Estudo anátomo-clínico do linfonodo sentinela no câncer de mama

Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia - FMB

Punção aspirativa de linfonodo axilar guiada pela ultrassonografia é eficaz como método de predição de acometimento linfonodal em pacientes com câncer de mama?

OBJETIVO: Avaliar a viabilidade e acurácia diagnóstica da ultrassonografia pré-operatória combinada com biopsia por agulha fina (US-PAAF) e do exame clínico da axila em pacientes com câncer de mama.MÉTODOS: Neste estudo prospectivo 171 axilas de pacientes com câncer de mama foram avaliadas pelo exame clínico e ultrassonografia (US) com e sem biopsia por agulha fina (PAAF). Os linfonodos com espessura cortical maior que 2,3 mm na ultrassonografia foram considerados suspeitos e submetidos a US-PAAF.RESULTADOS: A análise de regressão logística não mostrou correlação estatisticamente significativa entre exame clínico e axilas positivas no exame patológico. Em relação à avaliação axilar com US, o risco de achados anatomopatológicos positivos aumentou 12,6 vezes, valor Kappa de Cohen foi de 0,12 para exame clínico, 0,48 para US e 0,80 para US-PAAF. A acurácia foi de 61,4% para o exame clínico, 73,1% para os US e 90,1% para US-PAAF. Análise Receiver Operating Chracteristics (ROC) mostrou que uma espessura de 2,75 mm cortical correspondeu à mais elevada sensibilidade e especificidade na predição metástase axilar (82,7 e 82,2%, respectivamente).CONCLUSÕES: A US combinada com aspiração por agulha fina é mais precisa que o exame clínico na avaliação do status axilar no pré-operatório em mulheres com câncer de mama. Aquelas que são US-PAAF positivo podem ser direcionadas para esvaziamento linfonodal axilar imediatamente, e somente aqueles que são US-PAAF negativos devem ser considerados para biópsia de linfonodo sentinela.

Metástases de carcinoma de mama em cadelas: avaliação da técnica de linfonodo sentinela

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Avaliação da circulação na pesquisa do linfonodo sentinela pós tratamento cirúrgico para o câncer de mama

Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia - FMB

Il ruolo del verde indocianina per la valutazione del linfonodo sentinella

Obiettivo: dimostrare l'equivalenza tra la sensibilità del Verde Indocianina e quella del Tecnezio radioattivo nella detezione del linfonodo sentinella(LS), nei pazienti affetti da carcinoma mammario allo stadio iniziale. Metodi: linfoscintigrafia con Tc99m-marcato, attraverso Gammacamera e con Verde Indocianina, attraverso Photo Dinamic Eye, per la detezione del LS. Utilizzo della sonda Gamma Probe per la discriminazione dei linfonodi radioattivi da quelli non radioattivi. Analisi statistica dei dati. Risultati: sono stati studiati 200 pazienti per un totale di 387 linfonodi asportati; la sensibilità del ICG risulta essere del 98,09%. Studi statistici hanno confermato la non significatività dei parametri di BMI, taglia mammaria, dose iniettata, tempo iniezione-incisione per il rintracciamento del numero corretto di linfonodi (al massimo 2). Conclusioni: l'elevata sensibilità del ICG permette di affermare l'equivalenza tra la capacità di detezione dei LS con le due sostanze(Tc e ICG). A livello operativo la tecnica con ICG facilita l'asportazione del LS. Data la non significatività della dose di ICG iniettata per la detezione del numero corretto di linfonodi, clinicamente conviene iniettare sempre la dose minima di farmaco.

Análise da expressão de APE1 após estresse oxidativo induzido em células proficientes e deficientes na via de reparo por excisão de nucleotídeos.

