Embriões bovinos produzidos in vitro com espermatozoides sexados por citometria de fluxo: avaliação do desenvolvimento embrionário e da expressão de genes candidatos ao reconhecimento da gestação

Pós-graduação em Genética e Melhoramento Animal - FCAV

Perfil lipídico da membrana citoplasmática de espermatozoides in natura e criopreservados de jumentos e cavalos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas.

Obtenção e conservação de espermatozoides de cutia (Dasyprocta leporina Linneaus, 1753) do semiárido brasileiro

The general objective of this thesis was to stablish protocols to obtain and conserve agouti (Dasyprocta leporina) sperm bred in captivity in the Brazilian semi-arid, aiming its sustainable production. The thesis was divided in three experiments. In the first one, we studied the influence of the interaction between two probes (quadratics and sine waves) and two stimulation protocols (continuous and in series) on the agouti sperm collection by electroejaculation efficiency. The most efficient interaction on this obtainment was the one with probes with rings associated with stimuli in series (4/7; 57%, P<0.05). In the second experiment we compared the cryoprotectant effects of different substances (glycerol, ethyleneglycol, dimethylsulfoxide, dimethylformamide) on epididymis sperm cryopreservation. The highest values on motility (39.5±4.6%), vigor (2.9±0.2) and membrane integrity (30.6±4.5%) were observed on the samples cryopreserved using glycerol when compared to those with ethyleneglycol and dimethylformamide, but there was no difference (P>0.05) when compared to the samples cryopreserved with dimethylsulfoxide. At last, we studied the effects of the methods to obtain sperm (electroejaculation vs epididymal collection) on post thawing sperm quality. The samples obtained by epididymal retrograde flushing showed values for motility of 25.0±10.9% and vigor 2.4±0.8, and those obtained by electroejaculation had 31.2±14.2% of motility and vigor of 2.2±0.7, however, without statistical difference (P>0.05), which shows the possibility to successfully use the epididymal sperm cryopreservation protocol on agouti ejaculated sperm. In conclusion, significant advances on obtainment and processing of agouti sperm were made, allowing the establishment of germplasm banks from sperm samples obtained from the epididymis or by electroejaculation.

Desacoplamento mitocondrial e estresse oxidativo em espermatozoides suínos resfriados

A espécie suína (Sus scropha domesticus) possui relevância nos âmbitos da pesquisa, da xenotransplantação e da produção de carnes. O resfriamento de sêmen é capaz de reduzir o metabolismo celular e possibilitar o armazenamento dos gametas, sendo auxiliar durante práticas de reprodução assistida. Contudo, os espermatozoides suínos são sensíveis ao estresse oxidativo gerado durante o processo de resfriamento. O 2,4 dinitrofenol (DNP) poderia gerar o desacoplamento mitocondrial reduzindo o estresse oxidativo e prolongando indiretamente a viabilidade e capacidade fertilizante de espermatozoides suínos resfriados pela diminuição de espécies reativas de oxigênio. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do desacoplamento mitocondrial induzido pelo DNP e os efeitos desse desacoplamento sobre as de fluidez e integridade de membrana plasmática, funcionalidade de mitocôndria, motilidade espermática, além dos parâmetros de estresse oxidativo de lipoperoxidação e produção de espécies reativas de oxigênio, durante o resfriamento a 17 °C de 24 até 96 horas. Utilizou-se 22 ejaculados expostos ao diluente Betsville Thawing Solution (BTS) (controle) e ao mesmo diluente acrescido das concentrações de 0,01 µM (T1); 0,1 µM (T2); 1,0 µM (T3) e 10 µM (T4) de DNP. Através do teste de Shapiro-Wilk as variáveis que não apresentaram normalidade, tiveram suas médias comparadas pelo teste de KruskalWallis. As análises estatísticas demonstraram que o DNP não se diferiu do controle independente do tempo de armazenamento, para nenhuma das variáveis analisadas. Possivelmente, a falta de ação sobre as mitocôndrias, ou seja, a não promoção do desacoplamento mitocondrial foi o motivo principal para a falta dos efeitos do DNP. Acredita-se que a utilização do DNP em temperaturas mais elevadas por estas promoverem aumento da fluidez de membrana e/ou o aumento das concentrações de DNP poderiam gerar efeitos significativos sobre as mitocôndrias e demais variáveis analisadas. Finalmente, o DNP nas concentrações testadas não se diferiu do controle em todas as variáveis analisadas independente do tempo de armazenamento.

