Study of the retinoic acid regulated genes in the rodent hypothalamus controlling growth and appetite and the potential for the epigenetic control

Dissertação de mestrado em Bioquímica (área de especialização em Biomedicina)

In obese people the physiological system that should maintain normal energy balance no longer works correctly. Seasonal animals, such as hamsters and F344 rats, provide excellent models for investigating growth- and weight-related changes in the hypothalamus, the major region of the brain regulating feeding behaviour, metabolism and body weight. Evidence suggests that epigenetic mechanisms regulate the expression of hypothalamic genes affecting energy balance. At same time, it is also known that inflammatory responses are one key to changes in the hypothalamus. This study explored a potential role of HDAC4 and HDAC6, enzymes that set up epigenetic change, in modulating the inflammatory signalling pathways in the hypothalamus, as well the possible role of these HDACs in controlling RA and TH signalling pathways which are known to be key for hypothalamic regulation of energy balance. This study showed that HDAC4 and HDAC6 were photoperiodically regulated in the hypothalamus of F344 rats with higher expression in rats under long-day photoperiod (16h light:8h dark), relative to short-day (8h light:16h dark). The NF-κB pathway, a central mediator of inflammatory responses, was considered a possible target of HDAC4 and HDAC6 action. To investigate this HDAC4/5 inhibitor LMK235 and HDAC6 inhibitor tubastatin A were used to evaluate the effect of HDAC inhibition on gene expression of NF-κB target genes. Inhibition of these HDACs were found to potentially influence the control, by TNFα and LPS, of expression of genes required for AP1, protein kinase C and PTP1B pathways. The effect of HDAC6 inhibition on the activation of MAPK pathways was also studied. Only p38 kinase activation by TNFα was shown to be affected by HDACs inhibition. However p38 inhibition did not change the capacity of HDAC inhibitors to alter TNFα gene regulatory activity. Immunocytochemistry experiments indicated that both HDAC4 and HDAC6 were mainly localized in the nucleus of GT1-7 cells and SH-SY5Y cells, two neuronal cell lines. Further, the histone deacetylation activity of HDAC4 and HDAC6 was evaluated by studying the influence of HDACs inhibition in regulating the expression of the RARregulated genes, Cyp26A1 and RARβ, and the THR-regulated gene Nrgn. The results pointed to possible regulation of TH- and RA-regulated genes by HDAC4 and 6. Finally, results suggested that RA and T3 metabolism was under control of inflammatory regulators. Taken together, the results suggest a possible function of HDAC4 and HDAC6 in modulating the activity of inflammatory pathways in the hypothalamus.

Em pessoas obesas, o sistema fisiológico existente responsável pela manutenção do balanço energético não se encontra a funcionar corretamente. Animais sazonais tais como hamsters e ratos F344 são excelentes modelos para estudar alterações relacionadas com o crescimento e o apetite no hipotálamo, a principal região do cérebro que regula o comportamento alimentar, metabolismo e peso corporal. Estudos prévios sugerem que, no hipotálamo, a expressão de certos genes que afetam o equilíbrio energético estão sob o controle epigenético. Para além do referido, é também sabido que os processos inflamatórios desempenham um papel proeminente nas alterações hipotalâmicas. No presente trabalho investigou-se a potencial função da HDAC4 e HDAC6, duas enzimas responsáveis pela remoção de grupos acetil das histonas, na modulação dos processos inflamatórios no hipotálamo, bem como o possível papel destas HDACs no controlo das vias de sinalização do ácido retinóico (RA) e da hormona da tiroide (TH), duas vias conhecidas por desempenhar um papel crucial na regulação hipotalâmica do balanço energético. Este estudo demonstrou que a HDAC4 e a HDAC6 são fotoperiodicamente reguladas no hipotálamo de ratos F344 com maior expressão em ratos sob condições que mimetizam dias de verão (16h de luz: 8h escuro) comparativamente a ratos sob condições que mimetizam dias de inverno (8h de luz: 16h escuro). O papel destas duas enzimas na regulação da expressão de genes regulados pelo NF-κB, um mediador central da resposta inflamatória, foi avaliada recorrendo ao uso de um inibidor para a HDAC4/5, o LMK235, e de um inibidor para a HDAC6, a tubastatin A. A inibição destas HDACs revelou uma potencial função da HDAC4 e HDAC6 em regular, através do TNFα e do LPS, a expressão de genes requeridos para as vias de sinalização do AP-1, proteína cinase C e PTP1B. O efeito da inibição da HDAC6 na ativação das vias de MAPK foi também estudado, tendo-se verificado que apenas a ativação do p38 pelo TNFα foi afetada pela inibição desta HDAC. No entanto a inibição do p38 não afetou a capacidade dos inibidores de HDACs em alterar a atividade reguladora do TNFα. Estudos de imunocitoquímica realizados indicaram que tanto a HDAC4 como a HDAC6 se encontram localizadas principalmente no núcleo das células GT1-7 e SH-SY5Y, duas linhas de células neuronais. Além disso, a capacidade da HDAC4 e da HDAC6 em remover os grupos acetil das histonas foi também avaliada através do estudo da expressão dos genes regulados pelo RAR, Cyp26A1 e RARβ, e do gene regulado pelo THR, o Nrgn, na presença dos inibidores LMK235 e tubastatin A. Os resultados apontam para uma possível regulação da via de sinalização do RA e da TH por estas enzimas. Por fim, foi ainda verificado que o metabolismo do RA e da TH poderá estar sob o controle de reguladores inflamatórios. Em suma, este trabalho sugere uma possível função da HDAC4 e da HDAC6 em modular a atividade das vias inflamatórias no hipotálamo.