Phosphorylation of the human leukemia inhibitory factor (LIF) receptor by mitogen-activated protein kinase and the regulation of LIF receptor function by heterologous receptor activation.

We used a bacterially expressed fusion protein containing the entire cytoplasmic domain of the human leukemia inhibitory factor (LIF) receptor to study its phosphorylation in response to LIF stimulation. The dose- and time-dependent relationships for phosphorylation of this construct in extracts of LIF-stimulated 3T3-L1 cells were superimposable with those for the stimulation of mitogen-activated protein kinase (MAPK). Indeed, phosphorylation of the cytoplasmic domain of the low-affinity LIF receptor alpha-subunit (LIFR) in Mono Q-fractionated, LIF-stimulated 3T3-L1 extracts occurred only in those fractions containing activated MAPK; Ser-1044 served as the major phosphorylation site in the human LIFR for MAPK both in agonist-stimulated 3T3-L1 lysates and by recombinant extracellular signal-regulated kinase 2 in vitro. Expression in rat H-35 hepatoma cells of LIFR or chimeric granulocyte-colony-stimulating factor receptor (G-CSFR)-LIFR mutants lacking Ser-1044 failed to affect cytokine-stimulated expression of a reporter gene under the control of the beta-fibrinogen gene promoter but eliminated the insulin-induced attenuation of cytokine-stimulated gene expression. Thus, our results identify the human LIFR as a substrate for MAPK and suggest a mechanism of heterologous receptor regulation of LIFR signaling occurring at Ser-1044.

Avaliação do antagonismo do efeito do sódio sobre o tratamento de água residuária de Charqueada com elevada salinidade em reator anaeróbio de manta de lodo (UASB)

As águas residuárias provenientes da indústria do charque são conhecidas por apresentarem elevado teor de cloreto de sódio, aliado a grandes concentrações de matéria orgânica proveniente do sangue liberado ao longo do processo industrial. Esse tipo de água residuária apresenta potencial para degradação biológica, contudo, o cloreto de sódio, em concentração elevada, pode inibir a atividade dos microrganismos e, em alguns casos, levar sistemas biológicos à falência. No presente trabalho, foi avaliada a viabilidade de degradação anaeróbia de efluente sintético de Charqueada contendo elevado teor de cloreto de sódio, em reator anaeróbio tipo UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket), em escala de laboratório. Foram utilizados 4 reatores, alimentados com água residuária sintética com características similares à água residuária de Charqueada. O reator 1 foi utilizado como controle, o reator 2 recebeu NaCl e os demais (3 e 4) foram operados na presença de NaCl acrescidos de: betaína e potássio com cálcio, respectivamente. Os compostos citados são conhecidos como antagonizantes, por possuirem capacidade de minimizar o efeito inibitório do sódio sobre o processo de digestão anaeróbia. Os reatores foram inoculados com lodo de reator UASB e submetidos à concentração de 5000 mg/L de matéria orgânica, como DQO. A carga orgânica aplicada foi de 5 Kg/m3.d e os reatores não suportaram tal carga. Reiniciou-se a operação com aumento progressivo da DQO de 500 a 2000 mg/L resultando em cargas orgânicas de 0,5 a 2,0 Kg/m3.d, respectivamente. Após estabilização dos reatores, iniciou-se a fase de introdução de cloreto de sódio (1.500 a 13.500 mg/L) e antagonizantes com aumento progressivo a cada fase. Na presença ou ausência de antagonizantes, os reatores 2, 3 e 4 não tiveram o desempenho alterado até a concentração de NaCl de 6000 mg/L. Na presença de 9000 mg/L de NaCl, a betaína se mostrou pouco efetiva como soluto compatível no reator 3 e os antagonizantes do reator 4, potássio e cálcio, apresentaram efeitos estimulatórios. As morfologias encontradas ao longo do experimento foram cocos, víbrios, bacilos, sarcinas, além de morfologias semelhantes a Methanosarcina sp. e Methanosaeta sp. O aumento da concentração de cloreto de sódio provocou a redição da população de Arqueas.

