The Th17 pathway in the peripheral lung microenvironment interacts with expression of collagen V in the late state of experimental pulmonary fibrosis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeito do treinamento físico aeróbio na reatividade vascular da artéria ilíaca em camundongos LDL-/-

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Differential expression of HINT1 in schizophrenia brain tissue

Recent findings in the literature suggest a relation between histidine triad nucleotide-binding protein-1 (HINT1) and psychiatric disorders such as major depression, anxiety, and schizophrenia, although its physiological roles are not completely comprehended. Using Western blot, we compared HINT1 protein expression in the postmortem dorsolateral prefrontal cortex and thalamus of schizophrenia patients and healthy controls for contributing to elucidate the role of HINT1 in schizophrenia pathophysiology. HINT1 was found to be downregulated in the dorsolateral prefrontal cortex and upregulated in the thalamus. Our results combined to previous studies in human samples and preclinical models support the notion that HINT1 must be more explored as a potential target for psychiatric disorders.

Kinin B1 Receptor in Adipocytes Regulates Glucose Tolerance and Predisposition to Obesity

Background: Kinins participate in the pathophysiology of obesity and type 2 diabetes by mechanisms which are not fully understood. Kinin B-1 receptor knockout mice (B-1(-/-)) are leaner and exhibit improved insulin sensitivity. Methodology/Principal Findings: Here we show that kinin B-1 receptors in adipocytes play a role in controlling whole body insulin action and glucose homeostasis. Adipocytes isolated from mouse white adipose tissue (WAT) constitutively express kinin B-1 receptors. In these cells, treatment with the B-1 receptor agonist des-Arg(9)-bradykinin improved insulin signaling, GLUT4 translocation, and glucose uptake. Adipocytes from B-1(-/-) mice showed reduced GLUT4 expression and impaired glucose uptake at both basal and insulin-stimulated states. To investigate the consequences of these phenomena to whole body metabolism, we generated mice where the expression of the kinin B-1 receptor was limited to cells of the adipose tissue (aP2-B-1/B-1(-/-)). Similarly to B-1(-/-) mice, aP2-B-1/B-1(-/-) mice were leaner than wild type controls. However, exclusive expression of the kinin B1 receptor in adipose tissue completely rescued the improved systemic insulin sensitivity phenotype of B-1(-/-) mice. Adipose tissue gene expression analysis also revealed that genes involved in insulin signaling were significantly affected by the presence of the kinin B-1 receptor in adipose tissue. In agreement, GLUT4 expression and glucose uptake were increased in fat tissue of aP2-B-1/B-1(-/-) when compared to B-1(-/-) mice. When subjected to high fat diet, aP2-B-1/B-1(-/-) mice gained more weight than B-1(-/-) littermates, becoming as obese as the wild types. Conclusions/Significance: Thus, kinin B-1 receptor participates in the modulation of insulin action in adipocytes, contributing to systemic insulin sensitivity and predisposition to obesity.

Anti-atherogenic and anti-angiogenic activities of polyphenols from propolis

Propolis is a polyphenol-rich resinous substance extensively used to improve health and prevent diseases. The effects of polyphenols from different sources of propolis on atherosclerotic lesions and inflammatory and angiogenic factors were investigated in LDL receptor gene (LDLr-/-) knockout mice. The animals received a cholesterol-enriched diet to induce the initial atherosclerotic lesions (IALs) or advanced atherosclerotic lesions (AALs). The IAL or AAL animals were divided into three groups, each receiving polyphenols from either the green, red or brown propolis (250 mg/kg per day) by gavage. After 4 weeks of polyphenol treatment, the animals were sacrificed and their blood was collected for lipid profile analysis. The atheromatous lesions at the aortic root were also analyzed for gene expression of inflammatory and angiogenic factors by quantitative real-time polymerase chain reaction and immunohistochemistry. All three polyphenol extracts improved the lipid profile and decreased the atherosclerotic lesion area in IAL animals. However, only polyphenols from the red propolis induced favorable changes in the lipid profiles and reduced the lesion areas in AAL mice. In IAL groups. VCAM, MCP-1, FGF, PDGF, VEGF, PECAM and MMP-9 gene expression was down-regulated, while the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 gene was up-regulated by all polyphenol extracts. In contrast, for advanced lesions, only the polyphenols from red propolis induced the down-regulation of CD36 and the up-regulation of HO-1 and TIMP-1 when compared to polyphenols from the other two types of propolis. In conclusion, polyphenols from propolis, particularly red propolis, are able to reduce atherosclerotic lesions through mechanisms including the modulation of inflammatory and angiogenic factors. (C) 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.

