capillary sprouting, and since capillary sprouts do not experience the shear stress caused by blood flow, this study undertook to clarify the relationship between shear stress and ADAMTS1. It was found that endothelial cells exposed to shear stress displayed a strong upregulation of ADAMTS1, dependent upon both the magnitude and duration of their exposure. Investigation of the underlying pathways demonstrated involvement of phospholipase C, phosphoinositide 3-kinase, and nitric oxide. Forkhead box protein O1 was identified as a likely inhibitor of the system, as its knockdown was followed by a slight increase in ADAMTS1 expression. In silico prediction displayed a transcriptional binding site for Forkhead box protein O1 in the promotor region of the ADAMTS1 gene, as well as sites for nuclear factor 1, SP1, and AP-1. The anti-angiogenic effects of ADAMTS1 were attributed to its cleavage of thrombospondin 1 into a 70-kDa fragment, and a significant enhancement of this fragment was indeed demonstrated by immunoblotting shear stress-treated cells. Accordingly, scratch wound closure displayed a slowdown in conditioned medium from shear stress-treated endothelial cells, an effect that could be completely blocked by a knockdown of thrombospondin 1 and partially blocked by a knockdown of ADAMTS1. Non-perfused capillary sprouts in rat mesenteries stained negative for ADAMTS1, while vessels in the microcirculation that had already experienced blood flow yielded the opposite results. The shear stress-dependent expression of ADAMTS1 in vitro was therefore also demonstrated in vivo and thereby confirmed as a mechanism connecting blood flow with the regulation of angiogenesis.

An Actor-Critic based controller for glucose regulation in type 1 diabetes

A novel adaptive approach for glucose control in individuals with type 1 diabetes under sensor-augmented pump therapy is proposed. The controller, is based on Actor-Critic (AC) learning and is inspired by the principles of reinforcement learning and optimal control theory. The main characteristics of the proposed controller are (i) simultaneous adjustment of both the insulin basal rate and the bolus dose, (ii) initialization based on clinical procedures, and (iii) real-time personalization. The effectiveness of the proposed algorithm in terms of glycemic control has been investigated in silico in adults, adolescents and children under open-loop and closed-loop approaches, using announced meals with uncertainties in the order of ±25% in the estimation of carbohydrates. The results show that glucose regulation is efficient in all three groups of patients, even with uncertainties in the level of carbohydrates in the meal. The percentages in the A+B zones of the Control Variability Grid Analysis (CVGA) were 100% for adults, and 93% for both adolescents and children. The AC based controller seems to be a promising approach for the automatic adjustment of insulin infusion in order to improve glycemic control. After optimization of the algorithm, the controller will be tested in a clinical trial.

ENU-induced phenovariance in mice: inferences from 587 mutations

Background We present a compendium of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)-induced mouse mutations, identified in our laboratory over a period of 10 years either on the basis of phenotype or whole genome and/or whole exome sequencing, and archived in the Mutagenetix database. Our purpose is threefold: 1) to formally describe many point mutations, including those that were not previously disclosed in peer-reviewed publications; 2) to assess the characteristics of these mutations; and 3) to estimate the likelihood that a missense mutation induced by ENU will create a detectable phenotype. Findings In the context of an ENU mutagenesis program for C57BL/6J mice, a total of 185 phenotypes were tracked to mutations in 129 genes. In addition, 402 incidental mutations were identified and predicted to affect 390 genes. As previously reported, ENU shows strand asymmetry in its induction of mutations, particularly favoring T to A rather than A to T in the sense strand of coding regions and splice junctions. Some amino acid substitutions are far more likely to be damaging than others, and some are far more likely to be observed. Indeed, from among a total of 494 non-synonymous coding mutations, ENU was observed to create only 114 of the 182 possible amino acid substitutions that single base changes can achieve. Based on differences in overt null allele frequencies observed in phenotypic vs. non-phenotypic mutation sets, we infer that ENU-induced missense mutations create detectable phenotype only about 1 in 4.7 times. While the remaining mutations may not be functionally neutral, they are, on average, beneath the limits of detection of the phenotypic assays we applied. Conclusions Collectively, these mutations add to our understanding of the chemical specificity of ENU, the types of amino acid substitutions it creates, and its efficiency in causing phenovariance. Our data support the validity of computational algorithms for the prediction of damage caused by amino acid substitutions, and may lead to refined predictions as to whether specific amino acid changes are responsible for observed phenotypes. These data form the basis for closer in silico estimations of the number of genes mutated to a state of phenovariance by ENU within a population of G3 mice.

