Molecular interactions: metal ions and protein chaperones in the urease system from Helicobacter pylori

Although nickel is a toxic metal for living organisms in its soluble form, its importance in many biological processes recently emerged. In this view, the investigation of the nickel-dependent enzymes urease and [NiFe]-hydrogenase, especially the mechanism of nickel insertion into their active sites, represent two intriguing case studies to understand other analogous systems and therefore to lead to a comprehension of the nickel trafficking inside the cell. Moreover, these two enzymes have been demonstrated to ensure survival and colonization of the human pathogen H. pylori, the only known microorganism able to proliferate in the gastric niche. The right nickel delivering into the urease active site requires the presence of at least four accessory proteins, UreD, UreE, UreF and UreG. Similarly, analogous process is principally mediated by HypA and HypB proteins in the [NiFe]-hydrogenase system. Indeed, HpHypA and HpHypB also have been proposed to act in the activation of the urease enzyme from H. pylori, probably mobilizing nickel ions from HpHypA to the HpUreE-HpUreG complex. A complete comprehension of the interaction mechanism between the accessory proteins and the crosstalk between urease and hydrogenase accessory systems requires the determination of the role of each protein chaperone that strictly depends on their structural and biochemical properties. The availability of HpUreE, HpUreG and HpHypA proteins in a pure form is a pre-requisite to perform all the subsequent protein characterizations, thus their purification was the first aim of this work. Subsequently, the structural and biochemical properties of HpUreE were investigated using multi-angle and quasi-elastic light scattering, as well as NMR and circular dichroism spectroscopy. The thermodynamic parameters of Ni2+ and Zn2+ binding to HpUreE were principally established using isothermal titration calorimetry and the importance of key histidine residues in the process of binding metal ions was studied using site-directed mutagenesis. The molecular details of the HpUreE-HpUreG and HpUreE-HpHypA protein-protein assemblies were also elucidated. The interaction between HpUreE and HpUreG was investigated using ITC and NMR spectroscopy, and the influence of Ni2+ and Zn2+ metal ions on the stabilization of this association was established using native gel electrophoresis, light scattering and thermal denaturation scanning followed by CD spectroscopy. Preliminary HpUreE-HpHypA interaction studies were conducted using ITC. Finally, the possible structural architectures of the two protein-protein assemblies were rationalized using homology modeling and docking computational approaches. All the obtained data were interpreted in order to achieve a more exhaustive picture of the urease activation process, and the correlation with the accessory system of the hydrogenase enzyme, considering the specific role and activity of the involved protein players. A possible function for Zn2+ in the chaperone network involved in Ni2+ trafficking and urease activation is also envisaged.

Charakterisierung und Stabilität von Arthropoden-Hämocyanin

Hämocyanine sind große, multimere Sauerstofftransport- proteine, die frei gelöst in der Hämolymphe von Arthropoden und Mollusken vorkommen.Zur Charakterisierung verschiedener Arthropoden-hämocyanine wurden deren molare Massen bestimmt. Die mit einer Vielwinkel-Laser-Lichtstreuapparatur ermittelten Molekulargewichte zeigten eine grosse Schwankungsbreite. Dies konnte auf Ungenauigkeiten der zur Berechnung der Molekulargewichte verwendeten spezifischen Extinktions- koeffizienten und Brechungsindex-Inkremente zurückgeführt werden.Mit der Methode der Massenspektrometrie (MALDI-TOF) bestimmte Molekulargewichte einzelner Untereinheiten des Hämocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum zeigten eine sehr gute Übereinstimmung mit aus der Sequenz errechneten Werten.Für das 24-mere Spinnenhämocyanin von Eurypelma californicum wurde die Stabilität gegenüber GdnHCl und der Temperatur auf den verschiedenen strukturellen Ebenen des Proteins untersucht.Viele Stabilitätsuntersuchungen werden an kleinen Proteinen durchgeführt, deren Entfaltung kooperativerfolgt. Bei größeren Proteinen mit unterschiedlichen strukturellen Bereichen (Domänen) ist der Entfaltungs-prozess weitaus komplexer. Ziel war es, durch die Denaturierung des Spinnen-Hämocyanins Erkenntnisse über die Stabilität und Entfaltung der verschiedenen strukturellen Ebenen eines so großen Proteinkomplexes zu gewinnen.Ein wichtiges Charakteristikum für die Interpretation der Entfaltungsexperimente ist die starke Löschung der Tryptophanfluoreszenz im oxygenierten Spinnen-Hämocyanin. Die Löschung kann vollständig durch Förster-Transfer erklärt werden kann. Sie bleibt auf die einzelnen Untereinheiten beschränkt und stellt somit ein reines O₂-Beladungssignal dar.Unter Einwirkung von GdnHCl dissoziiert das native, 24-mere Spinnen-Hämocyanin ohne die Entstehung langlebiger Inter- mediate. Die Untereinheiten werden durch das Oligomer stabilisiert. Die Entfaltung eines Monomers, der Unter- einheit e, folgt einer Hierarchie der verschiedenen strukturellen Ebenen des Moleküls. Die Entfaltung beginnt zunächst von außen mit der Auflockerung der Tertiärstruktur. Der Kern von Domäne II mit dem aktiven Zentrum weist hingegen eine besondere Stabilität auf.Die ausgeprägte Hitzestabilität des Eurypelma-Hämocyanins hängt vom Oligomerisierungsgrad, dem verwendeten Puffer und dessen Ausgangs-pH-Wert ab und spiegelt offensichtlich die extremen Lebensbedingungen im Habitat wider.