TLR2, TLR4 and the MYD88 Signaling Pathway Are Crucial for Neutrophil Migration in Acute Kidney Injury Induced by Sepsis

The aim of this study was to investigate the role of TLR2, TLR4 and MyD88 in sepsis-induced AKI. C57BL/6 TLR2(-/-), TLR4(-/-) and MyD88(-/-) male mice were subjected to sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). Twenty four hours later, kidney tissue and blood samples were collected for analysis. The TLR2(-/-), TLR4(-/-) and MyD88(-/-) mice that were subjected to CLP had preserved renal morphology, and fewer areas of hypoxia and apoptosis compared with the wild-type C57BL/6 mice (WT). MyD88(-/-) mice were completely protected compared with the WT mice. We also observed reduced expression of proinflammatory cytokines in the kidneys of the knockout mice compared with those of the WT mice and subsequent inhibition of increased vascular permeability in the kidneys of the knockout mice. The WT mice had increased GR1(+low) cells migration compared with the knockout mice and decreased in GR1(+high) cells migration into the peritoneal cavity. The TLR2(-/-), TLR4(-/-), and MyD88(-/-) mice had lower neutrophil infiltration in the kidneys. Depletion of neutrophils in the WT mice led to protection of renal function and less inflammation in the kidneys of these mice. Innate immunity participates in polymicrobial sepsis-induced AKI, mainly through the MyD88 pathway, by leading to an increased migration of neutrophils to the kidney, increased production of proinflammatory cytokines, vascular permeability, hypoxia and apoptosis of tubular cells.

IFN-gamma Plays a Unique Role in Protection against Low Virulent Trypanosoma cruzi Strain

Background: T. cruzi strains have been divided into six discrete typing units (DTUs) according to their genetic background. These groups are designated T. cruzi I to VI. In this context, amastigotes from G strain (T. cruzi I) are highly infective in vitro and show no parasitemia in vivo. Here we aimed to understand why amastigotes from G strain are highly infective in vitro and do not contribute for a patent in vivo infection. Methodology/Principal Findings: Our in vitro studies demonstrated the first evidence that IFN-gamma would be associated to the low virulence of G strain in vivo. After intraperitoneal amastigotes inoculation in wild-type and knockout mice for TNF-alpha, Nod2, Myd88, iNOS, IL-12p40, IL-18, CD4, CD8 and IFN-gamma we found that the latter is crucial for controlling infection by G strain amastigotes. Conclusions/Significance: Our results showed that amastigotes from G strain are highly infective in vitro but did not contribute for a patent infection in vivo due to its susceptibility to IFN-gamma production by host immune cells. These data are useful to understand the mechanisms underlying the contrasting behavior of different T. cruzi groups for in vitro and in vivo infection.

PTTG expression in different experimental and human prolactinomas in relation to dopaminergic control of lactotropes

