Isolierung, Charakterisierung und Nachweis methanogener Archaea aus laufenden Praxis-NawaRo-Biogasanlagen unter besonderer Beruecksichtigung der Gattung Methanobacterium

Im Verlauf der Forschungsarbeit wurden Proben aus fünf, mit nachwachsenden Rohstoffen (NawaRo) beschickten, landwirtschaftlichen Biogasanlagen (BGA) auf die Biozönose methanogener Archaea hin molekularbiologisch untersucht. Über „amplified rDNA restriction analysis“-Screening (ARDRA) von Bibliotheken auf Basis von 16S rRNA-Genfragmenten konnte anhand zweier beispielhafter BGA das Vorkommen von Vertretern der Gattungen Methanoculleus (Mcu.), Methanobacterium (Mb.), Methanosarcina (Msc.) und Methanosaeta (Mst.) nachgewiesen werden. Mittels denaturierender Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) wurde das Vorkommen dieser Mikroorganismen auch in den übrigen Anlagen gezeigt. Ergänzend dazu wurde in drei Anlagen Methanospirillum hungatei nachgewiesen. Nach Ausarbeitung gattungsspezifischer Isolierungsstrategien konnten insgesamt zehn Vertreter der Gattung Methanobacterium (Isolate Mb1 bis Mb10) und jeweils ein Vertreter der Gattungen Methanoculleus (Isolat Mcu(1)), Methanosarcina (Isolat NieKK) und Methanosaeta (Isolat Mst1.3) aus den BGA-Proben isoliert werden. Durch in silico-Abgleich der partiellen 16S rRNA-Gensequenzen wurden diese als Verwandte von Mb. formicicum MFT, Mcu. bourgensis MS2T, Msc. mazei S-6T und Mst. concilii FE mit einer Sequenzidentität > 97% identifiziert. Im Laufe weiterer molekularbiologischer Untersuchungen mittels DGGE und ARDRA-Analyse konnten die Isolate den Referenzstämmen zugeordnet werden. In Bezug auf die Gattung Methanobacterium ergaben sich jedoch leichte Abweichungen. Diese bestätigten sich in vergleichenden Analysen des genomischen Fingerabdrucks in der „specifically amplified polymorphic DNA“-PCR (SAPD-PCR), welche im Rahmen dieser Arbeit erstmalig erfolgreich auf archaeelle Organismen angewandt wurde. Hier zeigten die Isolate zwei von den Fingerabdrücken der untersuchten Referenzstämme verschiedene Hauptamplifikationsmuster. Aufgrund der Vielzahl der Isolate sowie dem signifikanten Vorkommen in qPCR-Analysen und Klonbibliotheken fokussierten sich die weiteren Arbeiten zur genauen Untersuchung dieser Abweichungen auf phylogenetische Analysen der Gattung Methanobacterium und die Entwicklung von Nachweissystemen. Die Aufklärung eines Großteils der 23S rRNA-Gensequenzen der Isolate und von ausgewählten Typstämmen ermöglichte ergänzende phylogenetische Untersuchungen zu durchgeführten 16S rRNA-Analysen. Dabei wurden die Isolate jeweils in einem eigenen Cluster abseits der meisten Referenzstämme aus der Gattung Methanobacterium positioniert. Analog zur Musterbildung im Rahmen der SAPD-Analyse zeigte sich eine Differenzierung in zwei Äste und ergab in Übereinstimmung mit den in silico-Sequenzabgleichen den höchsten Verwandtschaftsgrad mit Mb. formicicum MFT. Die Eignung der SAPD-PCR zur Ableitung spezifischer Primerpaare konnte erstmals auch für methanogene Archaea gezeigt werden. Die Ableitung zweier Primerpaare mit Spezifität für die Methanobacterium-Isolate Mb1 bis Mb10 sowie für den Typstamm Mb. formicicum MFT gelang und konnte im Rahmen eines Direkt-PCR-Nachweises erfolgreich auf Reinkulturen und Fermenterproben angewandt werden. Unter Einbezug der sequenzierten 23S rRNA-Genfragmente gelang die Erstellung von Oligonukleotid-Sonden für den Einsatz in Fluoreszenz in situ-Hybridisierungsexperimenten. Im Praxistest ergab sich für diese Sonden eine Spezifität für alle getesteten Vertreter der Gattung Methanobacterium sowie für Methanosphaera stadtmanae MCB-3T und Methanobrevibacter smithii PST.rnSomit konnten im Laufe der Arbeit die dominanten methanogenen Archaea in NawaRo-BGA in mehrphasigen Experimenten nachgewiesen, quantifiziert und auf nur wenige Gattungen eingegrenzt werden. Vertreter der vier dominanten Gattungen wurden isoliert und Nachweissysteme für Arten der Gattung Methanobacterium erstellt.rn