Recombinant expression of molluscan hemocyanin (KLH) substructures in a prokaryotic system: E. coli

The recombinant expression of 19 different substructures of KLH in the prokaryotic sys-tem E. coli has been successfully achieved: each one of the eight single FUs a to h of both isoforms, KLH1 and KLH2, two substructures consisting of two consecutive FUs (KLH1-bc and KLH1-gh) as well as a cDNA encompassing KLH1-abc. All recombinant proteins, fused to an N-terminal 6xHis tag, have successfully been detected by immuno precipitation using monoclonal α-His-antibodies and polyclonal α-KLH1- and α-KLH2-antibodies. One exception remained: SP-KLH2-a, which was not detected by the α-His-antibodies. This allows speculations as to whether the coexpressed signal peptide can lead, at one hand, to the secretion of the recombinant protein, and on the other to the simultaneous cut-off of the leader peptide, which results in the splitting off of even more N-terminal 6xHis tag, leading to failed recognition by the appropriate antibodies. The comparison of native KLH with recombinantly expressed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (Sf9 insect cells) KLH was done using FU-1h. The weak detection by the polyclonal α-KLH1-antibodies of both recombinantly expressed proteins showed that the native protein was the best recognized. For the prokaryotic one, both the denaturation applied for solubilisation of the bacterial inclusion bodies and the inability of bacterial cells to add N-linked glycosylation, are the reason for the poor hybridization. In contrast, KLH1-h expressed in eukaryotic insect cells is likely to be glycosylated. The incubation with the α-KLH1-antibodies resulting in the same weak detection, however, revealed that the linked carbohydrate side chains are not those expected. The establishment of SOE-PCR, together with further improvement, has enabled the generation of a clone encompassing the complete subunit KLH1-abcdefgh. The se-quence analysis compared to the original KLH1 sequence showed, however, that the resulting recombinant protein is defective in two histidines, required for the copper bind-ing sites in FU-1b and FU-1d and in three disulfide bridges (FU-1a, FU-1b and FU 1g). This is due to polymerase-related nucleotide exchanges, resulting in a changed amino acid sequence. Nevertheless, all eight potential N-glycosylation sites are present, leading to the speculation that the recombinant protein can in theory be fully glycosylated, which is the most important aspect for the clinical applicability of recombinant KLH as an im-munotherapeutic agent. The improvement of this method elaborated during the present work indicates bright prospects for the future generation of a correct cDNA sequence encoding for the complete KLH2 subunit.

