Ethanol induces vascular relaxation via redox-sensitive and nitric oxide-dependent pathways

We investigated the role of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) in ethanol-induced relaxation. Vascular reactivity experiments showed that ethanol (0.03-200 mmol/L) induced relaxation in endothelium-intact and denuded rat aortic rings isolated from male Wistar rats. Pre-incubation of intact or denuded rings with L-NAME (non selective NOS inhibitor, 100 mu mol/L), 7-nitroindazole (selective nNOS inhibitor, 100 mu mol/L), ODQ (selective inhibitor of guanylyl cyclase enzyme, I mu mol/L), glibenclamide (selective blocker of ATP-sensitive K+ channels, 3 mu mol/L) and 4-aminopyridine (selective blocker of voltage-dependent K+ channels, 4-AP, 1 mmol/L) reduced ethanol-induced relaxation. Similarly, tiron (superoxide anion (O-2(-)) scavenger, 1 mmol/L) and catalase (hydrogen peroxide (H2O2) scavenger, 300 U/mL) reduced ethanol-induced relaxation to a similar extent in both endothelium-intact and denuded rings. Finally, prodifen (non-selective cytochrome P450 enzymes inhibitor, 10 mu mol/L) and 4-methylpyrazole (selective alcohol dehydrogenase inhibitor, 10 mu mol/L) reduced ethanol-induced relaxation. In cultured aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs), ethanol stimulated generation of NO, which was significantly inhibited by L-NAME. In endothelial cells, flow cytometry studies showed that ethanol increased cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c), O-2(-) and cytosolic NO concentration ([NO]c). Tiron inhibited ethanol-induced increase in [Ca-2]c and [NO]c. The major new finding of this work is that ethanol induces relaxation via redox-sensitive and NO-cGMP-dependent pathways through direct effects on ROS production and NO signaling. These findings identify putative molecular mechanisms whereby ethanol, at pharmacological concentrations, influences vascular reactivity. (C) 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.

Chronic Stress Improves the Myocardial Function without Altering L-type Ca+2 Channel Activity in Rats

Background: Chronic stress is associated with cardiac remodeling; however the mechanisms have yet to be clarified. Objective: The purpose of this study was test the hypothesis that chronic stress promotes cardiac dysfunction associated to L-type calcium Ca2+ channel activity depression. Methods: Thirty-day-old male Wistar rats (70 - 100 g) were distributed into two groups: control (C) and chronic stress (St). The stress was consistently maintained at immobilization during 15 weeks, 5 times per week, 1h per day. The cardiac function was evaluated by left ventricular performance through echocardiography and by ventricular isolated papillary muscle. The myocardial papillary muscle activity was assessed at baseline conditions and with inotropic maneuvers such as: post-rest contraction and increases in extracellular Ca2+ concentration, in presence or absence of specific blockers L-type calcium channels. Results: The stress was characterized for adrenal glands hypertrophy, increase of systemic corticosterone level and arterial hypertension. The chronic stress provided left ventricular hypertrophy. The left ventricular and baseline myocardial function did not change with chronic stress. However, it improved the response of the papillary muscle in relation to positive inotropic stimulation. This function improvement was not associated with the L-type Ca2+ channel. Conclusion: Chronic stress produced cardiac hypertrophy; however, in the study of papillary muscle, the positive inotropic maneuvers potentiated cardiac function in stressed rats, without involvement of L-type Ca2+ channel. Thus, the responsible mechanisms remain unclear with respect to Ca2+ influx alterations. (Arq Bras Cardiol 2012;99(4):907-914)

Induktion und Signaltransduktion bei der Expression des Chemokins MCP-1 in Monozyten