Desenvolvimento de uma plataforma modelo para a busca de ligantes com potencial leishmanicida baseado na inibição seletiva da enzima diidroorotato desidrogenase

As doenças tropicais negligenciadas (DTNs) causam um imenso sofrimento para a pessoa acometida e em muitos casos podem levar o indivíduo a morte. Elas representam um obstáculo devastador para a saúde e continuam a ser um sério impedimento para a redução da pobreza e desenvolvimento socioeconômico. Das 17 doenças desse grupo, a leishmaniose, incluindo a leishmaniose cutânea, tem grande destaque devido sua alta incidência, os gastos para o tratamento e as complicações geradas em processos de coinfecção. Ainda mais agravante, os investimentos direcionados ao controle, combate e principalmente a inovação em novos produtos é ainda muito limitado. Atualmente, a academia tem um importante papel na luta contra essas doenças através da busca de novos alvos terapêuticos e também de novas moléculas com potencial terapêutico. É nesse contexto que esse projeto teve como meta a implantação de uma plataforma para a identificação de moléculas com atividade leishmanicida. Como alvo terapêutico, optamos pela utilização da enzima diidroorotato desidrogenase de Leishmania Viannia braziliensis (LbDHODH), enzima de extrema importância na síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, cuja principal função é converter o diidroorotato em orotato. Esta enzima foi clonada, expressa e purificada com sucesso em nosso laboratório. Os estudos permitiram que a enzima fosse caracterizada cineticamente e estruturalmente via cristalografia de raios- X. Os primeiros ensaios inibitórios foram realizados com o orotato, produto da catálise e inibidor natural da enzima. O potencial inibitório do orotato foi mensurado através da estimativa do IC50 e a interação proteína-ligante foi caracterizada através de estudos cristalográficos. Estratégias in silico e in vitro foram utilizadas na busca de ligantes, através das quais foram identificados inibidores para a enzima LbDHODH. Ensaios de validação cruzada, utilizando a enzima homóloga humana, permitiram identificar os ligantes com maior índice de seletividade que tiveram seu potencial leishmanicida avaliado in vitro contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania braziliensis. A realização do presente projeto permitiu a identificação de uma classe de ligantes que apresentam atividade seletiva contra LbDHODH e que será utilizada no planejamento de futuras gerações de moléculas com atividade terapêutica para o tratamento da leishmaniose. Além disso, a plataforma de ensaios otimizada permitirá a avaliação de novos grupos de moléculas como uma importante estratégia na busca por novos tratamentos contra a leishmaniose

Enterobacteriaceae produtoras de carbapenemases : um novo desafio no controlo da infecção hospitalar

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Elaboração de proposta de manual de controlo interno do Grupo Derovo

Na conjuntura atual o tema da mitigação do risco está presente na maioria das organizações, bem como na Sociedade atual. Para tal, é necessário que as organizações adotem o controlo interno mais adequado e mais ajustado para mitigar esses riscos. O Órgão de Gestão de qualquer entidade económica (pública ou privada) tem a responsabilidade de assegurar um sistema eficaz de controlo interno que permita garantir a gestão da Organização de uma forma eficaz e eficiente, de acordo com as normas legais em que essa organização se enquadra e fomente os valores éticos. Existem algumas frameworks que ajudam as organizações na conceção e manutenção do SCI, contudo a que marcou profundamente o desenvolvimento e a relevância do controlo interno foi o ICIF – internal control integrated Framework do COSO. Procura-se no presente trabalho de projeto, proporcionar uma reflexão sobre o crescente papel do controlo interno no seio das organizações, nomeadamente ilustrando esse papel através da implementação de um sistema de controlo interno numa organização em pleno crescimento. Este trabalho baseou-se no estudo de um caso através da análise da realidade do Grupo Derovo, identificando e caracterizando a empresa e a sua atividade, bem, como os procedimentos de controlo interno adotados. Procedeu-se no âmbito deste trabalho à apresentação de uma proposta de implementação de um manual de controlo interno, com base na metodologia da framework Coso, tendo sido efetuado o levantamento dos controlos aos processos, quer formais ou informais, existentes nas áreas chave do negócio, de forma a permitir clarificar os procedimentos de controlo, atualizá-los, otimizando assim todo sistema de controlo interno, permitindo desta forma a condução mais eficiente e eficaz do negócio, através da identificação dos riscos associados a cada processo e formas de mitigação do risco e a clara identificação da responsabilidade, autoridade e suporte documental de controlo dos processos de cada área objeto de estudo.