Atomistic simulations of cosolvent/water mixtures

In this thesis, atomistic simulations are performed to investigate hydrophobic solvation and hydrophobic interactions in cosolvent/water binary mixtures. Many cosolvent/water binary mixtures exhibit non-ideal behavior caused by aggregation at the molecular scale level although they are stable and homogenous at the macroscopic scale. Force-field based atomistic simulations provide routes to relate atomistic-scale structure and interactions to thermodynamic solution properties. The predicted solution properties are however sensitive to the parameters used to describe the molecular interactions. In this thesis, a force field for tertiary butanol (TBA) and water mixtures is parameterized by making use of the Kirkwood-Buff theory of solution. The new force field is capable of describing the alcohol-alcohol, water-water and alcohol-water clustering in the solution as well as the solution components’ chemical potential derivatives in agreement with experimental data. With the new force field, the preferential solvation and the solvation thermodynamics of a hydrophobic solute in TBA/water mixtures have been studied. First, methane solvation at various TBA/water concentrations is discussed in terms of solvation free energy-, enthalpy- and entropy- changes, which have been compared to experimental data. We observed that the methane solvation free energy varies smoothly with the alcohol/water composition while the solvation enthalpies and entropies vary nonmonotonically. The latter occurs due to structural solvent reorganization contributions which are not present in the free energy change due to exact enthalpy-entropy compensation. It is therefore concluded that the enthalpy and entropy of solvation provide more detailed information on the reorganization of solvent molecules around the inserted solute. Hydrophobic interactions in binary urea/water mixtures are next discussed. This system is particularly relevant in biology (protein folding/unfolding), however, changes in the hydrophobic interaction induced by urea molecules are not well understood. In this thesis, this interaction has been studied by calculating the free energy (potential of mean force), enthalpy and entropy changes as a function of the solute-solute distance in water and in aqueous urea (6.9 M) solution. In chapter 5, the potential of mean force in both solution systems is analyzed in terms of its enthalpic and entropic contributions. In particular, contributions of solvent reorganization in the enthalpy and entropy changes are studied separately to better understand what are the changes in interactions in the system that contribute to the free energy of association of the nonpolar solutes. We observe that in aqueous urea the association between nonpolar solutes remains thermodynamically favorable (i.e., as it is the case in pure water). This observation contrasts a long-standing belief that clusters of nonpolar molecules dissolve completely in the presence of urea molecules. The consequences of our observations for the stability of proteins in concentrated urea solutions are discussed in the chapter 6 of the thesis.

Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften neuer Nukleobasen-gekoppelter Pyrrolcarboxamide, Combilexine und Hetaren[a]carbazol-Derivate: Validierung und Etablierung von in-vitro- und in-silico-Methoden

Da maligne Neoplasien durch Mutationen in Proto-Onko- und/oder Tumorsuppressorgenen ausgelöst werden, stellt die DNA eines der wichtigsten Targets für die Entwicklung neuer Zytostatika dar. Auch bei den im Arbeitskreis Pindur designten und synthetisier-ten Verbindungen der Nukleobasen-gekoppelten Pyrrolcarboxamid-, der Hetaren[a]carbazol- und der Combilexin-Reihe handelt es sich um DNA-Liganden mit potentiell antitumoraktiven Eigenschaf-ten. Die einen dualen Bindemodus aufweisenden Combilexine bestehen aus einem Interkalator (u. a. Naphthalimid, Acridon), der über einen Linker variabler Kettenlänge mit einer rinnenbin-denden, von Netropsin abgeleiteten Bispyrrol-, oder einer bioisosteren Imidazol-, Thiazol- oder Thiophen-pyrrolcarboxamid-struktur verknüpft ist. Das N-terminale Ende der Combilexine wird von einer N,N-Dimethylaminopropyl- oder -ethyl-Seitenkette gebildet. Die DNA-Affinitäten der Liganden wurden mittels Tm-Wert-Messung-en bestimmt. Diese Denaturierungsexperimente wurden sowohl mit poly(dAdT)2- als auch mit Thymus-DNA (~42% GC-Anteil) durchge-führt, um Aussagen zur Stärke und zur Sequenzselektivität der DNA-Bindung machen zu können. Des Weiteren wurden die Bindekon-stanten einiger ausgewählter Vertreter mit Hilfe des Ethidium-bromid-Verdrängungsassays ermittelt; einige Testverbindungen wurden zudem auf potentiell vorhandene, TOPO I-inhibierende Eigenschaften untersucht. Diese biochemischen und biophysika-lischen Tests wurden durch Molecular Modelling-Studien ergänzt, die die Berechnung von molekularen Eigenschaften, die Durch-führung von Konformerenanalysen und die Simulation von DNA-Ligand-Komplexen (Docking) umfassten. Durch Korrelation der in vitro-Befunde mit den in silico-Daten gelang es, vor allem für die Substanzklasse der Combilexine einige richtungweisende Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen. So konnte gezeigt werden, dass die Einführung eines Imidazol-Rings in die rinnen-bindende Hetaren-pyrrolcarboxamid-Struktur der Combilexine aufgrund der H-Brücken-Akzeptor-Funktion des sp2-hybridisierten N-Atoms eine Verschiebung der Sequenzselektivität der DNA-Bindung von AT- zu GC-reichen Arealen der DNA bedingt. Zudem erwies sich ein C3-Linker für die Verknüpfung des Naphthalimids mit dem rinnenbindenden Strukturelement als am besten geeignet, während bei den Acridon-Derivaten die Verbindungen mit einem N-terminalen Buttersäure-Linker die höchste DNA-Affinität aufwiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die im Vergleich zum Naphthalimid-Molekül geringere y-Achsen-Ausdehnung (bzgl. eines x/y-Koordinatensystems) des Acridons zurückzuführen. Die ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen können dazu herangezogen werden, das rationale Design neuer DNA-Liganden mit potentiell stärkerer DNA-Bindung zu optimieren.