Riboflavin is a vitamin very important in aerobic organisms, as a precursor of many coenzymes involved in the electron transporter chain. However, after photosensitization of riboflavin with UV or visible light, it generates reactive oxygen species (ROS), which can oxidize the DNA. The repair of oxidative lesions on DNA occurs through the base excision repair pathway (BER), where APE1 endonuclease plays a central role. On the other hand, the nucleotide excision repair pathway (NER) repairs helix-distorting lesions. Recently, it was described the participation of NERproteins in the repair of oxidative damage and in stimulation of repair function fromAPE1. The aim of this research was to evaluate the cytotoxic effects of photosensitized riboflavin (RF*) in cells proficient and deficient in NER, correlating with APE1 expression. For this propose, the cells were treated with RF* and it was performed the cell viability assay, extraction of whole proteins, cells fractionation, immunoblotting, indirect immunofluorescence and analysis of polymorphisms of BER gens. The results evidenced that cells deficient in XPA and CSB proteins were more sensitive to RF*. However, XPC-deficient cells presented similar resistance to MRC5- SV cells, which is proficient in NER. These results indicate that XPA and CSB proteins have an important role on repair of oxidative lesions induced by RF*. Additionally, it was evidenced that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in BER enzymes may influence in sensitivity of NER-deficient cell lines. Concerning the APE1 expression, the results showed that expression of this protein after treatment with RF* only changed in XPC-deficient cells. Though, it was observed that APE1 is recruited and is bound to chromatin in MRC5-SV and XPA cells after treatment with RF*. The results also showed the induction of DNA damage after treatment with RF*, through the analysis of-H2AX, since the treatment promoted an increase of endogenous levels of this phosphorylated protein, which acts signaling double strand-break on DNA. On the other hand, in XPC-deficient cells, regardless of resistance of RF*, the endogenous levels of APE1 are extremely reduced when compared with other cell lines and APE1 is not bound to chromatin after treatment with RF*. These results conclude that RF* was able to induce cell death in NERdeficient cells, where XPA and CSB cells were more sensitive when compared with MRC5-SV and XPC-deficient cells. This last result is potentially very interesting, since XPC-deficient cell line presents low levels of APE1. Additionally, the results evidenced that APE1 protein can be involved in the repair of oxidative damage induced by RF*, because APE1 is recruited and bound strongly to chromatin after treatment.

Relação dos sistemas de reparo de DNA em Escherichia coli K-12 com resistência a antibióticos, características adesivas e formação de biofilme

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são geradas durante o metabolismo celular normal e podem produzir vários danos oxidativos no DNA, tais como lesões nas bases nitrogenadas ou sítios apurínico/apirimidínico (AP). Essas lesões podem acarretar acúmulo de sítios de mutações, caso esses danos não sejam reparados. Entretanto, as bactérias possuem vários mecanismos de defesa contra as ERO que desempenham um importante papel na manutenção da fisiologia. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar se sistemas enzimáticos, como o reparo por excisão de bases (BER), sistema SOS e SoxRS, interferem em respostas como a sensibilidade aos antibióticos, aderência das células bacterianas a superfícies bióticas ou abióticas e formação de biofilme. Os mutantes utilizados no presente estudo são todos derivados de Escherichia coli K-12 e os resultados obtidos mostraram que, dos mutantes BER testados, o único que apresentou diferença no perfil de sensibilidade aos antimicrobiamos em relação à cepa selvagem (AB1157) foi o mutante xthA- (BW9091), deficiente em exonuclease III. No teste de aderência qualitativo realizado com linhagem de células HEp-2 (originária de carcinoma de laringe humana) foi observado que onze cepas da nossa coleção, apresentaram um padrão denominando like-AA, contrastando com o que era esperado para as cepas de E. coli utilizadas como controle negativo, que apresentam aderência discreta sem padrão típico. A aderência manose-sensível via fímbria do tipo I avaliada nesse estudo mostrou que essa fimbria, possui um papel relevante na intensidade da aderência e filamentação nessas cepas estudas. A filamentação é uma resposta SOS importante para que o genoma seja reparado antes de ser partilhado pelas células filhas. Além disso, com relação à formação de biofilme, oito cepas apresentaram um biofilme forte sendo que essa resposta não foi acompanhada pelo aumento da intensidade de filamentação. Nossos resultados em conjunto sugerem o envolvimento de estresse oxidativo na definição de parâmetros como sensibilidade a antimicrobianos, padrão e intensidade de aderência, filamentação e formação de biofilme nas amostras de E. coli K-12 avaliadas neste trabalho. Sugerimos que a aderência gera estresse oxidativo causando danos no DNA, o que leva a indução do sistema SOS resultando na resposta de filamentação observada.

