Estudi de la relació estructura-funció de les proteïnes CPT1

En aquest treball s’ha analitzat la relació estructura-funció dels enzims CPT1, o Carnitina palmitoïltransferasa 1, que catalitza la reacció de transesterificació dels àcids grassos de cadena llarga a acil-carnitines, per tal que puguin accedir a la matriu mitocondrial i ser oxidats. Aquest enzim es troba estrictament regulat per malonil-CoA, primer intermediari de la síntesi d’àcids grassos, establint-se així una regulació coordinada entre la formació i la degradació de grasses. S’han estudiat els tres isotips de CPT1 descrits fins al moment: CPT1A, CPT1B i CPT1C. Mitjançant l’expressió heteròloga de mutants de CPT1A de rata i CPT1B de porc en el llevat P. pastoris, s’ha estudiat l’efecte sobre la inhibició per malonil-CoA de petits canvis en la seva estructura, per tal de trobar una relació entre la seva funció enzimàtica i la disposició conformacional de la proteïna. Segons els resultats obtinguts, el residu Glu590 de CPT1A de rata estaria impedint la unió de l’inhibidor, mentre que el residu Met593 estaria afavorint aquesta unió. Els estudis amb l’enzim CPT1B de porc demostraren l’existència d’un determinant positiu per la sensibilitat al malonil-CoA en els primers 18 residus de la proteïna, i definiren la posició Glu17 com la responsable de l’alta afinitat a la carnitina i la baixa sensibilitat a la inhibició per malonil-CoA (8). Es clonà i caracteritzà la regió promotora del gen de CPT1C humana, amb la intenció d’analitzar la funcionalitat de putatius elements de resposta identificats in silico. Cap dels elements estudiats resultà ser funcional in vivo. A més, es demostrà que la manca d’activitat catalítica de la proteïna no és deguda a l’extensió C-terminal que presenta respecte els isotips A i B, tot i presentar un alt percentatge d’identitat de seqüència. S’ha amplificat una isoforma humana de CPT1C (Pubmed Acc. Num. AK299866), corresponent a la regió carboxiterminal de la proteïna, que es pretén utilitzar per obtenir el primer cristall de la part soluble d’una proteïna CPT1.     

This work was focused on the study of structure-function relationship of CPT1 enzyme (Carnitine Palmitoyltransferase 1), which catalyzes long-chain transesterification of acyl-CoA to acyl-carnitine, allowing them to be oxidized in the mitochondrial matrix. CPT1 is tightly regulated by malonyl-CoA, first intermediate on fatty acid synthesis, thus existing a coordinated regulation between fat formation and degradation. We have studied the three isotypes of CPT1 described so far: CPT1A, CPT1B and CPT1C. Rat CPT1A and pig CPT1B mutants were expressed in the yeast P. pastoris, in order to analyze the effect of small changes of CPT1 structure on the inhibition of malonyl-CoA. According to the results obtained, the Glu590 residue of rat CPT1A would prevent the binding of the inhibitor, while the residue Met593 would be promoting the union. Studies with the pig CPT1B enzyme showed the existence of a positive determinant for malonyl-CoA sensitivity in the first 18 residues of the protein, and defined residue Glu17 as responsible for high affinity to carnitine and low sensitivity to inhibition by malonyl-CoA (8). In order to analyze the functionality of putative response elements identified in silico, the promoter region of the human CPT1C gene was cloned and characterized. None of the studied elements proved to be functional in vivo. CPT1C sequence presents a C-terminal extension compared to CPT1A and CPT1B isotypes, even though they share a high percentage of sequence identity. We demonstrated that this extension is not responsible of the lack of catalytical activity of the protein. We amplified a CPT1C human isoform (Pubmed Acc. Num. AK299866) corresponding to the carboxiterminal region of the protein, and will use it to obtain the first crystal structure of the soluble region of a CPT1 protein.