Strukturelle, enzymkinetische und thermodynamische Untersuchungen am KLH, dem Hämocyanin der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata

Hämocyanine sind große, kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine, die bei zahlreichen Schnecken extrazellulär in der Hämolymphe vorkommen. Das Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata dient aufgrund seiner immunstimu-latorischen Eigenschaften seit vielen Jahren als Modellprotein in der Immunologie. In der Klinik wird es als Hapten- und Vakzincarrier sowie als Medikament gegen oberflächliche Harnblasenkarnzinome eingesetzt. Die Quartärstruktur des KLH besteht aus einem Hohl-zylinder mit einer Molekülmasse von 8 MDa und einem Durchmesser von 35 nm. Dieses sogenannte Didekamer setzt sich aus 20 Untereinheiten mit jeweils 400 kDa zusammen. Jede Untereinheit lässt sich weiter in acht funktionelle Einheiten a bis h (engl. Functional Units = FU) mit ~ 50 kDa unterteilen. Die FUs a bis f bilden die Wandregion des Moleküls, während der Kragen aus den FUs g und h geformt wird. Die Struktur der Wandregion sowie der FU-g konnte bisher bereits durch Röntgenstrukturanalysen aufgeklärt werden. Bezüglich der Struktur der FU-h, die sich durch eine spezielle C-terminale Verlängerung von ~ 100 Amino-säuren auszeichnet, sind allerdings noch keine Informationen verfügbar. Um die Architektur des Kragens zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst Strategien entwickelt, diese spezielle FU in großer Menge und Reinheit zu isolieren. Anschließend konnten Bedingungen gefunden werden, die zur Ausbildung 0,2 mm großer, hexagonaler Kristalle führten. Diese ergaben am Synchrotron eine Auflösung von 4 Å. Durch Auswertung der Röntgenstrukturdaten konnte für die C-terminale Zusatzdomäne der FU-h eine Cupredoxin-ähnliche Typ I-Kupferfaltung ermittelt werden. Der Nachweis eines zusätzlichen Kupfer-atoms innerhalb dieser Domäne bedarf allerdings einer höheren Auflösung der Kristall-struktur. Hämocyanine lassen sich aufgrund ihrer evolutionären Verwandtschaft zu Phenol-oxidasen mit Hilfe verschiedener in vitro-Aktivatoren zur Catecholoxidase und teilweise auch zur Tyrosinase aktivieren. Beim KLH konnte in dieser Arbeit eine eindeutige Diphenolase- und sogar eine schwache Monophenolase-Aktivität der FUs-a und -f nach SDS-Aktivierung nachgewiesen werden. Zudem konnte eine geringfügige intrinsische Diphenolase-Aktivität dieser FUs belegt werden. Die enzymatischen Reaktionen waren sowohl von der gewählten Puffersubstanz, als auch der Anwesenheit bivalenter Kationen abhängig. Tris wirkt vermutlich als allosterischer Effektor und steigerte den Substrat-Umsatz, während Mg2+-Ionen zu einer starken Inhibition der katalytischen Aktivität führten. Die Klärung einer möglichen physiologischen Funktion der Phenoloxidase-Aktivität des KLH sowie potenziellen in vivo-Aktivatoren steht noch aus. Studien zur thermischen Stabilität des KLH resultierten in einer irreversiblen Denaturierung des Proteins. Die Schmelzpunkte deuteten auf eine hohe Tempe-raturstabilität des KLH, vor allem in Anwesenheit bivalenter Kationen. Eine Hämocyanin-typische Abhängigkeit der Hitzeresistenz vom Oligomerisierungsgrad ließ sich nicht feststellen, da sowohl bei der FU-h als auch den KLH-Didekameren eine vergleichbar hohe thermische Stabilität, bei einer nach wie vor vorhandenen Oxygenierung beobachtet wurde.