Common obesity risk alleles in childhood attention-deficit/hyperactivity disorder

Children with attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) have a higher rate of obesity than children without ADHD. Obesity risk alleles may overlap with those relevant for ADHD. We examined whether risk alleles for an increased body mass index (BMI) are associated with ADHD and related quantitative traits (inattention and hyperactivity/impulsivity). We screened 32 obesity risk alleles of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in a genome-wide association study (GWAS) for ADHD based on 495 patients and 1,300 population-based controls and performed in silico analyses of the SNPs in an ADHD meta-analysis comprising 2,064 trios, 896 independent cases, and 2,455 controls. In the German sample rs206936 in the NUDT3 gene (nudix; nucleoside diphosphate linked moiety X-type motif 3) was associated with ADHD risk (OR: 1.39; P = 3.4 × 10(-4) ; Pcorr  = 0.01). In the meta-analysis data we found rs6497416 in the intronic region of the GPRC5B gene (G protein-coupled receptor, family C, group 5, member B; P = 7.2 × 10(-4) ; Pcorr  = 0.02) as a risk allele for ADHD. GPRC5B belongs to the metabotropic glutamate receptor family, which has been implicated in the etiology of ADHD. In the German sample rs206936 (NUDT3) and rs10938397 in the glucosamine-6-phosphate deaminase 2 gene (GNPDA2) were associated with inattention, whereas markers in the mitogen-activated protein kinase 5 gene (MAP2K5) and in the cell adhesion molecule 2 gene (CADM2) were associated with hyperactivity. In the meta-analysis data, MAP2K5 was associated with inattention, GPRC5B with hyperactivity/impulsivity and inattention and CADM2 with hyperactivity/impulsivity. Our results justify further research on the elucidation of the common genetic background of ADHD and obesity.

Polymorphism and chromosomal location of the MC4R (melanocortin-4 receptor) gene in the dog and red fox

The melanocortin-4 receptor (MC4R) is expressed in the hypothalamus and regulates energy intake and body weight. In silico screening of the canine chromosome 1 sequence and a comparison with the porcine MC4R sequence by BLAST were performed. The nucleotide sequence of the whole coding region and 3'- and 5'-flanking regions of the dog (1214 bp) and red fox (1177 bp) MC4R gene was established and high conservation of the nucleotide sequences was revealed (99%). Five sets of PCR primers were designed and a search for polymorphism was performed by the SSCP technique in a group of 31 dogs representing nineteen breeds and 35 farm red foxes. Sequencing of DNA fragments, representing the identified SSCP patterns, revealed three single nucleotide polymorphisms (including a missense one) in dogs and four silent SNPs in red foxes. An average SNP frequency was approx. 1/400 bp in the dog and 1/300 bp in the red fox. We mapped the MC4R gene by FISH to the canine chromosome 1 (CFA1q1.1) and to the red fox chromosome 5 (VVU5p1.2).

PCR and real-time PCR primers developed for detection and identification of Bifidobacterium thermophilum in faeces

BACKGROUND: Culture-independent methods based on the 16S ribosomal RNA molecule are nowadays widely used for assessment of the composition of the intestinal microbiota, in relation to host health or probiotic efficacy. Because Bifidobacterium thermophilum was only recently isolated from human faeces until now, no specific real-time PCR (qPCR) assay has been developed for detection of this species as component of the bifidobacterial community of the human intestinal flora. RESULTS: Design of specific primers and probe was achieved based on comparison of 108 published bifidobacterial 16S rDNA sequences with the recently published sequence of the human faecal isolate B. thermophilum RBL67. Specificity of the primer was tested in silico by similarity search against the sequence database and confirmed experimentally by PCR amplification on 17 Bifidobacterium strains, representing 12 different species, and two Lactobacillus strains. The qPCR assay developed was linear for B. thermophilum RBL67 DNA quantities ranging from 0.02 ng/microl to 200 ng/microl and showed a detection limit of 10(5) cells per gram faeces. The application of this new qPCR assay allowed to detect the presence of B. thermophilum in one sample from a 6-month old breast-fed baby among 17 human faecal samples tested. Additionally, the specific qPCR primers in combination with selective plating experiments led to the isolation of F9K9, a faecal isolate from a 4-month old breast-fed baby. The 16S rDNA sequence of this isolate is 99.93% similar to that of B. thermophilum RBL67 and confirmed the applicability of the new qPCR assay in faecal samples. CONCLUSION: A new B. thermophilum-specific qPCR assay was developed based on species-specific target nucleotides in the 16S rDNA. It can be used to further characterize the composition of the bifidobacterial community in the human gastrointestinal tract. Until recently, B. thermophilum was considered as a species of animal origin, but here we confirm with the application of this new PCR assay the presence of B. thermophilum strains in the human gut.