O controlo interno e a implementação de auditorias online no Safex em contexto de e-governance: Tecnologias, desafios e oportunidades

O presente Relatório Detalhado de Atividade Profissional é apresentado no âmbito da obtenção do Grau de Mestre dos Oficiais do Exército licenciados pré-Bolonha pela Academia Militar na Área específica de Administração Militar. A sua redação e estruturação tem por base o definido na NEP 520 e NEP 517/1ª da AM, para esta tipologia de trabalhos, tendo o autor, optado por desenvolver um tema no âmbito da sua atividade profissional, considerado como pioneiro e inovador. O Tenente-Coronel de Administração Militar do Exército Português, Luís Miguel Gonçalves, nasceu a 25 de Novembro de 1971. Do seu percurso académico e formativo, consta frequência pré-Universitária, em estabelecimento militar de ensino, no Instituto Militar dos Pupilos do Exército, na área de Contabilidade e Administração; a Licenciatura em Ciências Militares, na especialidade de Administração Militar, pela Academia Militar, em 1995, com a Classificação final de 13,58 valores; o tirocínio para Oficiais de Administração Militar, com a nota final de 15,38 valores; o Curso de Operações Irregulares, tendo obtido a classificação de 17,67 valores; o Curso de Promoção a Capitão, com 16,63 valores; e o Curso de Promoção a Oficial Superior do Instituto de Altos Estudos Militares, com a classificação final de 14,50 valores. No âmbito da formação de pós-graduação, tem averbado créditos no módulo de Metodologia de Investigação Cientifica, pela Academia Militar, no Ano Letivo 2013/14, com a classificação final de 16,00 valores. Para além destes, o Environmental Course For Portugal – NATO School/ SHAPE; formação em Gestão de Projetos/ Exército - Microsoft Enterprise Project Management; o Curso de Formação Pedagógica Inicial de Formadores do Instituto de Emprego e Formação Profissional, com Homologação das Competências Pedagógicas; e vários certificados de formações no âmbito da Contabilidade, Administração, Finanças Públicas e Auditorias Financeiras, atribuídas pela Direção de Finanças do Exército e pelo Instituto de Gestão e Administração Pública do Porto. Ao longo dos 25 anos de serviço prestado ao Exército Português, como Oficial de Administração Militar, desempenhou diversos cargos e funções de Comando e Chefia, em várias UEO, nas áreas setoriais e funcionais, da formação, da instrução, da componente operacional, da logística, do pessoal, das finanças públicas, das inspeções e auditorias, da gestão e da Administração Militar. Atualmente o Tenente-Coronel Miguel Gonçalves, desempenha as Funções de Comandante de Batalhão na Escola dos Serviços. Para além dos cargos e funções averbadas no seu Curriculum Vitae detalhado, constituiu em 1996 o Núcleo Logístico de Projeção, Implantação, Acompanhamento e Ajuda Técnica no âmbito do emprego dos meios táticos e operacionais da Área de Responsabilidade FND/ IFOR na Bósnia-Herzegovina (Jugoslávia). Tem publicado na Revista da Administração Militar, vários artigos no âmbito da logística operacional, na função de combate Apoio de Serviços. Na área da formação, foi orientador e supervisor de vários trabalhos, individuais e de grupo aos cursos de promoção a capitão; e constitui-se como elemento primariamente responsável pelo planeamento e implementação dos primeiros cursos no Exército, com formação certificado pela Agência Nacional para a Qualificação e Ensino Profissional, I.P., do Sistema Nacional de Qualificações, certificação inserida no Catálogo Nacional de Qualificações. Na área Inspetiva, integrou várias equipas de Inspeção-Geral do Exército, como inspetor responsável pelas áreas de Logística e Finanças, bem como as de Inspetor, para a área dos recursos humanos – Despesas com Pessoal, nas equipas de inspeção do Comando do Pessoal do Exército. No desempenho das funções de Auditor Financeiro do Centro de Finanças do Comando do Pessoal, realizou diversas auditorias financeiras às UEO do Comando do Pessoal, na sua dependência, tendo desenvolvido e implementado um sistema pioneiro e inovador de monitorização e controlo interno, de auditorias “Online” com análise e reporte mensal, às contas das UEO do Comando do Pessoal, tendo em vista a validação das Demonstrações Financeiras para a Conta de Gerência Anual do Exército. A escolha do tema, “O Controlo Interno e a implementação de Auditorias Online no SAFEx em contexto de e-Governance: Tecnologias, desafios e oportunidades” surge na sequência da implementação destes procedimentos pelo autor, numa altura em que o Exército entrava em operativo com o Sistema Integrado de Gestão (SIG/DN), tendo sido à data reconhecido publicamente pelo TGEN Comandante do Pessoal do Exército, como sendo um procedimento inovador, com notáveis vantagens para a eficiência e eficácia do sistema administrativo-financeiro do Comando do Pessoal e consequentemente do Exército.