In this study, the biocoenosis of methanogenic archaea was analyzed in samples of five agricultural biogas plants (BGP) fed with renewable resources (RR) using molecular biological methods. In two exemplary BGP presence of species of the genera Methanoculleus (Mcu.), Methanobacterium (Mb.), Methanosarcina (Msc.) and Methanosaeta (Mst.) was demonstrated by „amplified rDNA restriction analysis“-screening (ARDRA) of 16S rRNA gene-based clone libraries. By application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) the appearance of these microorganisms was also shown in the substrates of the remaining BGP. Additionally, Methanospirillum hungatei was found in three BGP. After deduction of species-specific isolation strategies, species of the genera Methanobacterium (isolates Mb1 to Mb10), Methanoculleus (isolate Mcu(1)), Methanosarcina (isolate NieKK) and Methanosaeta (isolate Mst1.3) were isolated from BGP samples. In silico analysis of the partial 16S rRNA-gene sequences revealed the isolates to be related to Mb. formicicum MFT, Mcu. bourgensis MS2T, Msc. mazei S-6T and Mst. concilii FE, respectively, with sequence identities of > 97%. In the course of further molecular biological analyses, the isolates were assigned to the appropriate type strains using DGGE and ARDRA. For isolates of the genus Methanobacterium slight deviations were shown. These were confirmed in comparative analyses of the genomical fingerprints using „specifically amplified polymorphic DNA“-PCR (SAPD-PCR), which was applied to archaeal organisms for the first time during this study. The isolates showed two groups of fingerprints deviating from the fingerprints of analyzed reference strains. Because of the multitude of isolates as well as the significant prevalence of the order Methanobacteriales in the BGP samples as revealed by qPCR and clone libraries, further work for the investigation of the deviations focused on phylogenetic analyses as well as on the establishing of detection systems. The 23S rRNA gene sequences of isolates and selected reference strains were successfully deduced and used for additional phylogenetic studies complementary to analyses based on 16S rRNA gene sequences. Within the genus Methanobacterium isolates were affiliated within a separate cluster next to the position of reference strains. This cluster was divided into two branches analogous to the amplification patterns resulting from SAPD analysis. In accordance to in silico sequence alignments both branches were closely related to Mb. formicicum MFT. Furthermore, the applicability of the SAPD-PCR method for the deduction of specific primers was successfully shown for methanogenic archaea for the first time. Two primer pairs specific for Methanobacterium isolates Mb1 to Mb10 and Mb. formicicum MFT were developed and successfully applied to pure cultures and BGP substrate samples in a direct PCR approach. Additionally, oligonucleotide probes suitable for fluorescence in situ-hybridization experiments were designed using the deduced 23S rRNA gene sequences. In practice the probes revealed specificity for all tested species of genus Methanobacterium as well as for Methanosphaera stadtmanae MCB-3T and Methanobrevibacter smithii PST. In summary, the dominant methanogenic archaea in samples of RR-fed BGP were detected, quantified and affiliated to few genera. Species of the four dominating genera were successfully isolated from BGP substrate samples and detection systems for species of genus Methanobacterium were established.