Engineering of fatty acid production and secretion in Saccharomyces cerevisiae

Tese de Doutoramento em Ciências - Especialidade em Biologia

Constituintes químicos, fenóis totais e atividade antioxidante de Sterculia striata St. Hil. et Naudin

A investigação fitoquímica das cascas do caule de Sterculia striata St. Hil. et Naudin, através de métodos cromatográficos, conduziu ao isolamento dos esteróides sitosterol, estigmasterol e sitosterol-3-O-β-D-glicopiranosídeo, além de quatro triterpenóides pentacíclicos, o lupeol, 3-β-O-acil lupeol, lupenona e ácido betulínico. As estruturas desses compostos foram identificadas por análise dos espectros de RMN ¹H e 13C e comparações com dados da literatura. Para determinação do teor de fenóis totais do extrato etanólico de S. striata utilizou-se o reativo Folin Ciocalteu, enquanto na avaliação da atividade antioxidante empregou-se o radical livre DPPH. Este é o primeiro trabalho descrevendo o estudo químico com as cascas do caule desta espécie.

Síntese de péptidos contendo resíduos de aminoácidos não proteinogénicos

Dissertação de mestrado em Química Medicinal

The L162V polymorphism of the PPARA gene is associated with stage C of heart failure.

In human heart failure (HF) peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPAR alpha) is downregulated and consequently, the expression of genes involved in fatty acid oxidation repressed. The L162V (rs1800206) is a functional polymorphism of the human PPAR alpha gene (PPARA). In the present study we have investigated whether this polymorphism is associated with the development of stage C of HF.

Estudi de la relació estructura-funció de les proteïnes CPT1

En aquest treball s’ha analitzat la relació estructura-funció dels enzims CPT1, o Carnitina palmitoïltransferasa 1, que catalitza la reacció de transesterificació dels àcids grassos de cadena llarga a acil-carnitines, per tal que puguin accedir a la matriu mitocondrial i ser oxidats. Aquest enzim es troba estrictament regulat per malonil-CoA, primer intermediari de la síntesi d’àcids grassos, establint-se així una regulació coordinada entre la formació i la degradació de grasses. S’han estudiat els tres isotips de CPT1 descrits fins al moment: CPT1A, CPT1B i CPT1C. Mitjançant l’expressió heteròloga de mutants de CPT1A de rata i CPT1B de porc en el llevat P. pastoris, s’ha estudiat l’efecte sobre la inhibició per malonil-CoA de petits canvis en la seva estructura, per tal de trobar una relació entre la seva funció enzimàtica i la disposició conformacional de la proteïna. Segons els resultats obtinguts, el residu Glu590 de CPT1A de rata estaria impedint la unió de l’inhibidor, mentre que el residu Met593 estaria afavorint aquesta unió. Els estudis amb l’enzim CPT1B de porc demostraren l’existència d’un determinant positiu per la sensibilitat al malonil-CoA en els primers 18 residus de la proteïna, i definiren la posició Glu17 com la responsable de l’alta afinitat a la carnitina i la baixa sensibilitat a la inhibició per malonil-CoA (8). Es clonà i caracteritzà la regió promotora del gen de CPT1C humana, amb la intenció d’analitzar la funcionalitat de putatius elements de resposta identificats in silico. Cap dels elements estudiats resultà ser funcional in vivo. A més, es demostrà que la manca d’activitat catalítica de la proteïna no és deguda a l’extensió C-terminal que presenta respecte els isotips A i B, tot i presentar un alt percentatge d’identitat de seqüència. S’ha amplificat una isoforma humana de CPT1C (Pubmed Acc. Num. AK299866), corresponent a la regió carboxiterminal de la proteïna, que es pretén utilitzar per obtenir el primer cristall de la part soluble d’una proteïna CPT1.     

Variação no teor de lipídios em grãos de variedades de Coffea canephora

O objetivo deste trabalho foi estudar a variação do teor de lipídios em grãos de diferentes variedades de Coffea canephora Pierre, do Banco de Germoplasma de Café, do Instituto Agronômico, Campinas, SP, Brasil. Foram analisadas sementes de 47 plantas pertencentes às variedades Robusta (3), Kouilou ou Conilon 66 (13), Apoatã (12), Guarini (8), Laurentii (7) e Bukobensis (4). A quantidade de matéria graxa foi determinada após extração com éter de petróleo. Os resultados revelaram diferença entre o teor médio de lipídios das variedades Kouilou (7,33%) e Robusta (10,91%). Foram constatadas diferenças também dentro das plantas das seis variedades, com amplitudes de 15,57% a 21,63% em Apoatã e Laurentii, respectivamente.

