Análise da expressão de APE1 após estresse oxidativo induzido em células proficientes e deficientes na via de reparo por excisão de nucleotídeos.

Riboflavin is a vitamin very important in aerobic organisms, as a precursor of many coenzymes involved in the electron transporter chain. However, after photosensitization of riboflavin with UV or visible light, it generates reactive oxygen species (ROS), which can oxidize the DNA. The repair of oxidative lesions on DNA occurs through the base excision repair pathway (BER), where APE1 endonuclease plays a central role. On the other hand, the nucleotide excision repair pathway (NER) repairs helix-distorting lesions. Recently, it was described the participation of NERproteins in the repair of oxidative damage and in stimulation of repair function fromAPE1. The aim of this research was to evaluate the cytotoxic effects of photosensitized riboflavin (RF*) in cells proficient and deficient in NER, correlating with APE1 expression. For this propose, the cells were treated with RF* and it was performed the cell viability assay, extraction of whole proteins, cells fractionation, immunoblotting, indirect immunofluorescence and analysis of polymorphisms of BER gens. The results evidenced that cells deficient in XPA and CSB proteins were more sensitive to RF*. However, XPC-deficient cells presented similar resistance to MRC5- SV cells, which is proficient in NER. These results indicate that XPA and CSB proteins have an important role on repair of oxidative lesions induced by RF*. Additionally, it was evidenced that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in BER enzymes may influence in sensitivity of NER-deficient cell lines. Concerning the APE1 expression, the results showed that expression of this protein after treatment with RF* only changed in XPC-deficient cells. Though, it was observed that APE1 is recruited and is bound to chromatin in MRC5-SV and XPA cells after treatment with RF*. The results also showed the induction of DNA damage after treatment with RF*, through the analysis of-H2AX, since the treatment promoted an increase of endogenous levels of this phosphorylated protein, which acts signaling double strand-break on DNA. On the other hand, in XPC-deficient cells, regardless of resistance of RF*, the endogenous levels of APE1 are extremely reduced when compared with other cell lines and APE1 is not bound to chromatin after treatment with RF*. These results conclude that RF* was able to induce cell death in NERdeficient cells, where XPA and CSB cells were more sensitive when compared with MRC5-SV and XPC-deficient cells. This last result is potentially very interesting, since XPC-deficient cell line presents low levels of APE1. Additionally, the results evidenced that APE1 protein can be involved in the repair of oxidative damage induced by RF*, because APE1 is recruited and bound strongly to chromatin after treatment.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

A riboflavina é uma vitamina de fundamental importância em organismos aeróbios, sendo precursora de importantes coenzimas que participam da cadeia transportadora de elétrons. Contudo, após a sensibilização da riboflavina com luz UV ou luz visível, observou-se a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais podem oxidar o DNA. O reparo de lesões oxidativas no DNA ocorre principalmente através da via de reparo por excisão de bases (BER), na qual a endonuclease APE1 exerce um papel central. Por sua vez, a via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua reparando lesões no DNA que causam distorções na dupla hélice. Recentemente tem sido descrito a participação da via NER na remoção de danos oxidativos e na estimulação da função de reparo de APE1. Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi analisar os efeitos citotóxicos da riboflavina fotossensibilizada (RF*) em células proficientes e deficientes na via NER, correlacionando à expressão de APE1. Para tanto, as linhagens proficientes e deficientes no NER foram submetidas ao tratamento com RF* e em seguida foram realizados os ensaios de viabilidade celular, extração de proteínas totais, fracionamento celular, immunoblotting, imunofluorescência indireta e a análise de polimorfismos em genes da via BER. Os resultados evidenciaram perfis de sensibilidade distintos ao estresse oxidativo induzido pela RF*, onde as linhagens XPA e CSB foram mais sensíveis, enquanto a linhagem XPC mostrou resistência similar à linhagem MRC5-SV, a qual é proficiente na via NER. Esses resultados indicam que as proteínas XPA e CSB possuem um importante papel no reparo das lesões oxidativas induzidas pela RF*. Além disso, foi demonstrado que polimorfismos em um único nucleotídeo (SNPs) em enzimas do BER podem influenciar na sensibilidade dessas linhagens. Em relação às análises dos níveis de expressão de APE1, os resultados mostraram que houve alteração na expressão dessa proteína após o tratamento com RF* somente na linhagem deficiente em XPC. Porém, observou-se que APE1 é recrutada e se torna ligada à cromatina após o tratamento nas linhagens MRC5-SV e XPA. Os resultados também comprovaram a indução de danos após o tratamento com RF* através do estudo da proteína-H2AX, pois o tratamento provocou um aumento nos níveis endógenos desta proteína fosforilada, a qual atua na sinalização de quebras de fita dupla no DNA. Porém, na linhagem XPC, além de ter sido observado uma curva de sobrevivência semelhante à linhagem MRC5-SV, os níveis endógenos de APE1 são significativamente reduzidos quando comparados com as outras linhagens e APE1 não se encontra ligada à cromatina após tratamento com RF*. Conclui-se que a RF* foi capaz de induzir a morte celular em linhagens deficientes no sistema de reparo por excisão de nucleotídeos, onde as linhagens XPA e CSB foram mais sensíveis quando comparadas à linhagem normal MRC5-SV e à linhagem XPC. Este último resultado é potencialmente interessante, considerando que a linhagem XPC apresenta baixos níveis protéicos de APE1. Adicionalmente, os resultados comprovaram que a proteína APE1 pode estar envolvida no reparo de danos oxidativos causados pela RF*, já que APE1 é recrutada na cromatina e se liga fortemente a esta após o tratamento.