Das Chemokin 'Monocyte Chemoattractant Protein-1' (MCP-1) spielt bei inflammatorischen Erkrankungen eine wesentliche Rolle. Verschiedene Zelltypen produzieren MCP-1. Es interessierte, welche Stimuli in Monozyten MCP-1 induzieren k��nnen und welche Signaltransduktionskaskaden daran beteiligt sind. Dar��ber hinaus sollte die Rolle einzelner Transkriptionsfaktoren und Promotorregionen des MCP-1-Gens untersucht werden.Komponenten Gram-positiver und -negativer Bakterien, Phorbolester und Substanzen, die die intrazellul��re Calciumkonzentration erh��hen, induzierten die MCP-1-Expression in einer humanen myelomonozyt��ren Zellinie (THP-1) und in frisch isolierten Monozyten. Die mit Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte MCP-1-Expression war stark von der MAPK/ERK-Kinase (MEK)-1/-2 und von I-kappaB Kinasen beziehungsweise NF-kappaB abh��ngig, dagegen scheinen Calcineurin, Calmodulinkinasen und die 'Mitogen-Activated Protein Kinase' p38 keine entscheidende Rolle zu spielen. Die Thapsigargin (TG)-induzierte MCP-1-Bildung durch Erh��hung der intrazellul��ren Calciumkonzentration war zus��tzlich von Calcineurin und Calmodulinkinasen abh��ngig. Als nukle��re Transkriptionsfaktoren wurden bei der LPS-Stimulation NF-kappaB sowie AP-1 und zus��tzlich NF-ATc3 bei Stimulation durch TG nachgewiesen. Die Untersuchung des MCP-1-Promotors konnte eine Bindung von NF-kappaB- und AP-1-Mitglieder an eine bislang nicht untersuchte distale Region und eine AP-1-Bindung an eine proximale Region nachweisen. Die Ergebnisse lassen den Schlu�� zu, da�� die Aktivierung der MCP-1-Expression durch verschiedene Stimuli unter Beteiligung teilweise unterschiedlicher Signaltransduktionswege abl��uft und sowohl eine proximale als auch eine distale Promotorregion des MCP-1-Gens daran beteiligt ist.

Elektrophysiologische Charakterisierung und PKC-vermittelte Regulation des humanen Transporters f��r basische Aminos��uren hCAT-1

ZusammenfassungDer humane kationische Aminos��ure-Transporter hCAT-1 (CAT f��r cationic amino acid transporter) geh��rt zur Familie der Na+- und pH-unabh��ngigen Transporter f��r basische Aminos��uren (BAS). Die vorliegende Arbeit befasst sich mit unterschiedlichen Aspekten des hCAT-1-vermittelten Transportes, die in zwei Teilabschnitten behandelt werden. Im ersten Abschnitt wurden die Transporteigenschaften von hCAT-1-exprimierenden X. laevis-Oozyten mit Hilfe von elektrophysiologischen Methoden untersucht und mit denen der Isoformen hCAT-2A und -2B verglichen. Dabei zeigte sich, dass es durch die Expression von hCAT-2A und -2B in Oozyten zur Bildung eines BAS-Potentiales kommt, jedoch nicht durch die Expression von hCAT-1. Hierf��r d��rfte die hohe Transstimulierbarkeit des hCAT-1-Proteins verantwortlich sein. Obwohl das Membranpotential einer Zelle die Akkumulation von BAS durch die hCAT-Proteine beeinflusst, war bei sehr hohen extrazellul��ren BAS-Konzentrationen die Akkumulation durch hCAT-1 und -2B im Gegensatz zu hCAT-2A nicht vom Membranpotential abh��ngig, da unter diesen Bedingungen der Efflux limitierend wirkte. Mit Hilfe der voltage clamp-Methode wurden die L-Arginin-induzierten Maximalstr��me (Vmax) und die Leitf��higkeiten der hCAT-Proteine bestimmt. Die so ermittelten Vmax-Werte sind nur halb so gro�� wie die durch Flux-Studien bestimmten. Daher muss von einem Gegentransport an positiver Ladung (Substrat) ausgegangen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die hCAT-Isoformen zwei unterschiedliche Leitf��higkeitszust��nde f��r BAS besitzen, die von der intrazellul��ren BAS-Konzentration abh��ngig sind. Eine Leitf��higkeitszunahme durch Zugabe von extrazellul��rem L-Arginin konnte bei allen hCAT-Isoformen in depletierten Oozyten beobachtet werden. In BAS-beladenen Oozyten f��hrte die Zugabe von L-Arginin dagegen zu keiner (hCAT-1 und hCAT-2B) bzw. zu einer geringen (hCAT-2A) Zunahme der Leitf��higkeit der Transporter. Im Substratgleichgewicht jedoch nahm die Leitf��higkeit der drei untersuchten hCAT-Isoformen in Abh��ngigkeit von der Substratkonzentration zu. ��berraschenderweise wurden f��r die untersuchten hCAT-Isoformen Leck-Str��me in Abwesenheit von BAS nachgewiesen. An hCAT-2B-exprimierenden Oozyten wurde eine erh��hte Leitf��higkeit f��r K+-Ionen gezeigt. Die physiologische Bedeutung dieser Kanalfunktion ist jedoch noch v��llig ungekl��rt. Im zweiten Abschnitt wurde der Mechanismus der Proteinkinase C (PKC)-vermittelten Inhibition der hCAT-1-Transportaktivit��t untersucht. Hierf��r wurden hCAT-1.EGFP-Konstrukte in Oozyten und in U373MG Glioblastom-Zellen exprimiert. Mit Hilfe konfokaler Mikroskopie und Western-Blot-Analysen von biotinylierten Zelloberfl��chen-Proteinen wurde gezeigt, dass die PKC-vermittelte Reduktion der hCAT-1-Transportaktivit��t auf einer Reduktion der hCAT-Expression an der Zelloberfl��che beruht. ��hnliche Ergebnisse wurden auch mit dem endogen in humanen DLD-1 Kolonkarzinom-Zellen exprimierten hCAT-1 erzielt. Der PKC-Effekt war auch noch nach Entfernung der putativen PKC-Erkennungsstellen am hCAT-1-Protein vorhanden. Daher reguliert die PKC die hCAT-1-Transportaktivit��t vermutlich ��ber einen indirekten Mechanismus, d. h. nicht ��ber eine direkte Phosphorylierung des hCAT-1-Proteins. Die Ver��nderung der Zelloberfl��chenexpression stellt einen neuen Regulationsmechanismus f��r die CAT-Proteine dar, der erkl��ren kann, warum sich Modifikationen in der CAT-Proteinexpression oft nicht in entsprechenden Ver��nderungen der Transportaktivit��t widerspiegeln.

Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenstr��me an nozizeptiven Spinalganglienneuronen der Ratte

Die freien Endigungen von Spinalganglienneuronen sind f��r die Detektion schmerzhafter Reize verantwortlich. Dabei rufen thermische, chemische oder mechanische Reize Ionenstr��me ��ber die Membran und dadurch Membranpotential��nderungen hervor. Diese noxisch induzierten Str��me sind in gro��em Ausma�� durch chemische Substanzen und andere Reize modulierbar. Der Ionenkanal TRPV1 ist f��r die Detektion zahlreicher chemischer Reize und zumindest eines Teils der noxischen Hitzereize verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige der Mechanismen gekl��rt, die zur schnellen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenstr��me f��hren. Hierf��r wurden akut dissoziierte Spinalganglienneurone der Ratte als Modell ihrer peripheren Endigung verwendet und mittels Ganzzellableitung in der patch-clamp-Technik untersucht. Die Verwendung von Trypsin w��hrend der Pr��paration von Spinalganglienneuronen hat keinen funktionellen Einfluss auf hitze- oder capsaicininduzierte Str��me, verbessert aber die Untersuchungsbedingungen f��r das patch-clamp-Verfahren. Bei 144 akut dissoziierten Spinalganglienneuronen wurden die Stromantworten auf drei im Abstand von 40 s durch ��bersp��len mit 45,3 bis 46,3��C hei��er Extrazellularl��sung applizierte einsek��ndige Hitzereize gemessen. Dabei lie��en sich repetitiv reproduzierbare hitzeinduzierte Einw��rtsstr��me von etwa 160 pA erzielen; es konnte keine Tachyphylaxie und nahezu keine Inaktivierung beobachtet werden. Direkt vor dem zweiten Hitzereiz wurden die Neurone f��r zwei Sekunden mit Extrazellularl��sung ��bersp��lt, die Kontrolll��sung, 0,5 ��M Capsaicin, 10 ��M Natriumnitroprussid oder 10 ��M YC-1 enthielt. Es fand sich kein Hinweis, dass Stickstoffmonoxid oder die Guanylatzyklase einen signifikanten Beitrag zur Sensibilisierung von hitzeinduzierten Str��men in Spinalganglienneuronen leisten, wobei ein durch den Versuchsaufbau bedingtes Auswaschen zytosolischer Faktoren, die f��r den Signalweg notwendig sind, nicht ausgeschlossen werden kann. Bei einer Konzentration von 0,5 ��M l��st Capsaicin f��r zwei Sekunden einen sehr kleinen Einw��rtsstrom von etwa 33 pA aus und f��hrt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung von hitzeinduzierten Einw��rtsstr��men in Spinalganglienneuronen (p<0,01). Das Ausma�� der Sensibilisierung ist proportional zur Gr����e des capsaicininduzierten Stromes (r=���0,7, p<0,001). Konstant halten der intrazellul��ren Calciumkonzentration mittels des Calciumchelators BAPTA verhindert die capsaicininduzierte Sensibilisierung hitzeinduzierter Str��me an Spinalganglienneuronen. Demzufolge beruht die capsaicininduzierte Sensibilisierung trotz der schnellen Kinetik nicht auf einer synergistischen Wirkung der beiden Agonisten Capsaicin und Hitze auf ihren gemeinsamen Rezeptor; vielmehr ist sie von einer Erh��hung der intrazellul��ren freien Calciumkonzentration abh��ngig. Funktionelle ��nderungen der zellul��ren Funktion werden h��ufig durch Proteinkinasen vermittelt. Die zur Gruppe der MAP-Kinasen geh��rende ERK (extracellular signal related kinase) wird bei Membrandepolarisation und Calciumeinstrom in die Zelle durch MEK (MAPK/extracellular signal related kinase kinase) aktiviert. Blockade der MEK/ERK-Kaskade durch den spezifischen MEK-Hemmstoff U0126 f��hrt ebenfalls zu einer Aufhebung der Sensibilisierung der Hitzeantworten durch Capsaicin. Applikation von Capsaicin f��hrt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenstr��me an nozizeptiven Spinalganglienneuronen. Diese Sensibilisierung wird durch einen Calciumeinstrom in die Zelle und die dadurch eintretende Aktivierung von Proteinkinasen hervorgerufen. Die MEK/ERK-Kaskade ist ein sehr schnell (deutlich unter 2 s) aktivierbares intrazellul��res Signalsystem, welches bei der Regulation der Empfindlichkeit nozizeptiver Spinalganglienneurone eine entscheidende Rolle spielt; die schnelle Kinetik ist dabei nur durch eine membranst��ndige oder zumindest membrannahe Lokalisation dieser Proteinkinasen erkl��rbar. Durch Applikation zehnsek��ndiger Hitzereize l��sst sich ebenfalls eine Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenstr��me ausl��sen, die ebenso ausgepr��gt ist, wie die Sensibilisierung durch 0,5 ��M Capsaicin (p<0,005). Durch das immer gr����ere Verst��ndnis der Funktionsweise des nozizeptiven Systems ergeben sich st��ndig neue Ans��tze f��r die Entwicklung neuer Analgetika. So k��nnte durch Modulation spezifischer intrazellul��rer Proteinkinasen der Phosphorylierungszustand und damit die Aktivierbarkeit von Ionenkan��len, die der Transduktion noxischer Reize dienen, positiv beeinflusst werden. Neuere, noch spezifischere Inhibitoren der MEK k��nnen der Forschung und sp��ter auch der Therapie neue M��glichkeiten er��ffnen.