Caracterização morfocultural, biossíntese de autoindutor e formação de biofilme por rizobactérias de hortaliças

O objetivo deste trabalho foi caracterizar e agrupar rizobactérias, isoladas de hortaliças, quanto à morfologia cultural, riqueza e diversidade e avaliar a biossíntese de autoindutores N-acil lactonas homoserinas (ALH) e a capacidade de formação de biofilmes. Sete estirpes também foram avaliadas quanto ao potencial de promoção de crescimento de Brassica oleraceae var. acephala em casa de vegetação. Para verificar a produção de ALH, foram realizados ensaios com Agrobacterium tumefaciens estirpe NT1 como sistema repórter. A formação de biofilme foi avaliada pelo cultivo do isolado em meio líquido. A promoção do crescimento foi avaliada após inoculação das estirpes em plantas de couve-de-folha pela determinação da produção de massa de matérias fresca e seca. A maior diversidade morfocultural foi encontrada entre as estirpes isoladas de couve-de-folha. De um total de 112 estirpes testadas, 13% foram positivas quanto à produção de ALH; de 91 estirpes, 96% foram capazes de formar biofilmes; e de 79 estirpes, 11% foram positivas para ambas as características. Foram observadas diferenças significativas na massa de matéria seca das raízes com inoculação de 10(9) UFC mL-1 da estirpe R142, que incrementou em 55% a massa de matéria seca das raízes de couve, em relação ao controle. Não há relação entre a capacidade de formar biofilme e a detecção de ALH produzidos pelas rizobactérias avaliadas.

Comparação de bancadas simuladoras do processo de semeadura em milho

No sistema de disco perfurado horizontal, há cerca de 180 opções para a distribuição das peneiras de milho disponibilizadas pelas empresas produtoras de semente. A utilização de bancadas simuladoras do processo de semeadura tem sido a ferramenta empregada por empresas produtoras de sementes e discos para indicar a melhor opção para cada lote de sementes de milho. O objetivo deste trabalho foi avaliar a bancada simuladora do processo de semeadura em dois formatos, revestida com feltro e revestida com graxa. Os tratamentos foram efetuados com base no projeto de norma da ABNT (1996) e foram montados com as combinações das velocidades 3; 5; 7 e 9 km h-1; densidades 4,0; 4,8 e 5,6 sementes por metro e nível de sementes cheio, médio e ¼ do reservatório. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com dez repetições; cada repetição conteve o total de 75 sementes. O experimento foi dividido em duas partes: na primeira, todas as variáveis foram analisadas com esteira de borracha revestida de feltro; em seguida, a esteira foi revestida com uma camada de graxa para nova avaliação das variáveis. Foram avaliados os percentuais de espaçamentos falhos, múltiplos, aceitáveis e o coeficiente de variação. Concluiu-se que não houve diferença na utilização dos dois formatos de bancada simuladora do processo de semeadura.

Software para estimativa do custo operacional de máquinas agrícolas - MAQCONTROL

A seleção e a otimização de sistemas mecanizados são os principais objetivos da mecanização racional. Não é suficiente uma compra adequada do maquinário agrícola se sua utilização não for controlada em aspectos operacionais e financeiros. Neste trabalho, é descrito o desenvolvimento de software para estimativa do custo operacional de máquinas agrícolas (MAQCONTROL), utilizando o ambiente de desenvolvimento Borland Delphi e o banco de dados Firebird. Os custos operacionais foram divididos em fixos e variáveis. Nos custos fixos, foram estimadas as despesas com depreciação, juros, alojamento e seguros. Nos custos variáveis, foi dada ênfase aos custos de manutenção como: óleos lubrificantes, filtros, pneus, graxa, combustível, pequenos reparos e troca de peças. Os resultados demonstraram a eficiência do software para os objetivos propostos. Assim, o MAQCONTROL pode ser uma importante ferramenta no processo de administração rural, pois reduz os custos da informação e agiliza a determinação precisa dos custos operacionais de máquinas agrícolas.