Controlo fuzzy semi-activo para aparelhos de amortecimento variável na protecção sísmica

Trabalho apresentado no 10º Congresso Nacional de Sismologia e Engenharia Sísmica, 20-22 abril de 2016, Ponta Delgada, Açores, Portugal

Projeto de uma antena para controlo wireless de um robot

A comunicação e transmissão de informação sem fios tornou - se uma realidade cada vez mais utilizada pelas sociedades contemporâneas. A nível profissional, as forças armadas de cada país acharam conveniente modernizar os seus meios, por forma a aumentar a eficiência e a segurança em determinadas tarefas. Nesse sentido, o Exército português adquiriu um robot (ROVIM) cuja função é desempenhar ações de reconhecimento e vigilância de modo a obter informações de forma segura. O objetivo desta dissertação é dimensionar e construir uma antena para controlo wireless do robot (ROVIM). As especificações técnicas desta antena requerem dois modos de operação, um com uma largura de feixe larga e outro com uma largura de feixe estreita. Para alcançar esses objetivos dimensionou-se e construiu-se duas antenas. Na dissertação são construídas duas antenas, a primeira é uma antena Yagi – Uda convencional e a segunda é uma antena com uma estrutura nova que permite a regulação do ganho e da largura de feixe a -3 dB. A primeira antena será o modelo base da segunda antena, que apresenta a inovação do controlo das caraterísticas de radiação. Esse controlo é possível através da introdução de díodos e do respetivo circuito de polarização na estrutura da antena. Inicialmente, as antenas foram dimensionadas e simuladas recorrendo ao programa de simulação CST MWS, de modo a operarem na banda dos 2,4 GHz. Após a construção das antenas, as caraterísticas de radiação foram medidas recorrendo à câmara anecoica e ao network analyzer, permitindo assim a comparação dos resultados medidos com os simulados.