Avaliação da toxicidade da emodina e sua associação com radiação ultravioleta A em cepas de Escherichia coli e células da linhagem A549

A emodina é uma antraquinona estruturalmente semelhante à aloe-emodina e ambas tem sido apontadas como capazes de causar lesões oxidativas pela produção de ERO. Sua presença em produtos dermocosméticos e de higiene pessoal, associada às informações de que a fotoativação de antraquinonas levaria ao aumento de lesões oxidativas causadas por ERO, torna relevante o estudo da associação da emodina com a radiação UVA. O objetivo desse trabalho foi avaliar a citotoxicidade induzida pela associação da emodina com doses subletais de radiação UVA, em células de Escherichia coli (selvagem e cepas deficientes em enzimas do BER), através de ensaios de sobrevivência bacteriana (taxa de dose de UVA igual a 20J/m/s, totalizando 108kJ/m ao final de 90min de experimento), e em células da linhagem A549 pela exclusão do corante azul de tripan e sobrevivência clonogênica(taxa de dose de UVA igual a 20J/m/s, totalizando 36kJ/m ao final de 30min de experimento). Além disso, a genotoxicidade desses agentes foi estudada por eletroforese em gel de agarose de DNA plasmidial (taxa de dose de UVA igual a 16J/m/s, totalizando 57,6kJ/m ao final de 60min de experimento). De acordo com os resultados: i) Concentrações iguais ou abaixo de 5,55mM de emodina não alteraram a sobrevivência em nenhuma das cepas estudas; ii) As proteínas Xth e Fpg parecem ter um papel importante no reparo das lesões causadas pela emodina, em altas concentrações, sugerindo a participação do reparo por excisão de bases (BER) nesse processo; iii) A associação da emodina com a radiação UVA se mostrou citotóxica em todas as cepas de E. coli; iv) O gene nfo foi o mais importante na resistência bacteriana às lesões induzidas pela associação dos dois agentes, reforçando o envolvimento do BER e indicando uma possível participação do reparo por incisão de nucleotídeos (NIR); v) A emodina parece ter interagido com o DNA plasmidial, alterando seu padrão de migração no gel de agarose; vi) Em células da linhagem A549, a emodina causa efeitos tóxicos imediatos que parecem ser reparados ao longo do tempo. Porém, quando a droga permaneceu por 24 horas em contato com as células, houve uma diminuição na sobrevivência celular que parece ser dosedependente; vii) As concentrações de 10μM e 25μM de emodina, quando associadas ao UVA, se mostraram responsáveis pela redução de mais de 50% na sobrevivência nas células A549, chegando a 100% de morte quando a concentração de emodina foi de 50μM; viii) A radiação UVA potencializou os efeitos citotóxicos da emodina, nos 2 modelos experimentais do presente estudo, indicando que a interação da emodina com a radiação UVA seja genotóxica e portanto prejudicial à saúde.