Abstract Background Pituitary tumor transforming gene (pttg) is a novel oncogene that is expressed at higher level in most of the tumors analyzed to date compared to normal tissues. Nevertheless, its expression in prolactinomas and its relation with the pituitary dopamine receptor 2 (D2R) are not well defined. We sought to determine the pituitary level of pttg in three different experimental models of prolactinomas with altered dopaminergic control of the pituitary: the dopaminergic D2R knockout female mouse, the estrogen-treated rat, and the senescent female rat. These three models shared the characteristics of increased pituitary weight, hyperprolactinemia, lactotrope hyperplasia and reduced or absent dopaminergic action at the pituitary level. We also studied samples from human macroprolactinomas, which were characterized as responsive or resistant to dopamine agonist therapy. Results When compared to female wild-type mice, pituitaries from female D2R knockout mice had decreased PTTG concentration, while no difference in pttg mRNA level was found. In senescent rats no difference in pituitary PTTG protein expression was found when compared to young rats. But, in young female rats treated with a synthetic estrogen (Diethylstylbestrol, 20 mg) PTTG protein expression was enhanced (P = 0.029). Therefore, in the three experimental models of prolactinomas, pituitary size was increased and there was hyperprolactinemia, but PTTG levels followed different patterns. Patients with macroprolactinomas were divided in those in which dopaminergic therapy normalized or failed to normalize prolactin levels (responsive and resistant, respectively). When pituitary pttg mRNA level was analyzed in these macroprolactinomas, no differences were found. We next analyzed estrogen action at the pituitary by measuring pituitary estrogen receptor α levels. The D2R knockout female mice have low estrogen levels and in accordance, pituitary estrogen receptors were increased (P = 0.047). On the other hand, in senescent rats estrogen levels were slightly though not significantly higher, and estrogen receptors were similar between groups. The estrogen-treated rats had high pharmacological levels of the synthetic estrogen, and estrogen receptors were markedly lower than in controls (P < 0.0001). Finally, in patients with dopamine resistant or responsive prolactinomas no significant differences in estrogen receptor α levels were found. Therefore, pituitary PTTG was increased only if estrogen action was increased, which correlated with a decrease in pituitary estrogen receptor level. Conclusion We conclude that PTTG does not correlate with prolactin levels or tumor size in animal models of prolactinoma, and its pituitary content is not related to a decrease in dopaminergic control of the lactotrope, but may be influenced by estrogen action at the pituitary level. Therefore it is increased only in prolactinomas generated by estrogen treatment, and not in prolactinomas arising from deficient dopamine control, or in dopamine resistant compared with dopamine responsive human prolactinomas. These results are important in the search for reliable prognostic indicators for patients with pituitary adenomas which will make tumor-specific therapy possible, and help to elucidate the poorly understood phenomenon of pituitary tumorigenesis.

Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development

The adipocyte-derived hormone leptin is required for normal pubertal maturation in mice and humans and, therefore, leptin has been recognized as a crucial metabolic cue linking energy stores and the onset of puberty. Several lines of evidence have suggested that leptin acts via kisspeptin expressing neurons of the arcuate nucleus to exert its effects. Using conditional knockout mice, we have previously demonstrated that deletion of leptin receptors (LepR) from kisspeptin cells cause no puberty or fertility deficits. However, developmental adaptations and system redundancies may have obscured the physiologic relevance of direct leptin signaling in kisspeptin neurons. To overcome these putative effects, we re-expressed endogenous LepR selectively in kisspeptin cells of mice otherwise null for LepR, using the Cre-loxP system. Kiss1-Cre LepR null mice showed no pubertal development and no improvement of the metabolic phenotype, remaining obese, diabetic and infertile. These mice displayed decreased numbers of neurons expressing Kiss1 gene, similar to prepubertal control mice, and an unexpected lack of re-expression of functional LepR. To further assess the temporal coexpression of Kiss1 and Lepr genes, we generated mice with the human renilla green fluorescent protein (hrGFP) driven by Kiss1 regulatory elements and crossed them with mice that express Cre recombinase from the Lepr locus and the R26-tdTomato reporter gene. No coexpression of Kiss1 and LepR was observed in prepubertal mice. Our findings unequivocally demonstrate that kisspeptin neurons are not the direct target of leptin in the onset of puberty. Leptin signaling in kisspeptin neurons arises only after completion of sexual maturation.

The role of Nox2-derived ROS in the development of cognitive impairment after sepsis

BACKGROUND: Sepsis- associated encephalopathy (SAE) is an early and common feature of severe infections. Oxidative stress is one of the mechanisms associated with the pathophysiology of SAE. The goal of this study was to investigate the involvement of NADPH oxidase in neuroinflammation and in the long-term cognitive impairment of sepsis survivors. METHODS: Sepsis was induced in WT and gp91phox knockout mice (gp91phox-/-) by cecal ligation and puncture (CLP) to induce fecal peritonitis. We measured oxidative stress, Nox2 and Nox4 gene expression and neuroinflammation in the hippocampus at six hours, twenty-four hours and five days post-sepsis. Mice were also treated with apocynin, a NADPH oxidase inhibitor. Behavioral outcomes were evaluated 15 days after sepsis with the inhibitory avoidance test and the Morris water maze in control and apocynin-treated WT mice. RESULTS: Acute oxidative damage to the hippocampus was identified by increased 4-HNE expression in parallel with an increase in Nox2 gene expression after sepsis. Pharmacological inhibition of Nox2 with apocynin completely inhibited hippocampal oxidative stress in septic animals. Pharmacologic inhibition or the absence of Nox2 in gp91phox-/- mice prevented glial cell activation, one of the central mechanisms associated with SAE. Finally, treatment with apocynin and inhibition of hippocampal oxidative stress in the acute phase of sepsis prevented the development of long-term cognitive impairment. CONCLUSIONS: Our results demonstrate that Nox2 is the main source of reactive oxygen species (ROS) involved in the oxidative damage to the hippocampus in SAE and that Nox2-derived ROS are determining factors for cognitive impairments after sepsis. These findings highlight the importance of Nox2-derived ROS as a central mechanism in the development of neuroinflammation associated with SAE.