Utilização do pato de Pequim no controlo de infestantes em milho biológico

Resumo A presente dissertação visou avaliar o efeito da utilização do pato de Pequim no controlo de infestantes em milho biológico em comparação com o método clássico da sacha e da sacha/amontoa, avaliando a percentagem de cobertura das infestantes no solo e a produtividade do milho. Para além disso, pretendeu-se, ainda, perceber em que estádio vegetativo do milho os patos já não provocavam danos consideráveis na cultura. A investigação decorreu entre maio e outubro de 2015, em Coimbra, na superfície agrícola da ESAC, em 0,2 ha da área certificada em Agricultura Biológica, utilizando milho da variedade regional Pigarro. Os patos foram adquiridos com 4 semanas e abatidos às 12 semanas, tendo-se avaliado o seu crescimento nesse período. O pastoreio com patos, em diferentes estados vegetativos da cultura (Ve, V3 e V5 - germinação e emergência, três e cinco folhas completamente desenvolvidas, respetivamente), não permitiu afirmar com rigor qual o estádio vegetativo em que os animais já não provocavam danos. Analisando e comparando o pastoreio com patos após a 1ª sacha, após a sacha/amontoa e o método clássico, concluiu-se que tanto a cobertura do solo pelas infestantes quanto a produção de milho Pigarro (kg/ha) não variaram significativamente, para α = 0,05, após realização de análise de variância de fator único. Os resultados obtidos, embora preliminares e carecendo de continuidade de estudos, permitem, no entanto, indiciar que as opções ensaiadas podem vir a substituir o método clássico e serem alternativas válidas no combate às infestantes em milho biológico. PALAVRAS-CHAVE: Pato de Pequim; Milho biológico; Infestantes; Cobertura; Pastoreio. iii Abstract This dissertation aimed to evaluate the effect of using the Peking duck for weed control in organic corn compared to the classical method of hoeing and weeding / earthing up, assessing the percentage of coverage of weeds in soil and corn yield. Furthermore, it was also intended to realize in what corn's vegetative stage, ducks no longer caused considerable damage to the crop. The research took place between May and October 2015, in Coimbra, in the ESAC's agricultural area of 0.2 ha certified in organic farming, using corn's regional variety, Throat clearing. The ducks were purchased at 4 weeks old and slaughtered at the 12th week, while their growth in this period was estimated. The grazing with ducks in different vegetative states of culture (Ve, V3 and V5 - germination and emergence, three and five fully developed leaves, respectively), didn't allow us to say with accuracy in what vegetative stage the animals no longer caused damage. Analyzing and comparing grazing with ducks after 1st weeding, after weeding / ridging and the classical method, it was concluded that both the soil cover by weeds as the Throat clearing corn production (kg / ha) did not vary significantly, for α = 0.05, after performing single- factor analysis of variance. The results, although preliminary and lacking continuity studies allow, however, to indicate that the tested options may come to replace the traditional method and be valid alternatives to combat weeds in biological maize. KEY-WORDS: Peking Duck; organic corn; weeds; Roof; Pasturing.

Leukaemia inhibitory factor retards the progression of atherosclerosis

Objective: Our previous studies showed that the pleiotropic cytokine leukaemia inhibitory factor (LIF) inhibits the de novo formation of experimental atherosclerotic lesions. The present study examined whether LIF also inhibits progression of pre-existing atheroma. Methods: Balloon angioplasty was performed on the right carotid arteries of 18 rabbits immediately before placing animals on a cholesterol-enriched diet. After 4 weeks, at which time the intima:media ratio (IN) was 0.99+/-0.12 (n=6), osmotic minipumps containing LIF (n=6) or saline control n=6) were inserted into the peritoneal cavity of each of the remaining rabbits for a further 4 weeks. Arteries were then harvested for analysis. Results: Continuous administration of LIF for the final 4 weeks of an 8-week cholesterol-enriched diet completely inhibited lesion progression in injured carotid arteries (I:M 1.05+/-0.16) compared with the saline-treated group at 8 weeks (1.62+/-0.13; P

Sub-inhibitory concentrations of ceftazidime and tobramycin reduce the quorum sensing signals of Pseudomonas aeruginosa

Aim: Concentrations of antimicrobials below minimum inhibitory concentration (subMIC) may reduce the production by Pseudomonas aeruginosa of virulence factors such as elastase. We sought to determine whether the reduction in elastase production may be mediated by a reduction in acyl-homoserine lactones. Methods: Pseudomonas aeruginosa in broth was exposed to three conditions for ceftazidime and tobramycin: control, 6% MIC and 25% MIC. Elastase was assayed using elastin congo red. N-(3-Oxododecanoyl)-homoserine lactone (C12-HSL) and N-butyryl-homoserine lactone (C4-HSL) were assayed using biosensor Escherichia coli. Results: Elastase was unchanged with ceftazidime. Elastase was reduced by 16% at 6% MIC tobramycin and reduced by 70% at 25% MIC tobramycin (P