Synthese, 18 F-Markierung, 11 C-Markierung und Evaluierung Hydantoin-substituierter Indolcarbons��uren zur Visualisierung des NMDA-Rezeptorstatus mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)

Der N-methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA), als Vertreter ionotroper Glutamat-Rezeptoren, ist essentiell f��r physiologische Lern- und Ged��chtnisvorg��nge und eine krankhafte ��beraktivierung wird als potentielle Ursache f��r eine Reihe von akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen angesehen. Hierbei sind f��r die akuten Erkrankungen vor allem der Schlaganfall und f��r die chronischen Erkrankungen Morbus Parkinson sowie die Alzheimer��sche Demenz zu nennen. Durch seine einzigartige spannungsabh��ngige Mg2+-Blockade und der Notwendigkeit der gleichzeitigen Anwesenheit der endogenen Liganden Glutamat und Glycin zur Rezeptoraktivierung, stellt dieser Rezeptorkomplex daher ein sehr interessantes molekulares Target dar. NMDA-Rezeptor-Antagonisten der Glycin-Bindungsstelle und der verschiedenen allosterischen Bindungsstellen k��nnten als Neuroprotektiva bei den verschiedenen Krankheiten eine symptomatische Verbesserung bewirken und zur Therapie eingesetzt werden. Eine visuelle Darstellung des Rezeptors im Rahmen von Vorsorgeuntersuchungen ist jedoch derzeit nicht m��glich. Zur Visualisierung dieser Prozesse mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wurden basierend auf einer Hydantoin-substituierten Indol-2-carbons��ure als Leitstruktur, im Rahmen dieser Arbeit Fluorethoxy- und Methoxy-substituierte Derivate dargestellt und in pharmazeutischen und radiopharmazeutischen Studien evaluiert. Dazu wurde die Affinit��t und Spezifit��t zum Rezeptor in einem [3H]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassay und die Lipophilie als Parameter f��r die Hirng��ngigkeit ermittelt. Anhand dieser Resultate wurden geeignete Markierungsvorl��ufer synthetisiert, welche eine phenolische Hydroxylfunktion besitzen und eine radioaktive Markierung mit den sekund��ren Markierungsvorl��ufern 2-[18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [11C]Methyliodid ([11C]CH3I) erm��glichen. Unter Verwendung von 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ure wurde in einer Einstufenreaktion mit [18F]FETos die Zielverbindung 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ure in radiochemischen Ausbeuten von 6 % erhalten. Daher wurde eine alternative Markierung des Ethylester-gesch��tzten Derivates 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ureethylester in einer Zweistufensynthese mit [18F]FETos und [11C]CH3I untersucht. Unter Verwendung dieser Strategie wurden unter optimierten Bedingungen 4,6-Dichlor-3-((3-4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ureethylester und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxy-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)-methyl)-indol-2-carbons��ureethylester in radiochemischen Ausbeuten von 27 ��� 38 % erhalten. Die anschlie��ende Entfernung der Schutzgruppe f��hrte unter Bildung von Neben- und Zersetzungsreaktionen zu 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ure und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ure in radiochemischen Gesamtausbeuten von 5 ��� 7 %. Die ��berpr��fung des biochemischen Konzepts in vivo durch ��-PET-Studien und durch autoradiographische Experimente an Rattenhirnschnitten, deuten auf eine niedrige in vivo-Aktivit��t hin, welche sich auf eine nicht ausreichende Passage der Blut-Hirn-Schranke zur��ckf��hren l��sst.

