Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Niveles de plaguicidas organoclorados y PCB´S en el ecosistema marino costero peruano

Se presentan los niveles de residuos de compuestos organoclorados, DDT's y PCB's en organismos y sedimentos marinos evaluados en las áreas costeras de Callao, Pisco. Moliendo e !te, durante el período 1994-1996. Información muy puntual (sedimento) se obtuvo en Talara y Paíta. Los compuestos organoclorados de gran persistencia y toxicidad. mostraron trazas en los organismos y sedimentos evaluados; lo cual nos indica la influencia de descargas residuales de origen netamente antropogénico, con trazas de estos compuestos no obstante haber sido prohibidos en el país desde 1991. Los ni veles hallados se consideran información básica referencial, cuyas concentraciones para el caso de especies. resultaron muy inferiores a las establecidas en normas internacionales (FDA/USA).

Aspectos generales de la prospección de los recursos costeros, diciembre 1995 - enero 1996

Describe la prospección efectuada a bordo de la E/P San Jacinto I (Puerto Pizarro – Ilo), realizada con la finalidad de contribuir al conocimiento de la distribución y concentración de los recursos pesqueros costeros, a profundidades menores de 40bz. Así mismo, presenta las características generales de organización y metodologías de trabajo. Los resultados más importantes obtenidos fueron: el conocimiento actual de la distribución y diversidad de los recursos pesqueros, la estructura del sistema costero y las condiciones ambientales

Caracteristicas de distribución, concentración y biologicas de los recursos costeros

Describe el desarrollo de una prospección pesquera aplicando la metodología del área barrida y rastreo acústico para estimar la abundancia relativa de los recursos demersales – costeros, respectivamente, así como para determinar aspectos biológicos de los mismos. Las mejores concentraciones de recursos pelágico-costeros se ubicaron entre el extremo norte y Callao. Se destaca la presencia sostenida del "bagre con faja" (Galeichthys peruvianus) entre Punta Fallas y Punta Colorado; el "calamar" (Loligo gahi) y el "pejerrey", se mostraron concurrentes en gran parte del área evaluada. La lorna y el mis-mis, mostraron comportamiento demersal y pelágico en función de su estratificación latitudinal de tallas. El "camaroncito rojo" (Pleuroncodes monodon) destacó notablemente desde el Callao hasta Camaná, circunstancia favorecida por el influjo de las Aguas Templadas de la Sub-antártica, especialmente entre Pisco e Ilo.

Caracteristicas del fenómeno "El Niño" 1982-83

Describe las principales caracteristicas del fenómeno y sus consecuencias en las aguas ecuatoriales.

Estado de la contaminación marina en litoral peruano en 1994 y 1995

da a conocer el estado de la contaminación marina en el periodo comprendido entre 1994 a 1995 en diferentes áreas del litoral peruano. En el trabajo se consideraron las principales fuentes terrestres de contaminación provenientes de los desechos domésticos e industriales, plaguicidas organoclorados, hidrocarburos de petróleo y metales pesados. Así mismo se evaluaron los efectos de ellos sobre el macrobentos en las áreas estudiadas, contrastando con ensayos de corta duración de toxicidad letal y utilizando zoeas de Emerita analoga con hidrocarburos y metales pesados. Las bahías de Callao y Chimbote mostraron mayor contaminación por desechos domésticos e industriales, con deterioro de la calidad microbiológica determinándose altos niveles de contaminación fecal. En ninguna de las áreas marinas hubo presencia de Vibrio cholerae toxigénico. En lo que se refiere a los plaguicidas se detectaron 3 tipos de DDT 's en la zona del Callao. En la evaluación de los efectos de la contaminación sobre las comunidades marinas del macrozoobentos tanto de sustrato blando como rocoso de las áreas de Chimbote, Huacho, Pisco e Ilo se ha determinado que la comunidad béntica de sustrato rocoso situada al norte de bahía Ferrol, Chimbote muestra una moderada perturbación al igual que las comunidades de sustratos blandos de las bahías de Paracas e Ite.

Calidad ambiental en el área marino costera de Huarmey, Perú. Marzo 2002

Se presentan los parámetros de calidad acuática y del contenido metálico en sedimentos y moluscos bentónicos marinos de la bahía de Huarmey, registrados en el verano austral 2002.

Bahía de Huarmey, Áncash, Perú. Evaluación ambiental en abril 2003

Se registraron aguas de mezcla y costeras frías (ACF), con temperaturas muy homogéneas que en superficie y fondo variaron entre 15,1 y 16,4 °C. Los valores de oxígeno fueron menores que en la pasada evaluación del 2002, con promedio 2,2 mL/L (máximo 3,14 mg/L) en superficie y de 0,7 mL/L (1,00 mg/L) en fondo.

Seguimiento de las pesquerías y calidad ambiental 2001-2005. IMARPE-Huacho

La pesquería pelágica en total desembarcó 8.970.674 t (25,8% del desembarque nacional), constituido por anchoveta Engraulis ringens (97%) que registró mayor incidencia de juveniles el 2002. La pesquería artesanal desembarcó 8.880,2 t (88,7% fueron peces). El desembarque se incrementó en 44,3% el 2005, revirtiendo la tendencia negativa del período 2001–2003. El caracol Stramonita chocolata presentó alta incidencia de individuos por debajo de la talla mínima legal de extracción. Se determinó que el principal contaminante (carga orgánica) se incrementa en épocas de actividad industrial. El Cadmio superó lo observado en la bahía del Callao.

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