Análise morfofuncional de espermatozoides suínos e sua relação com a fertilidade in vivo

O espermatozoide é um dos constituintes seminal, sendo essencial para a fertilidade dos indivíduos, uma vez que nele está contido o material genético do progenitor masculino, o qual é transportado através do trato reprodutivo feminino até o encontro com o oócito. No que tange a célula espermática suína, existem poucos relatos acerca de suas as particularidades morfofuncionais, principalmente elencando os fatores relacionados e capazes de interferir na fertilidade desses animais. Devido à crescente relevância da espécie como modelo biológico e sua importância na produção comercial, torna-se necessário compreender a célula espermática, no que diz respeito às características estruturais e funcionais, relacionadas ao processo de fertilização. Assim, o presente trabalho avaliou a morfofisiologia da célula espermática, no que tange a motilidade espermática, integridade e fluidez de membrana plasmática, funcionalidade de mitocôndria, reação acrossomal, espécies reativas de oxigênio, peroxidação lipídica, oxidação de proteínas carbonil, integridade de DNA, capacidade antioxidante total, balanço iônico intracelular e teste de penetração em oócitos homólogos e relacionou essas características com a fertilidade in vivo (taxa de parição). Foi encontrada um diferença significativa na fertilização in vivo, podendo distinguir os animais em animais de alta fertilidade (fertilidade ≥ 70%) e animais de baixa fertilidade (fertilidade < 70%). Animais de alta fertilidade apresentam uma maior funcionalidade mitocondrial (p<0,05), menor fluidez de membrana plasmática (p<0,01) e maior capacidade antioxidante total (p<0,01). Sendo essas últimas correlacionadas de forma positiva à fertilidade in vivo, r= 0,77; p= 0,0003 e r= 0,63; p= 0,0049, respectivamente. Dentre as demais características não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos. Desta forma, este trabalho mostrou algumas características da célula espermática suína e fatores capazes de interferir na fertilidade dos animais. Possivelmente animais de alta fertilidade possuem um maior metabolismo celular, devido a um maior funcionalidade de mitocôndria, sendo capazes de balancear a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio devido a uma maior capacidade antioxidante, além disso, 5 essas células, provavelmente também possuam uma metabolismo celular mais estável e compatível com os eventos reprodutivos, o que é indicado pela menor fluidez de membrana plasmática. Assim, avaliações como a fluidez de membrana plasmática, capacidade antioxidante total e funcionalidade mitocondrial das células espermáticas destacam-se como marcadores bioquímicos promissores para predizer a fertilidade in vivo em suínos.

Preservación de espermatozoides de la cola del epidídimo bovino en condiciones de campo

La cola del epidídimo constituye un reservorio de espermatozoides que han alcanzado la madurez biológica a través de su trayecto por el largo conducto del epidídimo (Robaire y Hinton, 2014). Los espermatozoides de esta reserva epididimaria pueden obtenerse postmortem o a través de biopsias y utilizarse con fines reproductivos (Albers y Barrios, 2011). El presente trabajo tiene como objetivo principal probar algunas condiciones iniciales de manejo de espermatozoides de la cola del epidídimo de bovinos y su incidencia en parámetros específicos del análisis seminal.

Evaluación de la calidad y la congelabilidad de espermatozoides epididimarios provenientes de toros faenados en el camal de Cuenca, Ecuador

Las pérdidas inesperadas de animales de alto valor genético, así como la dificultad para recoger semen de especies silvestres conducen a un aumento en el uso de técnicas de reproducción asistida, ya que resulta ser una de las posibilidades para preservar el material genético de estos animales (Kaabi et al., 2003). La recuperación y criopreservación de espermatozoides de epidídimos de animales muertos (recuperación postmortem) es una opción viable para el mantenimiento de su germoplasma disponible para su uso futuro (Turri et al., 2012). Los estudios han demostrado la eficacia y el potencial de los espermatozoides del epidídimo para fertilizar in vitro e in vivo y para realizar inyección intracitoplasmática con resultados satisfactorios (Monteiro et al., 2011). El objetivo de esta investigación fue evaluar la calidad y la congelabilidad de espermatozoides epididimarios provenientes de toros faenados en el camal de Cuenca, Ecuador.