Mechanismen und funktionelle Konsequenzen der Chlorid-Hom��ostase in unreifen Neuronen des Neocortex

GABA, der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im adulten Gehirn, bewirkt im unreifen Nervensystem eine Membrandepolarisation, vermutlich aufgrund der erh��hten intrazellul��ren Chloridkonzentration ([Cl-]i) in unreifen Nervenzellen. GABAerge Membrandepolarisationen sind essentiell f��r die korrekte Entwicklung des zentralen Nervensystems und die Entstehung kortikaler Netzwerkaktivit��t. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe elektrophysiologischer und immunohistochemischer Methoden die Regulation der Chlorid-Hom��ostase in unreifen Neuronen des Neokortex untersucht. Die Experimente wurden an Cajal-Retzius (CR) Zellen, einem transienten Zelltyp der Marginalzone, in akuten Hirnschnittpr��paraten neonataler Ratten (P0-P3) durchgef��hrt. Es konnte gezeigt werden, dass CR Zellen eine hohe native [Cl-]i von ~30 mM aufweisen. Die hohe [Cl-]i wurde ausschlie��lich durch Bumetanid sensitiven und Na+-abh��ngigen aktiven Cl--Transport aufrechterhalten, was auf eine Cl--Akkumulation durch den Kationen-Chlorid-Cotransporter NKCC1 schlie��en l��sst. Diese pharmakologischen Hinweise konnten durch den Nachweis der Expression von NKCC1 in der gesamten Marginalzone, speziell in CR Zellen, best��tigt werden. Die Transportgeschwindigkeit der NKCC1-abh��ngigen Cl--Akkumulation war gering, was auf eine limitierte Transportkapazit��t schlie��en l��sst. In ��bereinstimmung mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Cl--Leitf��higkeit in CR Zellen ��u��erst klein ist, so dass die NKCC1-abh��ngige Cl--Akkumulation ausreichend war, um unter Ruhebedingungen eine hohe [Cl-]i zu gew��hrleisten. Aufgrund dieser hohen [Cl-]i waren GABAA-Rezeptor vermittelte Antworten in CR Zellen exzitatorisch. Die Kapazit��t des NKCC1-vermittelten Cl--Transportes in CR Zellen konnte durch h��herfrequente Stimulation ��berschritten werden, was dazu f��hrte, dass die [Cl-]i abnahm und GABAerge Antworten unter diesen Bedingungen inhibitorisch wurden. Die inhibitorische Wirkung von GABA in CR Zellen wurde ��berwiegend durch die Reduktion des Eingangswiderstandes der Zelle vermittelt und beruhte nicht auf einer Verschiebung der Aktionspotentialschwelle.

Asymmetrisches Dimethylarginin als kardiovaskul��rer Risikofaktor : Transportmechanismen und Auswirkungen einer Akkumulation