Biodegradable systems for the development of functional materials

This PhD work was aimed to design, develop, and characterize gelatin-based scaffolds, for the repair of defects in the muscle-skeletal system. Gelatin is a biopolymer widely used for pharmaceutical and medical applications, thanks to its biodegradability and biocompatibility. It is obtained from collagen via thermal denaturation or chemical-physical degradation. Despite its high potential as biomaterial, gelatin exhibits poor mechanical properties and a low resistance in aqueous environment. Crosslinking treatment and enrichment with reinforcement materials are thus required for biomedical applications. In this work, gelatin based scaffolds were prepared following three different strategies: films were prepared through the solvent casting method, electrospinning technique was applied for the preparation of porous mats, and 3D porous scaffolds were prepared through freeze-drying. The results obtained on films put into evidence the influence of pH, crosslinking and reinforcement with montmorillonite (MMT), on the structure, stability and mechanical properties of gelatin and MMT/gelatin composites. The information acquired on the effect of crosslinking in different conditions was utilized to optimize the preparation procedure of electrospun and freeze-dried scaffolds. A successful method was developed to prepare gelatin nanofibrous scaffolds electrospun from acetic acid/water solution and stabilized with a non-toxic crosslinking agent, genipin, able to preserve their original morphology after exposure to water. Moreover, the co-electrospinning technique was used to prepare nanofibrous scaffolds at variable content of gelatin and polylactic acid. Preliminary in vitro tests indicated that the scaffolds are suitable for cartilage tissue engineering, and that their potential applications can be extended to cartilage-bone interface tissue engineering. Finally, 3D porous gelatin scaffolds, enriched with calcium phosphate, were prepared with the freeze-drying method. The results indicated that the crystallinity of the inorganic phase influences porosity, interconnectivity and mechanical properties. Preliminary in vitro tests show good osteoblast response in terms of proliferation and adhesion on all the scaffolds.

Einzelmolekül-Untersuchungen zu Faltung und Zusammenbau des Lichtsammelkomplexes LHCII

Zusammenfassungrn Der Faltungsprozess des Hauptlichtsammelkomplexes des Photosystems II aus höheren Pflanzen (light harvesting complex II, LHCII) wurde bereits mehrfach untersucht, die Experimente hierzu fanden stets im Ensemble statt. Anhand der bislang veröffentlichten Faltungskinetiken des LHCII aus höheren Pflanzen lassen sich aber keine eindeutigen Aussagen bezüglich der Diversität der Faltungswege treffen. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit Faltungskinetiken einzelner LHCII-Moleküle während der Komplexbildung aufgenommen werden, um weitergehende Informationen zum Faltungsmechanismus zu erhalten und zur Frage, ob hier mehrere unterschiedliche Wege eingeschlagen werden.rnHierfür war zunächst die Etablierung einer Oberflächenimmobilisierung mit Glas als Trägermaterial notwendig. Nachdem Versuche, diese Immobilisierung über einen His6-tag oder über einen heterobifunktionellen Linker zu bewerkstelligen, nicht zum Erfolg geführt haben, konnte eine Immobilisierung des Biotin-markierten Proteins an Oberflächen-gebundenes Avidin erreicht werden. Die Qualität dieser Immobilisierung wurde hierbei sowohl über Bindungsversuche mit fluoreszenzfarbstoffmarkiertem Protein als auch über eine direkte Kontrolle der Oberflächenbeschaffenheit mittels Rasterkraftmikroskopie überprüft. Die für die folgenden Versuche optimale Belegungsdichte wurde im konfokalen Fluoreszenzmikroskop ermittelt. Zudem wurde sichergestellt, dass die Proteine vereinzelt auf der Oberfläche immobilisiert vorliegen.rnAuf dieser Basis wurden LHCII-Komplexe, die zuvor in vitro rekonstituiert wurden, immobilisiert und Versuche zur kontrollierten Denaturierung unternommen, um Zerfalls-kinetiken im Verfahren der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (total internal reflection fluorescence, TIRF) aufnehmen zu können. Hierbei traten Schwierigkeiten bezüglich der Lebensdauer der Komplexe unter Laser-Belichtung auf, da sich die Löschung der Fluoreszenz durch Zerstrahlung der Pigmente einerseits oder Dissoziation der LHCII andererseits nicht unterscheiden ließen. Auch durch verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Lebensdauer konnte diese nicht in dem Maße gesteigert werden, wie es experimentell notwendig gewesen wäre.rnFür das eigentliche Hauptziel dieser Arbeit – die Aufzeichnung von Einzelmolekül-Faltungskinetiken – war die Entwicklung einer Methode zur Rekonstitution oberflächen-immobilisierter LHCII-Apoproteine notwendig. Dieses Ziel wurde mithilfe einer Detergenzmisch-Rekonstitution erreicht. Der Erfolg der Rekonstitution konnte experimentell sowohl im Fluorimeter anhand des komplexinternen Energietransfers auf einen kovalent an das Protein gebundenen Infrarot-Fluorophor als auch im TIRF-Verfahren direkt beobachtet werden. Auch hier konnte nach ca. 80 Sekunden ein Ausbleichen der Komplexe während der Belichtung durch den Anregungs-Laser beobachtet werden.rnIn Versuchen zur Beobachtung des Komplexbildungsvorganges zeigte sich, dass die Rekonstitution offenbar durch die Belichtung massiv gestört wird. Ein weiteres Problem war eine sehr starke Hintergrundfluoreszenz, ausgelöst durch die zur Rekonstitution notwendige Pigmentlösung, die trotz der TIRF-Anregung von ausschließlich oberflächengebundenem Material die Fluoreszenz der Komplexe überlagerte. Somit konnte die Rekonstitution oberflächenimmobilisierter LHCII-Proteine zwar in Vorher-Nachher-Aufnahmen gezeigt werden, der Faltungsprozess an sich konnte dagegen im Rahmen dieser Arbeit nicht aufgezeichnet werden.