Effect of β-adrenoceptor antagonists on autonomic control of ciliary smooth muscle

Purpose: Pharmacological intervention with peripheral sympathetic transmission at ciliary smooth muscle neuro-receptor junctions has been used against a background of controlled parasympathetic activity to investigate the characteristics of autonomic control of ocular accommodation. Methods: A continuously recording infrared optometer was used to measure accommodation on a group of five visually normal emmetropic subjects under open- and closed-loop conditions. A double-blind protocol between saline, timolol and betaxolol was used to differentiate between the localised action on ciliary smooth muscle and effects induced by changes in stimulus conditions. Data were collected before and 45 min following the instillation of saline, timolol or betaxolol. Open-loop post-task decay was investigated following 3 min sustained near fixation of a stimulus placed 3 D above the subject's pre-task tonic accommodation level. Closed-loop dynamic responses were recorded for each treatment condition while subjects viewed sinusoidally (0.05-0.6 Hz) or stepwise vergence-modulated targets over a 2 D range (2-4 D). Results: Open-loop data demonstrate a rapid post-task regression to pre-task tonic accommodation levels for saline and betaxolol control conditions. A slow positive post-task shift was induced by timolol indicating that sympathetic inhibition contributes to accommodative adaptation during sustained near vision. Closed-loop accommodation responses to temporally modulated sinusoidal stimuli showed characteristic features for both saline and betaxolol control conditions. Timolol induced a reduced gain for low- and mid-temporal frequencies (< 0.3 Hz) but did not affect the response at higher temporal frequencies. Response times to stepwise stimuli increased following the instillation of timolol for the near-to-far fixation condition compared with the controls and was related to the period of sustained prior fixation. Conclusions: Modulation of accommodation under open- and closed-loop conditions by a non-selective β-blocker is consistent with the temporal and inhibitory features of sympathetic innervation to ciliary smooth muscle. Although parasympathetic innervation predominates there is evidence to support a role for sympathetic innervation in the control of ocular accommodation. © 2002 The College of Optometrists.

Polarised secretion of leukaemia inhibitory factor

Leukaemia inhibitory factor (LIF) is a cytokine that is active on a wide variety of cells. Multiple LIF transcripts have been described. The transcripts LIF-D and LIF-M encode different signal peptides, which in mouse have been associated with differential localisation of the mature protein. LIF-D is associated with a freely diffusible protein, whereas the LIF-M is associated with the extracellular matrix. The polarity of LIF secretion has yet to be described and could illuminate the mechanisms of LIF localisation. Here the polarised endogenous secretion of human LIF and IL-6 in Caco-2 cells was characterised under normal culture conditions and following induction with IL-1b. Whether the apical or basolateral membrane was stimulated influenced the pattern of secretion (LIF: Unstimulated, 59% basolateral. Dual stimulation, 68% basolateral. Basolateral stimulation, 79% basolateral. Apical stimulation, 53% basolateral). IL-6 displayed a similar dependence on the site of stimulation but was predominantly secreted at the membrane that was stimulated. To determine the effect of the alternate signal peptides on the polarity of LIF secretion, LIF was epitope tagged with FLAG. Epitope-tagging with FLAG was used to separate endogenous from exogenous protein expression. However, despite the normal biological activity of LIF-FLAG and detection of the FLAG in a western blot, detection of the LIF-FLAG under non-reducing conditions was not observed, and therefore it was unsuitable for secretion studies. Untagged LIF was expressed exogenously in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells under the control of a tetracycline response promoter that allowed a variety of LIF expression levels to be tested. Exogenous murine LIF was secreted predominantly from the apical (60%) membrane of MDCK cells irrespective of the signal peptide expressed.