Die vorliegende Dissertation besch��ftigt sich mit dem Membrantransporter-vermittelten Export von asymmetrischem Dimethyl-L-Arginin (ADMA) aus der Endothelzelle. Da ADMA-Plasmakonzentrationen mit Erkrankungen wie koronaren Herzkrankheiten, Atherosklerose, Bluthochdruck und Endotheldysfunktion in Verbindung gebracht werden, ist ein effektiver ADMA-Export aus der Zelle heraus unabdingbar. Um den Mechanismus hierf��r aufzukl��ren, wurden die immortalisierte Endothelzelllinie EA.hy926 und weitere prim��re Endothelzellen (humane Umbilikalvenenendothelzellen und Endothelzellen der gro��en und kleinen Herzgef����e) auf die Expression basischer Aminos��uretransporter mittels einer qRT-PCR hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle getesteten Endothelzellen die Aminos��uretransporter hCAT-1, y+LAT1 und y+LAT2 exprimierten. Basierend auf ADMA-Exportdaten, die mit entsprechenden Transporter-��berexprimierenden Xenopus laevis-Oozyten gewonnen wurden, wurde festgestellt, dass alle drei Membrantransporter ADMA exportieren konnten. Der physiologisch wichtige Exportweg f��r intrazellul��r anfallendes ADMA scheint dabei der via y+L zu sein, da es sich hierbei um einen aktiven Exportmechanismus handelt, der im Gegentransport von im humanen Plasma reichlich vorhandenen neutralen Aminos��uren und Natriumionen den nach innen gerichteten Natriumgradienten ausnutzt. Die Wichtigkeit des Membrantransportes f��r die Kontrolle intrazellul��rer ADMA-Konzentrationen wurde in vitro durch Entzug von extrazellul��ren Austauschsubstraten und einer daraus resultierenden Blockade der Transportfunktion gezeigt. Hierbei wurde innerhalb von zwei Stunden ein 2,5-facher Anstieg der intrazellul��ren ADMA-Konzentration festgestellt, die bei Pr��senz von Austauschsubstrat f��r die Transporter nicht auftrat. Die Relevanz der y+LATs f��r den ADMA-Export wurde durch Herunterregulation dieser Proteine mittels siRNA sichtbar: Unter diesen Bedingungen konnte ADMA auch in Anwesenheit von Austauschsubstrat f��r das System y+L weniger effektiv exportiert werden. Eine wichtige Aufgabe des humanen Endothels ist die Bildung bioaktiven Stickstoffmonoxids, das unter anderem eine Vasodilatation der Gef����e bewirkt. F��r diese NO-Synthese wird L-Arginin als Substrat von der endothelialen NO-Synthase ben��tigt. ADMA stellt einen kompetitiven Inhibitor dar, dessen erh��htes intrazellul��res Vorkommen m��glicherweise hemmend auf die NO-Synthase wirken k��nnte. Es konnten hier allerdings keine Auswirkungen eines um das 4-fache gestiegenen, intrazellul��ren ADMA-Spiegels auf die T��tigkeit der endothelialen NO-Synthase festgestellt werden. M��glicherweise bedarf es eines noch weiter zu Gunsten des ADMAs verschobenen, intrazellul��ren L-Arginin:ADMA-Verh��ltnisses, um eine Hemmung der NO-Synthase festzustellen. Dies k��nnte bei einem pathologischen Transporterausfall eintreten, der intrazellul��r permanent h��here ADMA-Konzentrationen zur Folge h��tte. Des Weiteren h��tte ein Anstieg der Arginaset��tigkeit und damit einhergehend ein Substratdefizit f��r die NO-Synthase den gleichen Effekt. Der translationale Ansatz mit humanen peripheren mononukle��ren Blutzellen von Patienten aus der 2. Medizinischen Klinik zeigte die Tendenz einer Korrelation zwischen dem ADMA-Exportverm��gen und der Endothelfunktion und brachte zudem die Erkenntnis eines individuell ��u��erst variablen ADMA-Exportverm��gens zutage.

Role of Magnesium and its mitochondrial transporter MRS2 in the modulation of drug-induced apoptosis leading to multidrug resistance phenotype

Magnesium is an essential element for many biological processes crucial for cell life and proliferation. Growing evidences point out a role for this cation in the apoptotic process and in developing multi drug resistance (MDR) phenotype. The first part of this study aimed to highlight the involvement of the mitochondrial magnesium channel MRS2 in modulating drug-induced apoptosis. We generated an appropriate transgenic cellular system to regulate expression of MRS2 protein. The cells were then exposed to two different apoptotic agents commonly used in chemotherapy. The obtained results showed that cells overexpressing MRS2 channel are less responsiveness to pharmacological insults, looking more resistant to the induced apoptosis. Moreover, in normal condition, MRS2 overexpression induces higher magnesium uptake into isolated mitochondria respect to control cells correlating with an increment of total intracellular magnesium concentration. In the second part of this research we investigated whether magnesium intracellular content and compartmentalization could be used as a signature to discriminate MDR tumour cells from their sensitive counterparts. As MDR model we choose colon carcinoma cell line sensitive and resistant to doxorubicin. We exploited a standard-less approach providing a complete characterization of whole single-cells by combining X-Ray Fluorescence Microscopy , Atomic Force Microscopy and Scanning Transmission X-ray Microscopy. This method allows the quantification of the intracellular spatial distribution and total concentration of magnesium in whole dehydrated cells. The measurements, carried out in 27 single cells, revealed a different magnesium pattern for both concentration and distribution of the element in the two cellular strains. These results were then confirmed by quantifying the total amount of intracellular magnesium in a large populations of cells by using DCHQ5 probe and traditional fluorimetric technique.