Microarray based real-time analysis of nucleic acid hybridization kinetics and thermodynamics

Ziel dieser Dissertation ist die experimentelle Charakterisierung und quantitative Beschreibung der Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuresträngen mit oberflächengebundenen Fängermolekülen für die Entwicklung von integrierten Biosensoren. Im Gegensatz zu lösungsbasierten Verfahren ist mit Microarray Substraten die Untersuchung vieler Nukleinsäurekombinationen parallel möglich. Als biologisch relevantes Evaluierungssystem wurde das in Eukaryoten universell exprimierte Actin Gen aus unterschiedlichen Pflanzenspezies verwendet. Dieses Testsystem ermöglicht es, nahe verwandte Pflanzenarten auf Grund von geringen Unterschieden in der Gen-Sequenz (SNPs) zu charakterisieren. Aufbauend auf dieses gut studierte Modell eines House-Keeping Genes wurde ein umfassendes Microarray System, bestehend aus kurzen und langen Oligonukleotiden (mit eingebauten LNA-Molekülen), cDNAs sowie DNA und RNA Targets realisiert. Damit konnte ein für online Messung optimiertes Testsystem mit hohen Signalstärken entwickelt werden. Basierend auf den Ergebnissen wurde der gesamte Signalpfad von Nukleinsärekonzentration bis zum digitalen Wert modelliert. Die aus der Entwicklung und den Experimenten gewonnen Erkenntnisse über die Kinetik und Thermodynamik von Hybridisierung sind in drei Publikationen zusammengefasst die das Rückgrat dieser Dissertation bilden. Die erste Publikation beschreibt die Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Spezifizität von Microarray Ergebnissen durch online Messung von Kinetik und Thermodynamik gegenüber endpunktbasierten Messungen mit Standard Microarrays. Für die Auswertung der riesigen Datenmengen wurden zwei Algorithmen entwickelt, eine reaktionskinetische Modellierung der Isothermen und ein auf der Fermi-Dirac Statistik beruhende Beschreibung des Schmelzüberganges. Diese Algorithmen werden in der zweiten Publikation beschrieben. Durch die Realisierung von gleichen Sequenzen in den chemisch unterschiedlichen Nukleinsäuren (DNA, RNA und LNA) ist es möglich, definierte Unterschiede in der Konformation des Riboserings und der C5-Methylgruppe der Pyrimidine zu untersuchen. Die kompetitive Wechselwirkung dieser unterschiedlichen Nukleinsäuren gleicher Sequenz und die Auswirkungen auf Kinetik und Thermodynamik ist das Thema der dritten Publikation. Neben der molekularbiologischen und technologischen Entwicklung im Bereich der Sensorik von Hybridisierungsreaktionen oberflächengebundener Nukleinsäuremolekülen, der automatisierten Auswertung und Modellierung der anfallenden Datenmengen und der damit verbundenen besseren quantitativen Beschreibung von Kinetik und Thermodynamik dieser Reaktionen tragen die Ergebnisse zum besseren Verständnis der physikalisch-chemischen Struktur des elementarsten biologischen Moleküls und seiner nach wie vor nicht vollständig verstandenen Spezifizität bei.