The immunogenicity of chemically derived zwitterionic polysaccharides

Bacterial capsular polysaccharides (PS) which naturally contain zwitterionic charge motifs (ZPS) possess specific immunostimulatory activity, leading to direct activation of antigen-presenting cells (APCs) through Toll-like receptor 2 (TLR2) and of T cells in co-culture systems. When administered intraperitoneally, ZPS and bacteria expressing them are involved in the induction or regulation of T-cell dependent inflammatory processes such as intra-abdominal abscess formation. Moreover it has been published that ZPSs are processed to low molecular weight carbohydrates and presented to T cells through a pathway similar to that used for protein antigens. These findings were in contrast with the paradigm according to which polysaccharides are T-independent antigens unable to be presented in association with MHC class II molecules and unable to induce a protective immune response. For this reason in glycoconjugate vaccines polysaccharides often need to be conjugated to a carrier protein to induce protection. The aim of our work was to generate vaccine candidates with antigen and adjuvant properties in one molecule by the chemical introduction of a positive charge into naturally anionic PS from group B streptococcus (GBS). The resulting zwitterionic PS (ZPS) has the ability to activate human and mouse APCs, and in mixed co-cultures of monocytes and T cells, ZPS induce MHC II-dependent T-cell proliferation and up-regulation of activation markers. TLR2 transfectants show reporter gene transcription upon incubation with ZPS and these stimulatory qualities can be blocked by anti-TLR2 mAbs or by the destruction of the zwitterionic motif. However, in vivo, ZPS used alone as vaccine antigen failed to induce protection against GBS challenge, a result which does not confirm the above mentioned postulate that ZPS are T-cell dependent Ags by virtue of their charge motif. Thus to make ZPS visible to the immune system we have conjugated ZPS with a carrier protein. ZPS-glycoconjugates induce higher T cell and Ab responses to carrier and PS, respectively, compared to control PS-glycoconjugates made with the native polysaccharide form. Moreover, protection of mothers or neonate offspring from lethal GBS challenge is better when mothers are immunized with ZPS-conjugates compared to immunization with PS-conjugates. In TLR2 knockout mice, ZPS-conjugates lose both their increased immunogenicity and protective effect after vaccination. When ZPS are co-administered as adjuvants with unconjugated tetanus toxoid (TT), they have the ability to increase the TT-specific antibody titer. In conclusion, glycoconjugates containing ZPS are potent vaccines. They target Ag to TLR2-expressing APCs and activate these APCs, leading to better T cell priming and ultimately to higher protective Ab titers. Thus, rational chemical design can generate potent novel PS-adjuvants with wide application, including glycoconjugates and co-administration with unrelated protein Ags.

Untersuchungen zur Reparatur und Mutagenität oxidativer DNA-Schäden in vivo und deren Bedeutung für die Kanzerogenese