Estudo da resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis

Os fibrócitos foram inicialmente identificados pelo seu recrutamento rápido para os tecidos lesionados e por atuar diretamente na resposta imune através do reconhecimento, apresentação antigênica e produção de citocinas e quimiocinas. Segundo Grab (2004) fibrócitos podem participar da resposta imune na leishmaniaose e por isso no presente estudo propomos analisar a resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por L. (L.) amazonensis. Para os experimentos in vivo camundongos C57BL/6 e knockout para o receptor TLR-2 foram inoculados na derme auricular com 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e 1, 7, 15 dias após a infecção as regiões de inóculo e os linfonodos foram retirados e processados para citometria de fluxo. Para os experimentos in vitro fibrócitos foram obtidos de mononucleares do sangue periférico de camundongos C57BL/6. Os fibrócitos foram avaliados quanto às suas características morfológicas e fenotípicas, infecção, expressão de MHC-II/B7-1/B7-2 e ativação de linfócitos T CD4+. As análises na região de inóculo mostraram o aumento no percentual de fibrócito na derme de camundongos após 15 dias de infecção tanto em animais C57BL/6 quanto em animais KO TLR-2. Neste sítio, os fibrócitos produziram citocinas e expressaram MHC-II, B7-1 e B7-2 podendo participar da resposta imune. As análises no linfonodo mostraram a existência de um alto percentual de fibrócitos nos animais controle, contudo, após infecção este percentual foi reduzido. Após infecção verificamos que os fibrócitos de animais WT C57BL/6 foram capazes de produzir as citocinas IL-4, IL-10 e IFN- durante o primeiro dia. Entretanto, na ausência de TLR-2 os fibrócitos presentes no linfonodo produziram TNF-α e IFN- que podem estar relacionadas com a ativação celular e aumento da capacidade de apresentação antigênica destas células durante a infecção. No linfonodo verificamos que os fibrócitos podem participar da apresentação antigênica após a infecção por L. (L.) amazonensis. Contudo, nos linfonodos de animais WT C57BL/6 observamos a redução significativa no percentual destas células expressando MHC-II e B7-1, o que pode estar relacionada a presença do TLR-2. Nos ensaios in vitro fibrócitos de camundongos C57BL/6 apresentaram alta capacidade endocítica, eliminaram os parasitas nas primeiras 24 horas de infecção, expressaram MHC-II/B7-1/B7-2 e foram capazes de ativar linfócitos T CD4+. Com isso, nossos resultados sugerem que os fibrócitos podem atuar na resposta celular e na apresentação antigênica durante a infecção por L. (L.) amazonensis, contudo estas funções podem ser moduladas pela participação do TLR-2 e pelo microambiente onde estes se encontram.

Estudo das alterações biológicas causadas pela aderência de cepas de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno relacionado ao desenvolvimento de quadros de diarréia aguda ou persistente. A resposta inflamatória induzida por EAEC está relacionada à liberação de interleucina 8, que atua estimulando a transmigração de neutrófilos através do epitélio. Os macrófagos, de forma similar aos neutrófilos, são células fagocíticas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Neste trabalho, avaliamos as consequências da interação de diferentes cepas clínicas com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937. Todas as cepas testadas apresentaram filamentos nos testes de aderência aos macrófagos, diferentemente do que ocorre na interação com outras linhagens celulares como HEp-2, T84 e Caco-2. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, sendo utilizado como cofator de enzimas e que também pode participar da geração de ERO através da reação de Fenton. Considerando-se a possibilidade de que o H2O2 produzido pelos macrófagos possa gerar radical hidroxil através da reação de Fenton, testes de aderência foram realizados com as amostras cultivadas na presença do captador de ferro 2,2-dipiridil. Tal fato não suprimiu a formação de filamentos, entretanto diminuiu a aderência das cepas EAEC 042 e 17-2. Com o objetivo de produzir uma resposta adaptativa ao H2O2, as culturas bacterianas foram pré-tratadas com uma dose sub-letal de H2O2 por 60 minutos antes de aderirem aos macrófagos. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento também não inibiu o aparecimento de filamentos em relação às culturas não tratadas. Além disto, foi observado que o pré-tratamento com o H2O2 reduziu a aderência das amostras de EAEC ao tapete celular. A filamentação é uma das respostas SOS, induzida pela presença de danos e/ou bloqueio na síntese da molécula de DNA. Com o objetivo de verificar se o H2O2 produzido pelos macrófagos estaria causando danos induzindo o sistema SOS e a filamentação bacteriana, foram realizados testes de viabilidade com mutantes derivados de E. coli K12 deficientes em enzimas do reparo por excisão de bases (BW535) e na resposta SOS (DM49). Nossos resultados mostram que os mutantes apresentaram os níveis de sobrevivência semelhantes ao observado para cepa selvagem isogênica (AB1157). Todos estes resultados em conjunto indicam que o H2O2 não é o indutor da filamentação nos testes de aderência. Macrófagos ativados apresentam ação microbicida através da ação da enzima indolamina dioxigenase (IDO), associada à redução do aminoácido L-triptofano. Desta forma, realizamos testes qualitativos de aderência de EAEC aos macrófagos suplementando o meio de interação com este aminoácido. Nossos resultados mostram que a adição de triptofano ao meio de interação reduz o número de filamentos por campo. Desta forma, aventamos a hipótese de que a depleção do triptofano seja responsável pela indução de resposta SOS, tendo como conseqüência a filamentação das bactérias.