Untersuchungen zur Funktion multipler DnaJ-Proteine in dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803

Sowohl in Synechocystis sp. PCC 6803 als auch in anderen Cyanobakterien konnten multiple DnaJ-Proteine nachgewiesen werden, deren Funktion jedoch noch weitestgehend unverstanden ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktionen der multiplen DnaJ-Proteine von Synechocystis sp. charakterisiert. Das DnaJ-Protein, Sll0897 gehört aufgrund seiner Domänenstruktur zu den Typ I-Proteinen, Slr0093 und Sll1933 zu den Typ II-Proteinen und Sll0909, Sll1011, Sll1384 und Sll1666 zu den Typ III DnaJ-Proteinen. Durch Komplementationsstudien des E. coli ΔdnaJ-Stammes OD259 konnte eine Komplementation des Wachstumsdefekts bei höheren Temperaturen durch die Proteine Slr0093 und Sll0897 gezeigt werden. In Synechocystis war eine komplette Disruption von sll1933 nicht möglich, weshalb das Protein Sll1933 unter normalen Wachstumsbedingungen essentiell ist. Doppelte Insertionmutationen waren lediglich bei der Kombination der Gene sll0909 und sll1384 möglich. Untersuchungen des Wachstumsverhaltens der dnaJ-Disruptions-stämme unter Hitze- und Kältestressbedingungen zeigten, dass das Protein Sll0897 eine wichtige Funktion bei der Stressantwort in Synechocystis besitzt und unter Hitzestressbedingungen essentiell ist. Eine vollständige Deletion des Gens sll0897 war Synechocystis sp. bereits unter normalen Wachstumsbedingungen nicht möglich. Bei den für ein Wachstum mindestens notwendigen Domänen des Sll0897 handelt es sich um die charakteristische J-Domäne und die Glycin-Phenylalanin-reiche Domäne. Unter Hitzestressbedingungen ist das Volllängen-Protein Sll0897 für ein Wachstum essentiell. rnNeben den in vivo Wachstumsexperimenten wurde eine Methode zur heterologen Expression der sieben DnaJ-Proteine in E. coli und einer nativen Reinigung von Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 etabliert. Untersuchungen zur Thermostabilität der gereinigten Proteine zeigten für das Slr0093 und Sll1666 einen reversiblen Prozess, wodurch sie auch nach dem Hitzestress noch als Faltungshelfer fungieren können. Bei den Proteinen Sll0897 und Sll0909 ist der Prozess jedoch nicht reversibel, so dass sie nach Hitzestresseinwirkung neu synthetisiert oder durch Chaperoneinwirkung korrekt gefaltet werden müssen. Die Affinitäts-„Pull-Down“ Analysen lieferten keine klaren Hinweise auf die DnaK-Interaktionspartner der Proteine Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666, weshalb weitere Untersuchungen notwendig sind. Mit Hilfe der Gelfiltrationsanalysen konnten die errechneten molaren Massen der Proteine Slr0093 und Sll1666 bestätigt und beide Proteine in einer monomeren Form nachgewiesen werden. Die DnaJ-Proteine Sll0897 und Sll0909 konnten in zwei oligomeren Zuständen detektiert werden. Analysen der ATPase-Aktivität des DnaK2-Proteins alleine und des DnaK2-Proteins zusammen mit den DnaJ-Proteinen Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 zeigten eine Steigerung der ATP-Hydrolyserate bei der Interaktion von DnaK und DnaJ, wobei Sll0897 die größte Steigerung der ATPase-Aktivität des DnaK2 induzierte.

Thermal model for optimization of vascular laser tissue soldering

Laser tissue soldering (LTS) is a promising technique for tissue fusion based on a heat-denaturation process of proteins. Thermal damage of the fused tissue during the laser procedure has always been an important and challenging problem. Particularly in LTS of arterial blood vessels strong heating of the endothelium should be avoided to minimize the risk of thrombosis. A precise knowledge of the temperature distribution within the vessel wall during laser irradiation is inevitable. The authors developed a finite element model (FEM) to simulate the temperature distribution within blood vessels during LTS. Temperature measurements were used to verify and calibrate the model. Different parameters such as laser power, solder absorption coefficient, thickness of the solder layer, cooling of the vessel and continuous vs. pulsed energy deposition were tested to elucidate their impact on the temperature distribution within the soldering joint in order to reduce the amount of further animal experiments. A pulsed irradiation with high laser power and high absorbing solder yields the best results.