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung, welche Rolle endogen gebildete oxidative DNA-Modifikationen bei der Kanzerogenese spielen. Dazu wurden Cockayne Syndrom B-knockout-Mäuse (Csb-/-), 8-Hydroxyguanin-DNA-Glykosylase-knockout-Mäuse (Ogg1-/-) und Csb-/-/Ogg1-/- Mäuse generiert, die das bakterielle lacI-Gen (Big Blue®) tragen und somit für in vivo Mutationstests eingesetzt werden können. Die Ergebnisse zeigen, dass es in den Lebern der Ogg1-/- Mäuse zu einem 2,1-fachen und in Csb-/-/Ogg1-/- Mäusen zu einem statistisch signifikanten 3,3-fachen Anstieg der Mutationsfrequenz kommt. Die gefundene Erhöhung der Mutationsfrequenz war vor allem auf eine Erhöhung der G:C zu T:A Transversionen zurückzuführen, die typischerweise aus nicht repariertem 8 Hydroxyguanin (8-oxoG) entstehen. Aus mechanistischer Sicht verdeutlichen die Ergebnisse, dass OGG1 das primäre Abwehrsystem gegen oxidative DNA-Modifikationen darstellt und dass das CSB-Protein einen Ausfall von OGG1, selbst in nicht transkribierter DNA, teilweise kompensieren kann. Aus der Korrelation der gefundenen oxidativen DNA-Schäden - bestimmt mittels Alkalischer Elution und der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (Fpg-Protein) - mit der Mutationsfrequenz konnte abgeleitet werden, dass bereits weniger als 0,2 Fpg-sensitive DNA-Modifikationen pro 1 Million Basenpaare ausreichen, die spontane Mutationsfrequenz in vivo zu verdoppeln. Zur Untersuchung, welche Rolle die erhöhte Mutationsfrequenz bei der Krebsentstehung spielt, wurden Csb-/-/Ogg1-/- und Wildtyp-Mäuse mit dem Peroxisomenproliferator und spezifischem Leberpromotor WY-14,643 behandelt um spontan initiierte Hepatozyten zur Proliferation anzuregen. Als Endpunkt einer malignen Entartung wurde das Auftreten von Glucose-6-Phosphatase positiven und negativen Läsionen beobachtet. Es zeigte sich, dass Csb-/-/Ogg1-/- Mäuse signifikant mehr enzymveränderte Läsionen in ihren Lebern aufwiesen, als die Wildtyp-Kontrollen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass endogen gebildete oxidative DNA-Modifikationen und daraus resultierende Mutationen grundsätzlich einen erheblichen Anteil zur hohen spontanen Krebsinzidenz in der Bevölkerung leisten könnten.

In vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Immunantwort und Parasitenentwicklung bei Infektionen mit dem Darmparasiten Cryptosporidium parvum

Cryptosporidium parvum ist ein intrazellulärer protozoischer Darmparasit (Apikomplexa), der weltweit zu den bedeutendsten Erregern von Diarrhöen beim Menschen und einer Reihe von Nutztieren zählt. Vor allem immunkompromittierte Personen wie zum Beispiel AIDS-Patienten erleiden schwere, chronische bis lebensbedrohende Erkrankungen. Da nach wie vor keine effektive Therapie gegen eine Kryptosporidiose in Form eines spezifisch wirkenden Chemotherapeutikums oder einer Vakzine existiert, ist es notwendig, die Immunantwort des Wirtes gegen den Parasiten und dessen Bindung, Invasion und die intrazelluläre Entwicklung in den Epithelzellen eingehend zu studieren, um neue Ansatzpunkte zu entwickeln. Wohingegen Menschen zeitlebens suszeptibel für eine Infektion mit C. parvum sind, entwickeln Mäuse eine natürliche Resistenz und können als adulte Tiere nicht mehr infiziert werden. Daher sind Mausmodelle der Kryptosporidiose auf neonatale oder immunsupprimierte und immundefiziente adulte Mäuse beschränkt. Bei der Überwindung einer C. parvum-Infektion sind Effektoren der natürlichen und adaptiven Immunität beteiligt. Die zentrale Rolle spielen CD4+-T-Zellen, sowie Interferon-gamma und Interleukin-12. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Infektionen in IFN-gamma (GKO)- und IL-12 p40 (IL12KO)-Knockout-Mäusen (C57BL/6) etabliert, für die bereits gezeigt wurde, dass sie eine Suszeptibilität gegenüber einer Erstinfektion besitzen. Erstmals wurden die beiden Infektionsmodelle parallel unter denselben Bedingungen analysiert, um Rückschlüsse auf die Funktion und die Bedeutung der beiden Th1-Zytokine IFN-gamma und IL-12 bei der Auseinandersetzung mit dem Parasiten und der Überwindung einer Infektion ziehen zu können. Es wurden deutliche Unterschiede im Infektionsverlauf, bei der Höhe und Dauer der Parasitenausscheidung und der induzierten systemischen und mukosalen Antikörperantwort beobachtet. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass neben IL12KO auch GKO in der Lage sind, eine erste Infektion zu überwinden und eine Resistenz gegenüber einer erneuten Konfrontation mit dem Parasiten zu entwickeln. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Etablierung einer protektiven Immunität gegen eine Kryptosporidiose generell unabhängig von der Anwesenheit der Zytokine IFN-gamma und IL-12 ist, der Verlust von IFN-gamma jedoch schwerer wiegt. Bei GKO-Mäusen persistierte der Parasit in Form einer niedriggradigen chronischen Infektion. Die beiden Infektionsmodelle stellten sich als ideales System für die Etablierung einer effektiven Immunisierungsstrategie heraus. Intranasale Immunisierungen, welche neben einer systemischen auch eine mukosale Immunantwort induzieren können, schienen einen richtigen Ansatz darzustellen. Intraperitoneale und subkutane Immunisierungen führten zwar zur Ausbildung einer starken spezifischen IgG-Antwort im Serum, diese war jedoch nicht in der Lage, einen Schutz vor einer Infektion zu vermitteln. Neben den in vivo Untersuchungen wurde des Weiteren auch die intrazelluläre Entwicklung von C. parvum in einem in vitro Kultursystem verfolgt. Zum ersten Mal wurde die Genexpression von vier Oberflächenproteinen der invasiven Zoitenstadien und eines Oozystenwandproteins parallel durch RT-PCR analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Gene während der intrazellulären Entwicklung differentiell exprimiert werden, was eine unterschiedliche Funktion der Proteine während des Entwicklungszyklus nahe legt. Das Expressionsmuster der verschiedenen Gene charakterisiert bestimmte Abschnitte innerhalb des Entwicklungszyklus. Dabei wurden Marker für die Invasion (CP17) sowie für die asexuelle (GP900) und sexuelle Replikation (COWP) identifiziert.