Control of the endocrine pancreas by gastrointestinal peptides

This thesis concerns the mechanism through which enteral delivery of glucose results in a larger insulin response than an equivalent parenteral glucose load. Preliminary studies in which mice received a glucose solution either intragastrically or intraperitoneally confirmed this phenomenon. An important regulatory system in this respect is the entero-insular axis, through which insulin secretion is influenced by neural and endocrine communication between the gastrointestinal tract and the pancreatic islets of Langerhans. Using an in vitro system involving static incubation of isolated (by collagenase digestion) islets of Langerhans, the effect of a variety of gastrointestinal peptides on the secretion of the four main islet hormones, namely insulin, glucagon, somatostatin and pancreatic polypeptide, was studied. The gastrointestinal peptides investigated in this study were the secretin family, comprising secretin, glucagon, gastric inhibitory polypeptide (GIP), vasoactive intestinal polypeptide (VIP), peptide histidine isoleucine (PHI) and growth hormone releasing factor (GRF). Gastrin releasing peptide (GRP) was also studied. The results showed that insulin release was stimulated by all peptides studied except PHI, glucagon release was stimulated by all peptides tested, except GRF which suppressed glucagon release, somatostatin release was stimulated by GIP and GRF but suppressed by VIP, PHI, glucagon and secretin, and PP release was stimulated by GIP and GRF, but suppressed by PHI. The insulinotropic effect of GRP was investigated further. A perifusion system was used to examine the time-course of insulin release from isolated islets after stimulation with GRP. GRP was shown to be insulinotropic only in the presence of physiologically elevated glucose concentrations and both first and second phases of insulin release were augmented. There was no effect at substimulatory or very high glucose concentrations. Studies using a cultured insulin-secreting islet cell line, the RINm5F cell line, were undertaken to elucidate the intracellular mechanism of action of GRP. This peptide did not enhance insulin release via an augmentation of glucose metabolism, or via the adenylate cyclase/cyclic AMP secondary messenger system. The pattern of changes of cytosolic free calcium in response to GRP, which involved both mobilization of intracellular stores and an influx of extracellular calcium, suggested the involvement of phosphatidylinositol bisphosphate breakdown as a mediator of the effect of GRP on insulin secretion.

Polarized secretion of leukemia inhibitory factor

Background: The direction of cytokine secretion from polarized cells determines the cytokine's cellular targets. Leukemia inhibitory factor LIF) belongs to the interleukin-6 IL-6) family of cytokines and signals through LIFR/gp130. Three factors which may regulate the direction of LIF secretion were studied: the site of stimulation, signal peptides, and expression levels. Stimulation with IL-1 beta is known to promote IL-6 secretion from the stimulated membrane apical or basolateral) in the human intestinal epithelial cell line Caco-2. Since LIF is related to IL-6, LIF secretion was also tested in Caco-2 following IL-1 beta stimulation. Signal peptides may influence the trafficking of LIF. Two isoforms of murine LIF, LIF-M and LIF-D, encode different signal peptides which have been associated with different locations of the mature protein in fibroblasts. To determine the effect of the signal peptides on LIF secretion, secretion levels were compared in Madin-Darby canine kidney MDCK) clones which expressed murine LIF-M or LIF-D or human LIF under the control of an inducible promoter. Low and high levels of LIF expression were also compared since saturation of the apical or basolateral route would reveal specific transporters for LIF. Results: When Caco-2 was grown on permeable supports, LIF was secreted constitutively with around 40% secreted into the apical chamber. Stimulation with IL-1 beta increased LIF production. After treating the apical surface with IL-1 beta, the percentage secreted apically remained similar to the untreated, whereas, when the cells were stimulated at the basolateral surface only 20% was secreted apically. In MDCK cells, an endogenous LIF-like protein was detected entirely in the apical compartment. The two mLIF isoforms showed no difference in their secretion patterns in MDCK. Interestingly, about 70% of murine and human LIF was secreted apically from MDCK over a 400-fold range of expression levels within clones and a 200,000-fold range across clones. Conclusion: The site of stimulation affected the polarity of LIF secretion, while, signal peptides and expression levels did not. Exogenous LIF is transported in MDCK without readily saturated steps.