Detecting and resolving position-dependent temperature effects in real-time quantitative polymerase chain reaction

Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) depends on precise temperature control of the sample during cycling. In the current study, we investigated how temperature variation in plate-based qPCR instruments influences qPCR results. Temperature variation was measured by amplicon melting analysis as a convenient means to assess well-to-well differences. Multiple technical replicates of several SYBR Green I-based qPCR assays allowed correlation of relative well temperature to quantification cycle. We found that inadequate template denaturation results in an inverse correlation and requires increasing the denaturation temperature, adding a DNA destabilizing agent, or pretreating with a restriction enzyme. In contrast, inadequate primer annealing results in a direct correlation and requires lowering the annealing temperature. Significant correlations were found in 18 of 25 assays. The critical nature of temperature-dependent effects was shown in a blinded study of 29 patients for the diagnosis of Prader-Willy and Angelman syndromes, where eight diagnoses were incorrect unless temperature-dependent effects were controlled. A method to detect temperature-dependent effects by pairwise comparisons of replicates in routine experiments is presented and applied. Systematic temperature errors in qPCR instruments can be recognized and their effects eliminated when high precision is required in quantitative genetic diagnostics and critical complementary DNA analyses.

Fine structure of hippocampal mossy fiber synapses following rapid high-pressure freezing

Synapses of hippocampal neurons play important roles in learning and memory processes and are involved in aberrant hippocampal function in temporal lobe epilepsy. Major neuronal types in the hippocampus as well as their input and output synapses are well known, but it has remained an open question to what extent conventional electron microscopy (EM) has provided us with the real appearance of synaptic fine structure under in vivo conditions. There is reason to assume that conventional aldehyde fixation and dehydration lead to protein denaturation and tissue shrinkage, likely associated with the occurrence of artifacts. However, realistic fine-structural data of synapses are required for our understanding of the transmission process and for its simulation. Here, we used high-pressure freezing and cryosubstitution of hippocampal tissue that was not subjected to aldehyde fixation and dehydration in ethanol to monitor the fine structure of an identified synapse in the hippocampal CA3 region, that is, the synapse between granule cell axons, the mossy fibers, and the proximal dendrites of CA3 pyramidal neurons. Our results showed that high-pressure freezing nicely preserved ultrastructural detail of this particular synapse and allowed us to study rapid structural changes associated with synaptic plasticity.

Synthesis of 1,1'-(Hexane-1,6-Diyl)Bis(5-Oxopyrrolidine-3-Carboxylic Acid) as a Monomer for a Polyanhydride Drug Delivery System

Polyanhydrides have been given much attention in the literature recently because of their desirable properties as controlled drug delivery solutions. Drug therapies could be loaded into a polyanhydride matrix and protected from denaturation and removal from the body while being slowly eluted as the polyanhydride degraded yielding a tailorable concentration profile in the bloodstream at therapeutic levels. To that end, this report discusses the synthesis of a novel monomer for polyanhydride synthesis: 1,1'-(hexane-1,6-diyl)bis(5-oxopyrrolidine-3-carboxylic acid) henceforth known as CPyH monomer for (carboxypyrrolidone)hexane monomer.

Fetal haemoglobin levels in adult type 1 (insulin-dependent) diabetic patients

Glycated haemoglobin levels (HbA1 and HbA1c) are established parameters of long-term glycaemic control in diabetic patients. Depending on the method used, fetal haemoglobin interferes with the assays for glycated haemoglobin. If present in high amounts, fetal haemoglobin may lead to overestimation of glycated haemoglobin levels, and therefore, of average blood glucose concentration in diabetic patients. Glycated (HbA1c) and fetal haemoglobin levels were measured by high pressure liquid chromatography in 60 (30 female) adult Type 1 (insulin-dependent) diabetic patients of Swiss descent, and were compared with levels obtained from 60 normal, non-diabetic control subjects matched for age and sex. Fetal haemoglobin levels were significantly higher in the diabetic patients (0.6 +/- 0.1%, mean +/- SEM; range: 0-3.6%) than in the control subjects (0.4 +/- 0.1%, p < 0.001). Elevated fetal haemoglobin levels (> or = 0.6%) were found in 23 of 60 diabetic patients (38%) compared to 9 of 60 control subjects (15%; chi 2 = 8.35, p < 0.01). In addition, fetal haemoglobin levels in diabetic patients are weakly correlated with glycated haemoglobin (HbA1c) (r = 0.38, p < 0.01). Fetal haemoglobin results were confirmed with the alkali denaturation procedure, and by immunocytochemistry using a polyclonal rabbit anti-fetal haemoglobin antibody. A significant proportion of adult patients with Type 1 diabetes has elevated fetal haemoglobin levels. In certain patients this may lead to a substantial over-estimation of glycated haemoglobin levels, and consequently of estimated, average blood glucose levels. The reason for this increased prevalence of elevated fetal haemoglobin remains unclear, but it may be associated with poor glycaemic control.