Controle do arroz vermelho através do herbicida sulfosate isolado e em misturacom adjuvantes

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência do herbicida sulfosate, aplicado isoladamente e em misturas com diferentes adjuvantes, comparado com o herbicida glifosate, ambos aplicados com baixo volume de calda, no controle da planta daninha arroz vermelho (Oryza sativa L.) sob aplicação em condições de préplantio da cultura do arroz. O experimento foi conduzido em campo, sendo a área experimental instalada na cultura de arroz irrigado, variedade IAC-101. A área de pousio recebeu uma lâmina de água de 5 a 10cm de pro fundidade por dois dias, e após a retirada, o arroz vermelho começou a germinar. Quando o mesmo atingiu cerca de 20-25cm de altura, procedeu-se a aplicação de herbicidas de manejo (pré-plantio) . Após 16 dias da aplicação foi efetuado o plantio da cultura com densidade de 60-80 sementes/metro linear e profundidade de 3cm, sendo o espaçamento utilizado de 21,8cm entre linhas. Foram testados tratamentos com os seguintes produtos: sulfosate a 1,20; 1,44 e 1,68Kg i.a./ha e glifosate a 1,20; 1,44 e 1,68Kg i.a./ha, ambos os produtos aplicados isolados e em misturas com os seguintes adjuvantes: Poliglicol, Organosilicone e Amina Graxa, além de uma testemunha não capinada. Para a avaliação do efeito dos tratamentos empregados foram realizadas as seguintes avaliações: fitotoxicidade aperente, porcentagem de controle do arroz vermelho; altura do arroz vermelho (em cm); estande da cultura (no de per filhos/metro linear) e altura da cultura (em cm). Através dos resultados obtidos pode-se concluir que os herbicidas sulfosate, glifosate nas formulações comerciais Rodeo e Roundup, nas doses de 1,20; 1,44 e 1,68Kg i.a./ha, aplicados isolados (exceto o Rodeo) e conjuntamente com os adjuvantes poliglicol (Mojante), organosilicone (Silwet) e amina graxa (Frigate) (exceto Roundup, que foi utilizado apenas com o adjuvante amina graxa e sozinho), propiciaram excelente nível de controle do arroz vermelho, quando aplicados em pós-emergência e área total, e pré-plantio da cultura de arroz, implantada no sistema de plantio direto. Também foi verificado que não ocorreu diferença quanto à eficiência entre sulfosate e glifosate no controle do arroz vermelho, ambos controlando de forma eficiente a planta daninha.

Caracterização físico-química de algumas tuberosas amiláceas

As principais fontes de amido comercial no mundo são o milho, a batata e a mandioca. Entretanto, nos últimos anos vem crescendo o interesse em amidos naturais que possam ser utilizados pela indústria alimentícia. Assim, este trabalho teve por objetivo caracterizar, quanto à composição físico-química, açafrão, ahipa, araruta, batata-doce, biri, inhame e mandioquinha-salsa, tuberosas amiláceas potencialmente passíveis de introdução como matérias-primas de interesse comercial. Amostras das tuberosas foram analisadas quanto ao teor de umidade, cinzas, proteína, matéria graxa, açúcares redutores e totais, fibras e amido. Os resultados obtidos mostraram que das tuberosas analisadas as que apresentaram maior teor de amido foram a araruta (Maranta arundinacea), o inhame (Dioscorea sp) e o biri (Canna edulis), sendo que o inhame e o biri apresentaram também o maior rendimento potencial em toneladas de amido/hectare.

Aproveitamento de subproduto industrial de óleos vegetais para produção de riboflavina por Candida guilliermondii DM 644

A produção e consumo de alimentos industrializados têm aumentado a preocupação com suplementação e enriquecimento de alimentos com vitaminas e sais minerais, visando repor as possíveis perdas durante os processos de fabricação, principalmente das vitaminas hidrossolúveis, mais especificamente da vitamina B2 ou riboflavina. Assim sendo, a proposta deste trabalho foi utilizar como componente principal do meio, para produção da riboflavina, um subproduto do refino de óleos vegetais e o microrganismo Candida guillermondii DM 644. A produção da vitamina B2 foi realizada por fermentação em batelada utilizando Erlenmeyer. As condições empregadas foram agitação orbital, ausência de luz, 30°C, e 24h de incubação. A otimização da produção de riboflavina foi realizada através de Delineamento Fatorial Fracionário, para avaliar os efeitos da concentração de matéria graxa, fonte de nitrogênio, pH, velocidade de agitação, fonte de fósforo e extrato de levedura e as possíveis interações. A concentração máxima de riboflavina foi 19,12mg/mL. Os fatores mais importantes para produção de riboflavina foram a concentração de matéria graxa e a fonte de nitrogênio, enquanto que a fonte de fósforo e o extrato de leveduras não estimularam sua biossíntese. A máxima produção foi obtida com matéria graxa a 10g/L, uréia a 2,5g/L e pH 5,0. A velocidade de agitação (200 e 400rpm) não interferiu no processo biotecnológico.

Efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre as atividades enzimáticas dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens

A deficiência de desidrogenase das acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo devido a um defeito no último ciclo de β-oxidação, sendo específica para ácidos graxos de cadeia curta (4 a 6 carbonos), resultando no acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta, principalmente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico, formados pela metabolização por rotas secundárias do butiril-CoA acumulado. A deficiência de SCAD manifesta-se principalmente no período neonatal ou durante a infância e até mesmo na idade adulta. Os achados clínico-laboratoriais são heterogêneos, incluindo acidose metabólica, acidose lática, vômitos, atraso no desenvolvimento, convulsões, fraqueza muscular e miopatia crônica. No entanto, o sintoma mais comum apresentado pelos pacientes portadores dessa deficiência é a disfunção neurológica, a qual pode estar relacionada ao acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta e sua toxicidade ao sistema nervoso central. No presente trabalho nosso objetivo foi investigar o efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre algumas atividades enzimáticas fundamentais para o metabolismo energético. Visando contribuir para uma melhor compreensão da fisiopatogenia dessa doença testamos o efeito desses metabólitos sobre a atividade dos complexos da cadeia respiratória e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens. Verificamos que os ácidos etilmalônico e metilsucínico, na concentração de 1 mM, inibiram significativamente a atividade do complexo I+III da cadeia respiratória em córtex cerebral de ratos, porém não alteraram a atividade dos demais complexos da cadeia respiratória (II, SDH, II+III, III e IV) nesses tecido bem como não alteraram a atividade de todos os complexos da cadeia repiratória em músculo esquelético e músculo cardíaco dos ratos nas concentrações de 1 e 5 mM. Observamos também que o ácido etilmalônico (1 e 2,5 mM) reduziu de forma significativa a atividade total de creatina quinase em córtex cerebral de ratos, mas não alterou essa atividade nos músculos esquelético e cardíaco. Por outro lado o ácido metilsucínico não modificou a atividade total da creatina quinase em nenhum dos três tecidos estudados, córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos. Testamos então o efeito do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase nas frações mitocondrial e citosólica de córtex cerebral, músculo cardíaco e músculo esquelético de ratos. O ácido (1 e 2,5 mM) inibiu significativamente a atividade da creatina quinase apenas na fração mitocondrial de córtex cerebral. Demostramos também que o antioxidante glutationa (1 mM) preveniu o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade total da creatina quinase em córtex cerebral. A glutationa (0,5 mM) e o ácido ascórbico (0,5 mM) também preveniram o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase na fração mitocondrial de córtex cerebral. Por outro lado a adição de L-NAME ou trolox não alterou o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase. Esses resultados indicam que o ácido etilmalônico possui um efeito inibitório específico sobre a isoforma mitocondrial da creatina quinase do cérebro, ou seja, sobre a CKmi a, não afetando a isoenzima citosólica cerebral ou as isoenzimas citosólicas e mitocondrial presentes no músculo esquelético e no músculo cardíaco. Além disso, o efeito da glutationa, que atua como um agente redutor de grupos tióis, indica que a ação inibitória do ácido etilmalônico sobre a creatina quinase pode estar relaciona à oxidação de grupos sulfidrila essenciais à atividade da enzima. Já a prevenção do efeito inibitório do ácido etilmalônico causada pelo ácido ascórbico sugere que o ácido pode estar envolvido com a formação dos radicais superóxido e hidroxila, uma vez que este agente antioxidante atua sobre esses radicais livres. Essas observações em seu conjunto indicam que os ácidos etilmalônico e metilsucínico comprometem o metabolismo energético cerebral através da inibição de atividades enzimáticas essenciais para a produção e transporte de energia pela célula. É, portanto, possível que esse possa ser um dos mecanismos envolvidos com o dano cerebral que ocorre nos pacientes afetados por deficiência de SCAD.

Efeito dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre alguns parâmetros do sistema glutamatérgico e de estresse oxidativo em cérebro de ratos