Funktion des Rezeptors der sekretorischen Phospholipasen A 2 bei der Signaltransduktion in glomerulären Mesangiumzellen und entzündlichen Erkrankungen der Niere

Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind Enzyme, welche die Hydrolyse der Esterbindung an der sn-2-Position von Phospholipiden katalysieren, wodurch freie Fettsäuren, welche als Vorläufermolekül von Eicosanoiden dienen, freiwerden. Außerdem wurde gezeigt, dass sPLA2s auch unabhängig von ihrer katalytischen Aktivität durch die Bindung an einen spezifischen sPLA2-M-Typ-Rezeptor (MTR) intrazelluläre Signalwege, wie z.B. die Induktion von proinflammatorischen Genen, aktivieren können. Deshalb wurden in dieser Arbeit weiterführende Studien zur Aufklärung der Lokalisation und der Signaltransduktion der sPLA2s sowie die Bedeutung des MTR durchgeführt. Als Zellmodell für in-vitro-Studien wurden glomeruläre Mesangiumzellen verwendet, da diese Zellen eine zentrale Rolle bei entzündlichen Nierenerkrankungen, wie z.B. der Glomerulonephritis spielen. Durch Isolierung von Mesangiumzellen aus MTR-knockout-Mäusen (C57BL/6) sollten potentielle Unterschiede in der MTR-vermittelten Signaltransduktion im Vergleich zu Mesangiumzellen isoliert aus (C57BL/6) Wildtyp-Mäusen herausgearbeitet werden. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass verschiedene sPLA2-Enzyme in Maus-Mesangiumzellen exprimiert werden und diese an der konstitutiven Biosynthese von Prostaglandinen beteiligt sind. Der spezifische M-Typ-Rezeptor wird in diesen Zellen im Gegensatz zu Ratten-Mesangiumzellen weder unter physiologischen noch unter proinflammatorischen Bedingungen exprimiert und spielt daher vermutlich keine Rolle bei der Signaltransduktion durch sPLA2s.