Estandarización de un protocolo de criopreservación de espermatozoides bovinos recuperados de la cola del epidídimo

Tesis (Médico Veterinario). -- Universidad de La Salle. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Programa de Medicina Veterinaria, 2013

SERR spectroelectrochemical study of cytochrome cd1 nitrite reductase co-immobilized with physiological redox partner cytochrome c552 on biocompatible metal electrodes

© 2015 Silveira et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Evaluación cuali-cuantitativa de espermatozoides de la cola del epedídimo de cuyes cavia porcellus criollos y mejorados en dos edades reproductivas

El objetivo de esta investigación fue evaluar las características cuali-cuantitativas de espermatozoides de cuyes extraídos de la cola del epidídimo según su fenotipo y edad reproductiva. Se realizó en la granja Irquis de la U. de Cuenca en 20 reproductores identificados por sus características fenotípicas y dispuestos en cuatro grupos: 5 criollos jóvenes (CJ), 5 criollos adultos (CA), 5 mejorados jóvenes (MJ), y 5 mejorados adultos (MA). Los cuyes fueron hemicastrados y de los epidídimos fueron disectados la cola sobre una caja petri. Se recuperó los espermatozoides por Swim up, diluidos en 1ml de medio (18% rafinosa y 3% leche descremada), procesados con Triladyl®, refrigerados a 5oC/1 hora, y equilibrados por 0, 2, 24, 48, 96, 192, y 360 horass para su análisis de viabilidad espermática. Se congelaron únicamente los espermatozoides de 2 hs de equilibrio en vapores de nitrógeno. Se usó un DCA de 2x2: fenotipo y edad, y se usó un ANOVA para comprobar significancia. Se obtuvo interacción (P<0,05) entre factores con eficiencia atribuida a MJ a las 0 hs: en Concentración (C) y Anormalidades de cola (AC), a las 24 hs: en motilidad individual (MIP) y 48 hs: en Vitalidad (VE). En MIP no se encontró diferencias (P>0,05) en ningún tiempo de medición. En VE sólo encontró diferencias (P<0,05) a las 96 hs (CJ:18,0;MJ:10,2;MA:8,6;CA:6,0%). En anormalidades totales (AT) sólo se encontró diferencias (P<0,05) a las 0 hs (MJ:26,3;CJ:32,6;MA:36,2;CA:38,5%); y en AC se encontró diferencias (P<0,05) a las 0 hs (MJ:4,6; CJ:9,5; CA:11,5; MA:16,4%), y a las 48 hs (CA:5,7;CJ:7,3;MJ:16,0;MA:18,1%). En Integridad de la membrana (HOS-Test) se obtuvo (P<0,05) diferencias a las 2 hs (MJ:20,0; MA:13,1;CA:10,7;CJ:9,0%) y a las 96 hs (CA:25,4;CJ:15,3;MJ:9,7; MA:8,8%). A la congelabilidad no se obtuvo sobrevivencia de espermatozoides en ninguno de los tratamientos. En conclusión, la cantidad y calidad de espermatozoides epididimarios de cuyes identificados fenotípicamente varía según su edad; sin embargo, no se pudo comprobar su variación en la congelabilidad mostrándose absolutamente inviables a la crío conservación

Dose inseminante utilizada na fertilização artificial de ovócito de piracanjuba (Brycon orbignyanus)

A piracanjuba (Brycon orbignyanus Valenciennes, 1849) é uma espécie de peixe migratória, ameaçada de extinção. O objetivo do presente estudo foi determinar a dose inseminante na fertilização artificial de ovócitos de piracanjuba. Para isso, utilizou-se delineamento em blocos casualizados, com quatro tratamentos e três repetições. Três casais de piracanjuba, selecionados dos tanques de reprodutores da Estação Ambiental de Itutinga (EAI - CEMIG), no período de piracema 2006/2007, receberam aplicação de hormônio extrato bruto de hipófise de carpa (EBHC) para obtenção dos gametas. Adotaram-se quatro tratamentos diferentes para a fertilização de 0,1 grama de ovócitos: 10µL, 20µL, 30µL e 40µL de sêmen. As amostras foram ativadas com 5 mL de água do próprio tanque e, em seguida, levadas para incubadoras, dotadas de renovação constante de água, à temperatura de 28ºC. Após 8 e 16 horas, analisaram-se as taxas de fertilização (ovos viáveis) e de eclosão dos ovos, respectivamente. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste de Tukey a 5%. As relações sêmen-ovócitos testadas não alteraram as taxas de fertilização e eclosão (P>0,05). O número de espermatozoides-ovócitos, variando de 10,4 x10(5) a 41,6 x10(5), foi eficiente para obtenção de boas taxas de fertilidade.

Ciclo testicular e espermatogênese de Devario aequipinnatus (cypriniformes, cyprinidae) submetido a diferentes temperaturas

Pós-graduação em Ciência e Tecnologia Animal - FEIS

Comparação de dano testicular entre ratos provenientes de explorações agrícolas orgânicas e convencionais

Dissertação de Mestrado em Ambiente, Saúde e Segurança.