A deficiência da enzima desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo potencialmente letal que afeta o último ciclo da oxidação de ácidos graxos. O bloqueio da rota na conversão de n-butiril-CoA a acetil-CoA resultante da deficiência enzimática leva ao acúmulo tecidual e aumento da concentração nos líquidos biológicos predominantemente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico. Os pacientes afetados apresentam episódios de acidose metabólica intermitente, hiperamonemia, coma e acidose neonatal com hiperreflexia, miopatia por depósito de lipídios e hipotonia. Os sinais e sintomas dessa doença são variáveis, podendo aparecer em qualquer idade, do nascimento à vida adulta, e em combinações variáveis, freqüentemente levando a episódios ameaçadores à vida de descompensação metabólica depois de um período de ingesta inadequada de calorias e/ou doença intercorrente. Tendo em vista que a patogênese do dano cerebral na deficiência da SCAD é pouco conhecida, no presente estudo investigamos a ação dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre alguns parâmetros envolvendo o sistema glutamatérgico e a produção de estresse oxidativo em cérebro de ratos jovens. Observamos inicialmente que o ácido etilmalônico promoveu uma diminuição significativa na captação de L-[3H]glutamato por fatias de córtex nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1,0 mM. Já nas técnicas relacionadas à união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas, o ácido provocou uma diminuição da ligação de L-[3H]glutamato às membranas na ausência de sódio em todas as concentrações testadas (0,01 – 1,0 mM) e, quando em presença de sódio, houve diminuição da união somente na concentração de 1,0 mM do ácido. Por outro lado, não foi verificado qualquer efeito desse ácido sobre a captação vesicular de L-[3H]glutamato nas concentrações utilizadas. O ácido metilsucínico comportou-se de forma semelhante ao ácido etilmalônico nos parâmetros de captação de L-[3H]glutamato por fatias e união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas. Houve uma diminuição da captação de glutamato por fatias de córtex cerebral, uma diminuição da união de L-[3H]glutamato na ausência de sódio em todas as concentrações e, na presença de sódio, uma diminuição da captação apenas na concentração de 1,0 mM. Por outro lado, distintamente do que ocorreu com o ácido etilmalônico, na captação vesicular observamos uma diminuição da captação em todas as concentrações testadas. Nossos resultados demonstram, desta forma, alterações importantes no sistema glutamatérgico pelos ácidos acumulados na deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta. A etapa seguinte foi investigar o efeito dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens: medida do potencial antioxidante total (TRAP), medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e medida de quimiluminescência. Foi verificado que os dois ácidos não afetam a lipoperoxidação, medida através do TBA-RS e quimiluminescência e tampouco as defesas antioxidantes não-enzimáticas, medidas através do TRAP. Embora não tenhamos medido o efeito dos ácidos sobre as defesas enzimáticas antioxidantes representadas pelas enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, os resultados dos parâmetros analisados no presente trabalho sugerem que os ácidos acumulados na deficiência da SCAD não produzem estresse oxidativo.

Purificação e caracterização da bacteriocina cereína 8A, produzida por uma linhagem de Bacillus cereus

Foi estudada uma bacteriocina produzida por uma linhagem de B. cereus 8A, isolado de solo da região Sul do Brasil. Na primeira etapa de estudo determinaram-se as condições básicas de produção de bacteriocina com amplo espectro de ação denominada de Cereína 8A. Observou-se que durante a fase estacionária ocorre o máximo da sua produção, iniciando sua síntese no final da fase exponencial. As condições de maior produção foram a 30º C, agitação e contínua e numa faixa de pH de 7,0-8,5. A bacteriocina bruta inibiu várias bactérias indicadoras, como Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens e Bacillus cereus. O teste de termoestabilidade mostrou a perda de atividade quando submetida a uma temperatura a partir de 87º C. Verificou-se a resistência da bacteriocina bruta frente à tripsina e papaína, mas não frente à proteinase K e pronase E. B. cereus e L. monocytogenes foram utilizadas como bactérias indicadoras para a determinação do modo de ação, após a determinação da dose bactericida de 200 UA mL-1 e 400 UA mL-1 respectivamente. A Cereína 8A demonstrou uma ação inibidora em culturas de Escherichia coli e Salmonella Enteritidis, quando tratadas com EDTA. A atividade esporicida foi observada contra esporos de B. cereus após tratamento com 400 UA ml -1. A análise da biomassa de L. monocytogenes e B. cereus após tratamento com a Cereína 8A, através da espectrofotometria de infravermelho determinou alteração no perfil, correspondente à fração dos ácidos graxos da membrana celular bacteriana. A substância peptídica foi separada por meio da precipitação com sulfato de amônio, extração com 1-butanol e aplicação em coluna de cromatografia por troca iônica tipo Q-Sepharose. A Cereína 8A purificada mostrou maior sensibilidade a proteases e ao calor e um peso molecular de aproximadamente 26 kDa. O espectro ultravioleta foi típico de um polipeptídeo e o espectro de infravermelho indica presença de grupamentos NH, acil e ligações peptídicas na sua estrutura. Uma hipótese do mecanismo de ação seria a desestruturação da membrana celular pela abertura de poros.