Ausschluss von Patienten aus der Analyse: Auswirkungen auf die Ergebnisse randomisierter kontrollierter Studien: Eine meta-epidemiologische Studie

Zielsetzung: Untersuchung, ob der Ausschluss von Patienten aus der statistischen Analyse in randomisierten Studien mit Fehlbewertungen der Wirksamkeit von Behandlungen sowie einer größeren Heterogenität zwischen verschiedenen Studien assoziiert ist. Studiendesign: Meta-epidemiologische Studie auf der Basis einer Sammlung von Metaanalysen randomisierter Studien. Datenquellen: 14 Metaanalysen, die insgesamt 167 Studien berücksichtigten. Diese verglichen die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen bei Arthrose des Knie- oder Hüftgelenks mit Kontrollgruppen, die entweder keine Intervention oder Placebo erhielten und verwendeten jeweils Schmerz nach Angaben der Patienten als Endpunkt. Methoden: Zur Berechnung der Effektgrößen wurden die Unterschiede in der durchschnittlichen Schmerzintensität zwischen den Gruppen am Ende durch die gepoolte Standardabweichung dividiert. Die statistische Zusammenfassung der Studien erfolgte durch eine Random-Effects-Metaanalyse. Studien mit und Studien ohne Ausschluss von Patienten aus der statistischen Analyse wurden in Bezug auf die Bewertung der Therapiewirksamkeit gegeneinander verglichen, und die Auswirkungen einer Beschränkung von Metaanalysen auf Studien ohne Patientenausschluss wurden berechnet. Ergebnisse: In 39 Studien (23 %) waren sämtliche Patienten in die Analyse eingeschlossen. In 128 Studien (77 %) wurden Patienten von der Analyse ausgeschlossen. Die Effektgrößen waren in Studien mit Patientenausschluss tendenziell vorteilhafter als in Studien ohne Patientenausschluss (Differenz –0,13; 95-%-Konfidenzintervall –0,29 bis 0,04). Allerdings variierten die Schätzungen der Verzerrung zwischen einzelnen Metaanalysen erheblich (τ2 = 0,07). Untersuchungen der Interaktion zwischen Ausschluss aus der Analyse und Bewertung der Therapiewirksamkeit waren in fünf Metaanalysen positiv. Stratifizierte Analysen zeigten, dass Unterschiede in Bezug auf Effektgrößen zwischen Studien mit versus Studien ohne Patientenausschluss stärker ausfielen in Metaanalysen mit großer Heterogenität zwischen den einzelnen Studien, in Metaanalysen mit großer geschätzter Therapiewirksamkeit und in Metaanalysen aus dem Bereich der Komplementärmedizin. Beschränkten sich die Metaanalysen auf Studien ohne Patientenausschluss, resultierte dies in geringerer geschätzter Therapiewirksamkeit, größeren p-Werten und einer beträchtlichen Minderung der Heterogenität zwischen den einzelnen Studien. Schlussfolgerungen: Der Ausschluss von Patienten aus der statistischen Analyse in randomisierten Studien führt häufig zu Fehleinschätzungen der Therapiewirkungen. Ausmaß und Richtung dieser Verzerrung sind jedoch unvorhersehbar. Berichte randomisierter Studien sollten grundsätzlich Ergebnisse von Intention-to-treat-Analysen nennen. Systematische Übersichtsarbeiten sollten den Einfluss des Patientenausschlusses von der statistischen Analyse auf die Bewertung der Therapiewirksamkeit routinemäßig prüfen.

Novel autoantigens immunogenic in COPD patients

Background Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a respiratory inflammatory condition with autoimmune features including IgG autoantibodies. In this study we analyze the complexity of the autoantibody response and reveal the nature of the antigens that are recognized by autoantibodies in COPD patients. Methods An array of 1827 gridded immunogenic peptide clones was established and screened with 17 sera of COPD patients and 60 healthy controls. Protein arrays were evaluated both by visual inspection and a recently developed computer aided image analysis technique. By this computer aided image analysis technique we computed the intensity values for each peptide clone and each serum and calculated the area under the receiver operator characteristics curve (AUC) for each clone and the separation COPD sera versus control sera. Results By visual evaluation we detected 381 peptide clones that reacted with autoantibodies of COPD patients including 17 clones that reacted with more than 60% of the COPD sera and seven clones that reacted with more than 90% of the COPD sera. The comparison of COPD sera and controls by the automated image analysis system identified 212 peptide clones with informative AUC values. By in silico sequence analysis we found an enrichment of sequence motives previously associated with immunogenicity. Conclusion The identification of a rather complex humoral immune response in COPD patients supports the idea of COPD as a disease with strong autoimmune features. The identification of novel immunogenic antigens is a first step towards a better understanding of the autoimmune component of COPD.