Efeitos genotóxicos e indução do SOS em mutantes derivados de Escherichia coli K-12 durante o processo de interação com superfícies bióticas e abióticas

A célula epitelial é o primeiro contato entre os micro-organismos e o hospedeiro. Essa interação pode levar a produção de diversas citocinas, quimiocinas, moléculas inflamatórias e também estimular a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste trabalho avaliamos se a interação com as células HEp-2 poderia ser genotóxica para os mutantes derivados de Escherichia coli K-12 deficientes em algumas enzimas que fazem parte do sistema de reparo por excisão de base (BER). Além disto, avaliamos a expressão do sistema SOS, que é induzido pela presença de danos no genoma bacteriano. Os resultados obtidos mostraram a presença de filamentos, na interação com células HEp-2, principalmente, no mutante xthA (BW9091) e no triplo mutante xthA nfo nth (BW535). Quando a interação foi quantificada na ausência da D-manose, observamos um aumento das bactérias aderidas. Além disto, a quantidade e o tamanho dos filamentos também aumentaram, mostrando que as adesinas manose-sensíveis estavam envolvidas na filamentação bacteriana. Para comprovar se o aumento da filamentação observada neste ensaio foram uma consequência da indução do sistema SOS, desencadeada pela interação com as células HEp-2, quantificamos a expressão do SOS, na presença e na ausência da D-manose. De fato, observamos que a indução do SOS na ausência da D-manose foi maior, quando comparada, com o ensaio realizado na presença de D-manose. Além disto, observamos que a ausência de xthA foi importante para o aumento da filamentação observada na ausência de D-manose. Diante destes resultados, verificamos se a resposta de filamentação ocorreria quando as bactérias interagiam com uma superfície abiótica como o vidro. Observamos também inúmeros filamentos nos mutantes BER, BW9091 e BW535, quando comparados a cepa selvagem AB1157. Essa filamentação foi associada à indução do SOS, em resposta a interação das bactérias com o vidro. Em parte a filamentação e a indução do SOS observadas na interação ao vidro, foram associadas à produção de ERO. Quantificamos também o número de bactérias aderidas e observamos que as nossas cepas formavam biofilmes moderados. Contudo, a formação de biofilme dependia da capacidade da bactéria induzir o sistema SOS, tanto em aerobiose como em anaerobiose. A tensão do oxigênio foi importante para interação dos mutantes BER, uma vez que os mutantes BW9091 e BW535 apresentaram uma quantidade de bactérias aderidas menor em anaerobiose. Contudo, a diminuição observada não estava vinculada a morte dos mutantes BER. Também realizamos microscopia de varredura na cepa selvagem e nos mutantes, BW9091 e BW535 e confirmamos que as três cepas formavam biofilmes tanto em aerobiose como em anaerobiose. Observamos uma estrutura sugestiva de matriz extracelular envolvendo os biofilmes da cepa selvagem AB1157 e do mutante BW9091. No entanto, a formação desta estrutura por ambas as cepas dependia da tensão de oxigênio, pois nos biofilmes formados em anaerobiose essa estrutura estava ausente. Em conclusão, mostramos que na interação das bactérias com a superfície biótica e abiótica, ocorreu lesão no genoma, com indução do SOS e a resposta de filamentação associada.