Conditional and transgenic mouse models as tools to study the role of TGFbeta, BMP signaling in skeletal development

Die TGFbeta/BMP Signaltransduktionskaskade ist wichtig für viele Entwicklungsprozesse fast aller embryonaler sowie extraembryonaler Gewebe und sie ist ebenso essentiell bei der Aufrechterhaltung der Homöostase im adulten Organismus. In vielen Mausmodellen und Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Liganden dieses Signalweges in verschiedene Stadien der Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. BMPs sind beispielsweise maßgeblich an der frühen Kondensation und Bildung des Knorpels und später an Proliferation und Hypertrophie der Chondrozyten beteiligt. BMPs können ektopisch Knochenbildung auslösen und das Expressionsmuster der Liganden und spezifischen Rezeptoren in der Wachstumsfuge lässt auf eine wichtige Rolle der BMPs in der Wachstumsfuge schließen. Der gezielte knock out der BMP-Rezeptoren Bmpr1a und Bmpr1b in proliferierenden Chondrozyten führt zur Ausbildung einer generellen Chondrodysplasie. Smad1, Smad5 und Smad8 sind die Mediatoren der BMP-Signalkaskade. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Funktion der Smad1- und Smad5-Proteine in der Wachstumsfuge untersucht werden. Hierzu wurden konditionale Smad1-knock out-Mäuse mit einer transgenen Mauslinie gekreuzt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in proliferierenden Chondrozyten exprimiert. Diese Mäuse wurden mit und ohne heterozygotem Smad5-Hintergrund charakterisiert. Bei einem knock out von Smad1 allein konnte ein leichte Verkürzung der Wachstumsfuge beobachtet werden, wobei prähypertrophe und hypertrophe Zone gleichermaßen betroffen waren. Dieser Phänotyp war verstärkt in Mäusen mit zusätzlichem heterozygotem Smad5-Hintergrund. Eine Verringerung der Proliferationsrate konnte zusammen mit einer verminderten Ihh-Expression nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte anhand von Röntgenaufnahmen eine Dysorganisation der nasalen Region und ein fehlendes nasales Septum beobachtet werden. Produktion und Mineralisation der extrazellulären Matrix waren nicht beeinträchtigt. Um die Rolle der BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden während der endochondralen Ossifikation zu vergleichen, wurden transgene Mäuse generiert, in denen die TGFbeta-Signalkaskade spezifisch in proliferierenden Chondrozyten gestört war. Zwei Mauslinien, die ähnliche Phänotypen zeigten, wurden untersucht. Esl1 ist ein TGFbeta-bindendes Protein, von dem man annimmt, dass es die TGFbeta-Signalkaskade inhibieren kann. Esl1-knock out-Mäuse sind kleiner als Wildtypmäuse und die Überexpression von Esl1 in proliferierenden Chondrozyten führt zu einer Verlängerung der Wachstumsfuge und einer verstärkten Proliferationsrate. Knorpelmarker, wie Col2a1 und Sox9 sind in diesen Mäusen herunterreguliert, während Col10a1 und Ihh als Marker für die hypertrophe und prähypertrophe Zone herunterreguliert waren. Dies führt zu der Annahme, dass mehr Zellen in die terminale Differenzierung eintreten. Bei transgenen Mäusen, in denen ein dominant-negativer (dn) TGFbeta-Rezeptor in proliferierenden Chondrozyten überexprimiert wurde, konnte eine verlängerte prähypertrophe Zone, eine erhöhte Ihh-Expression, sowie eine verstärkte Proliferationsrate beobachtet werden. Zusätzlich konnte in homozygoten Tieren ein craniofacialer Phänotyp beschrieben werden, der zu Problemen bei der Nahrungsaufnahme und damit zu einer starken Wachstumsbeeinträchtigung führte. Die BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden haben möglicherweise antagonistische Effekte in der Wachstumsfuge. Während der Ausfall von BMP in proliferierenden Chondrozyten aufgrund einer gesunkenen Proliferationsrate zu einer Verkürzung der Wachstumsfuge führte, kann man in Mäusen mit einer Störung der TGFbeta-Signalkaskade eine verstärkte Proliferation in einer daher verlängerten Wachstumsfuge beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Generation einer transgenen Mauslinie, die die Cre-Rekombinase spezifisch in hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Promoterstudien mit transgenen Mäusen weisen darauf hin, dass ein putatives AP1-Element, etwa 4 kb vor dem ersten Exon des Col10a1 gelegen, wichtig für die spezifische Expression in hypertrophen Chondrozyten ist. Ein Konstrukt, dass vier Kopien dieses Elements und den basalen Promoter enthält, wurde benutzt, um die Cre-Rekombinase spezifisch zu exprimieren. Diese Mauslinie befindet sich in der Testphase und erste Daten deuten auf eine spezifische Expression der Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrozyten hin.