Regulatory T cell-mediated suppression of Th9 cell development and effector function

T helper (Th) 9 cells are an important subpopulation of the CD4+ T helper cells. Due to their ability to secrete Interleukin-(IL-)9, Th9 cells essentially contribute to the expulsion of parasitic helminths from the intestinal tract but they play also an immunopathological role in the course of asthma. Recently, a beneficial function of Th9 cells in anti-tumor immune responses was published. In a murine melanoma tumor model Th9 cells were shown to enhance the anti-melanoma immune response via the recruitment of CD8+ T cells, dendritic cells and mast cells. In contrast to Th9 effector cells regulatory T cells (Tregs) are able to control an immune response with the aid of different suppressive mechanisms. Based on their ability to suppress an immune response Tregs are believed to be beneficial in asthma by diminishing excessive allergic reactions. However, concerning cancer they can have a detrimental function because Tregs inhibit an effective anti-tumor immune reaction. Thus, the analysis of Th9 suppression by Tregs is of central importance concerning the development of therapeutic strategies for the treatment of cancer and allergic diseases and was therefore the main objective of this PhD thesis.rnIn general it could be demonstrated that the development of Th9 cells can be inhibited by Tregs in vitro. The production of the lineage-specific cytokine IL-9 by developing Th9 cells was completely suppressed at a Treg/Th9 ratio of 1:1 on the transcriptional (qRT-PCR) as well as on the translational level (ELISA). In contrast, the expression of IRF4 that was found to strongly promote Th9 development was not reduced in the presence of Tregs, suggesting that IRF4 requires additional transcription factors to induce the differentiation of Th9 cells. In order to identify such factors, which regulate Th9 development and therefore represent potential targets for Treg-mediated suppressive mechanisms, a transcriptome analysis using ���next-generation sequencing��� was performed. The expression of some genes which were found to be up- or downregulated in Th9 cells in the presence of Tregs was validated with qRT-PCR. Time limitations prevented a detailed functional analysis of these candidate genes. Nevertheless, the analysis of the suppressive mechanisms revealed that Tregs probably suppress Th9 cells via the increase of the intracellular cAMP concentration. In contrast, IL-9 production by differentiated Th9 cells was only marginally affected by Tregs in vitro and in vivo analysis (asthma, melanoma model). Hence, Tregs represent very effective inhibitors of Th9 development whereas they have only a minimal suppressive influence on differentiated Th9 cells.rn

Heavy metal cations permeate the TRPV6 epithelial cation channel

TRPV6 belongs to the vanilloid family of the transient receptor potential channel (TRP) superfamily. This calcium-selective channel is highly expressed in the duodenum and the placenta, being responsible for calcium absorption in the body and fetus. Previous observations have suggested that TRPV6 is not only permeable to calcium but also to other divalent cations in epithelial tissues. In this study, we tested whether TRPV6 is indeed also permeable to cations such as zinc and cadmium. We found that the basal intracellular calcium concentration was higher in HEK293 cells transfected with hTRPV6 than in non-transfected cells, and that this difference almost disappeared in nominally calcium-free solution. Live cell imaging experiments with Fura-2 and NewPort Green DCF showed that overexpression of human TRPV6 increased the permeability for Ca(2+), Ba(2+), Sr(2+), Mn(2+), Zn(2+), Cd(2+), and interestingly also for La(3+) and Gd(3+). These results were confirmed using the patch clamp technique. (45)Ca uptake experiments showed that cadmium, lanthanum and gadolinium were also highly efficient inhibitors of TRPV6-mediated calcium influx at higher micromolar concentrations. Our results suggest that TRPV6 is not only involved in calcium transport but also in the transport of other divalent cations, including heavy metal ions, which may have toxicological implications.

Sodium nitroprusside induces cell death and cytoskeleton degradation in adult rat cardiomyocytes in vitro: implications for anthracycline-induced cardiotoxicity

Sodium nitroprusside (SNP) is used clinically as a rapid-acting vasodilator and in experimental models as donor of nitric oxide (NO). High concentrations of NO have been reported to induce cardiotoxic effects including apoptosis by the formation of reactive oxygen species. We have therefore investigated effects of SNP on the myofibrillar cytoskeleton, contractility and cell death in long-term cultured adult rat cardiomyocytes at different time points after treatment. Our results show, that SNP treatment at first results in a gradual increase of cytoskeleton degradation marked by the loss of actin labeling and fragmentation of sarcomeric structure, followed by the appearance of TUNEL-positive nuclei. Already lower doses of SNP decreased contractility of cardiomyocytes paced at 2 Hz without changes of intracellular calcium concentration. Ultrastructural analysis of the cultured cells demonstrated mitochondrial changes and disintegration of sarcomeric alignment. These adverse effects of SNP in cardiomyocytes were reminiscent of anthracycline-induced cardiotoxicity, which also involves a dysregulation of NO with the consequence of myofibrillar degradation and ultimately cell death. An inhibition of the pathways leading to the generation of reactive NO products, or their neutralization, may be of significant therapeutic benefit for both SNP and anthracycline-induced cardiotoxicity.