Estudo do potencial anti-inflamatório e antiartrítico de Pterodon polygalaeflorus e dos seus mecanismos de ação

O gênero Pterodon pertence à família das Fabaceae e inclui quatro espécies nativas do Brasil: P. emarginatus Vog., P. apparicioi Pedersoli, P. abruptus Benth. e a espécie objeto deste estudo P. polygalaeflorus Benth.. Seus frutos são utilizados pela medicina popular devido às propriedades antirreumática, analgésica, anti-inflamatória, dentre outros. O objetivo deste trabalho foi avaliar a espécie Pterodon polygalaeflorus quanto ao seu potencial anti-inflamatório, antiartrítico e toxicológico, através da análise de seus efeitos em modelos in vitro e in vivo. Os extratos EEPpg, EHPpg e EDPpg reduziram (p<0,01) a produção in vitro de NO, por macrófagos ativados por LPS, com baixa citotoxicidade e diminuíram a celularidade (p<0,05) no exsudato inflamatório no modelo de inflamação in vivo conhecido como air pouch. O extrato mais ativo (EHPpg) foi selecionado e submetido a fracionamento em coluna de sílica gel 60 gerando quatro frações. Todas as frações (Fr I-Fr IV) reduziram: a produção de NO (p<0,001) por macrófagos ativados, com baixa ou nenhuma citotoxicidade; a migração de macrófagos in vitro (p<0,01, ensaio de wound healing) e in vivo (p<0,05, peritonite induzida por tioglicolato); e a proliferação de esplenócitos estimulados com Con A (p<0,001). As frações III e IV, mais ativas nos ensaios anteriores, mostraram ação antiartrítica (com 0,02 mg/kg), utilizando o modelo in vivo de artrite induzida por adjuvante completo de Freund (AIA), demonstrada por redução: do índice de edema de pata em 23,7% (Fr III) e 43,95% (Fr IV); das lesões histopatológicas na região tíbio-tarsal típicas de articulações com AIA (p< 0,05); do peso e celularidade do linfonodo e do baço, mas não da celularidade da medula óssea; das subpopulações de linfócitos (CD4+, CD8+ e CD19+) nos linfonodos inguinais, porém com significativo aumento das subpopulações ativadas CD4+CD69+, redução da CD8+CD69+ e aumento de CD19+CD69+ (apenas na Fr III); e redução da população de macrófagos no baço (p<0,001). As frações III e IV mostraram ação imunossupressora em nível celular e molecular, reduzindo (p<0,001) os níveis do mRNA da iNOS, assim como as citocinas IL-1β, TNF-α e IL-10, em nível de mRNA e proteína, em cultura de macrófagos. A expressão do receptor CD14, em macrófagos estimulados por LPS (31,74%), foi inibida apenas pela Fr III. A osteoclastogênese foi inibida pelas frações III e IV, sugerindo uma ação antiartrítica das frações em nível de diferenciação celular para osteoclastos (inibição). Este efeito pode resultar da inibição da expressão do fator de transcrição NFATc1, no caso da Fr III. Por fim, as frações Fr III e Fr IV não apresentaram toxicidade subaguda, potencial mutagênico (teste de Ames) ou genotóxico (teste do micronúcleo). A ausência de toxicidade in vivo das frações ficou demonstrada pela ausência de alteração no peso corporal e de órgãos, nas concentrações séricas de creatinina, ácido úrico, triglicerídeos, colesterol, ALT e ALP, ou de CYP1A1 e GSTs no fígado. Análises fitoquímicas (GC-MS e TLC) mostraram uma grande variedade de terpenos nas frações III e IV, sendo majoritários os furano-diterpenos derivados do vouacapano. O diterpeno isolado, Ppg-01, presente nas frações III (5,12%) e IV (18,47%), reduziu a produção in vitro de NO e o edema de pata induzido por carragenina (p<0,001). Em conjunto, os dados sugerem que o Ppg-01 esteja contribuindo para as ações anti-inflamatórias e imunomoduladoras das frações III e IV, e que estas propriedades estejam associadas aos efeitos antiartríticos observados.

Cancro oral

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Medicina Dentária

Molecular cloning and analysis of Xeroderma pigmentosum group-D (xpd) in zebrafish

Dissertação de mest., Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011

Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.