Synthesis and two-photon photolysis of 6-(ortho-nitroveratryl)-caged IP3 in living cells

The synthesis of a photolabile derivative of inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) is described. This new caged second messenger (6-ortho-nitroveratryl)-IP3 (6-NV-IP3) has an extinction coefficient of 5000 M(-1) cm(-1) at 350 nm, and a quantum yield of photolysis of 0.12. Therefore, 6-NV-IP3 is photolyzed with UV light about three times more efficiently than the widely used P(4(5))-1-(2-nitrophenyl)ethyl-caged IP3 (NPE-IP3). 6-NV-IP3 has a two-photon cross-section of about 0.035 GM at 730 nm. This absorbance is sufficiently large for effective two-photon excitation in living cells at modest power levels. Using near-IR light (5 mW, 710 nm, 80 MHz, pulse-width 70 fs), we produced focal bursts of IP3 in HeLa cells, as revealed by laser-scanning confocal imaging of intracellular Ca2+ concentrations. Therefore, 6-NV-IP3 can be used for efficient, subcellular photorelease of IP3, not only in cultured cells but also, potentially, in vivo. It is in the latter situation that two-photon photolysis should reveal its true forte.

Bilinexin, a snake C-type lectin from Agkistrodon bilineatus venom agglutinates platelets via GPIb and alpha2beta1

A new snake protein, named bilinexin, has been purified from Agkistrodon bilineatus venom by ion-exchange chromatography and gel filtration chromatography. Under non-reducing conditions it has a mass of 110 kDa protein on SDS-PAGE. On reduction, it can be separated into five subunits with masses in the range 13-25 kDa. The N-terminal sequences of these subunits are very similar to those of convulxin or the alboaggregins, identifying bilinexin as a new member of the snake C-type lectin family, unusual in having multiple subunits. Bilinexin agglutinates fixed platelets. washed platelets and platelet rich plasma (PRP) without obvious activation (shape change) as confirmed by light microscope examination. Both inhibitory and binding studies indicate that antibodies against alpha2beta1 inhibit not only platelet agglutination induced by bilinexin, but also bilinexin binding to platelets. VM16d, a monoclonal anti-GPIbalpha antibody, completely inhibits platelet agglutination induced by bilinexin, and polyclonal antibodies against GPIbalpha prevent its binding to platelets. However, neither convulxin, polyclonal anti-GPVI antibodies, nor GPIIb/IIIa inhibitors affect its binding to and agglutination of platelets. Bilinexin neither activates GPIIb/IIIa integrin on platelets nor induces tyrosine phosphorylation of platelet proteins, nor increases intracellular Ca2+ in platelets. Like alboaggregin B, bilinexin agglutinates platelets, which makes it a good tool to investigate the differences in mechanism between snake C-type lectins causing platelet agglutination and those that induce full activation.

Fiberoptic system for recording dendritic calcium signals in layer 5 neocortical pyramidal cells in freely moving rats

Calcium influx into the dendritic tufts of layer 5 neocortical pyramidal neurons modifies a number of important cellular mechanisms. It can trigger local synaptic plasticity and switch the firing properties from regular to burst firing. Due to methodological limitations, our knowledge about Ca2+ spikes in the dendritic tuft stems mostly from in vitro experiments. However, it has been speculated that regenerative Ca2+ events in the distal dendrites correlate with distinct behavioral states. Therefore it would be most desirable to be able to record these Ca2+ events in vivo, preferably in the behaving animal. Here, we present a novel approach for recording Ca2+ signals in the dendrites of populations of layer 5 pyramidal neurons in vivo, which ensures that all recorded fluorescence changes are due to intracellular Ca2+ signals in the apical dendrites. The method has two main features: 1) bolus loading of layer 5 with a membrane-permeant Ca2+ dye resulting in specific loading of pyramidal cell dendrites in the upper layers and 2) a fiberoptic cable attached to a gradient index lens and a prism reflecting light horizontally at 90 degrees to the angle of the apical dendrites. We demonstrate that the in vivo signal-to-noise ratio recorded with this relatively inexpensive and easy-to-implement fiberoptic-based device is comparable to conventional camera-based imaging systems used in vitro. In addition, the device is flexible and lightweight and can be used for recording Ca2+ signals in the distal dendritic tuft of freely behaving animals.