Vorkommen und Charakterisierung von Ecdysiotropinen bei männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille Gryllus bimaculatus de Geer

Das Vorkommen von Häutungshormonen in adulten Insekten, insbesondere solcher, die eine lange Imaginalphase durchlaufen, wirft die Frage nach der Regulation der Ecdysteroidsynthese außerhalb der Prothorakaldrüse auf. Unter diesem Gesichtspunkt kann Gryllus bimaculatus mit einem ausgesprochen langen Adultstadium und rapiden zeitlichen Veränderungen des Ecdysontiters als ein geeignetes Versuchsobjekt angesehen werden.Der vorliegenden Dissertation liegt die Arbeitshypothese zugrunde, daß die Ecdysteroid-Synthese bzw. Sekretion von Adultgeweben in männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille durch Neuropeptide hormonell reguliert wird. Als Quelle für die Ecdysteroidsynthese wurde auf Grund immunohistochemischer Befunde sowie der Ergebnisse von Sekretionsprofil-Analysen unter anderem die Oenocyten in Betracht gezogen.Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde ein in vitro Bioassay entwickelt, der es ermöglichte, die Wirkung von extrahierten Substanzen auf die Hormonsynthese mittels RIA/HPLC zu bestimmen. Aus Köpfen adulter G. bimaculatus ließen sich durch HP-SEC Faktoren isolieren, die die Ecdysteroidsekretion in Oenocyten und Tergiten stimulierten, die aber keinen Einfluß auf die Hormonsekretion von Fettgewebe sowie der Prothorakaldrüsen hatten. Die Wirkung des aufgereinigten Extraktes in Oenocyten war zeit- und dosis-abhängig. Die ecdysiotropen Faktoren besaßen ein Molekulargewicht zwischen 26,5 und 30 kDa. Die Größe der Molmasse der ecdysiotropen Faktoren entsprach somit bei adulten männlichen Grillen etwa dem des Neurohormons PTTH bei Lepidopteren. Dennoch zeigten Antikörper, die gegen PTTH von Bombyx mori gerichtet waren im Western-Blot keine Bindung an Gryllus bimaculatus Kopfextrakte. Die Sekretionsprodukte von Oenocyten, die mit Ecdysiotropinen behandelt waren, wurden durch RP- und NP-HPLC identifiziert. Es konnten zwei zusätzliche Peaks neben einem deutlichen Anstieg von 20-Hydroxyecdyson nachgewiesen werden. Auf Grund identischer Retentionszeiten mit Referenzsubstanzen handelt es sich bei einem Peak vermutlich um Makisteron A.Obwohl die Applikation von Azadirachtin in G. bimaculatus zu einer Senkung des Hämolymph-Ecdysteroidgehalts führte, konnte keine Anreicherung von Ecdysiotropinen erzielt werden.Die die Ecdysteroidsekretion-beeinflussenden Faktoren waren resistent gegen Kochen und Alkylierung aber nicht stabil gegen Reduzierung durch DTT und Behandlung mit Neuramidase. Damit konnte gezeigt werden, daß das Vorhandensein von Disulfidbrücken und Oligosaccharidketten für die biologische Aktivität notwendig ist.Die Aminosäuresequenz-Analyse und der enzymatische Verdau der stimulierenden Faktoren durch Exopeptidasen wiesen auf geschützte N- und C-Termini hin. Ferner wurden einige interne Peptidfragmente von fünf Proteinbanden sequenziert, die keine Homologie zu bereits bekannten regulatorischen Neuropeptiden zeigten. Als einziges bekanntes Protein aus diesem Bereich konnte das „14-3-3-like Protein“ mit Hilfe MALDI-MS identifiziert werden.Die Stimulierung der Ecdysteroidsekretion in Oenocyten von G. bimaculatus durch Oenocyten-stimulierende Faktoren (OSF) aus Kopfextrakten konnte mittels Signalstoff-Effektoren in vitro nachgeahmt werden. Außerdem wurde mit Hilfe eines RRA nachgewiesen, daß der intrazelluläre cAMP-Spiegel von Oenocyten durch OSF erhöht wird. Daraus kann geschlossen werden, daß cAMP als „Second Messenger“ an der Wirkung der OSF beteiligt ist. Calcium-Ionen schienen für die Ecdysteroidsekretion notwendig zu sein. Allerdings führte eine artifizielle Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Ionophor Ionomycin zu einer Hemmung der Sekretion. Schließlich wird ein Modell zur Erklärung des Wirkmechanismus von OSF in Gryllus bimaculatus postuliert und diskutiert.

Computersimulationen zur Dynamik und Statik von Polybutadienschmelzen

Experimentelle Ergebnisse zeigen zwei Relaxationsprozesse inder Schmelze von Polybutadien. Der alpha Proze? derstrukturellen Relaxation wird mit zwischenmolekularen undder beta Proze? mit intramolekularen Wechselwirkungen undBewegungen in Verbindung gebracht. Es ist Ziel dieserArbeit, mit der Hilfe von molekulardynamischen Simulationen(in einem NVT Ensemble) mit einem realistischenund verifizierten United Atom Modell die mikroskopischenBewegungsprozesse bei hohen Temperaturen (240 -- 353K) zuuntersuchen und andererseits mit Gr??en zu vergleichen, dieexperimentell nachgewiesen werden k?nnen. Speziell k?nnendurch gezielte Ver?nderungen der Potentiale ihre Effekte aufdie Statik und die Dynamik studiert werden. Dazu werden dieTorsionspotentiale des chemisch realistischen Modells (CRC,Kettenl?nge 116, 45% cis, 55% trans, 40 Ketten)ausgeschaltet, um damit ein modifiziertes Modelleiner frei rotierenden Kette (FRC) zu bekommen. BeideModelle werden in ihrer Statik und Dynamik verglichen. Inder Statik stellt man nur kleine Unterschiede fest. DieTorsionswechselwirkung hat jedoch einen dramatischen Einflu?auf die Dynamik: man beobachtet beim CRC Modell eineverlangsamte, glas?hnliche Dynamik, die jedoch nicht dasSzenario der Modenkopplungstheorie erf?llt. Das gro?skaligeVerhalten ist in beiden F?llen qualitativ identisch. F?rgr??ere q Werte jedoch stellt man fest, da? abh?ngig vondem Torsionspotential die Relaxation auf zwei v?lligverschiedene Weisen verl?uft, vibratorisch im FRC Modell undvibratorisch-relaxatorisch im CRC Modell. In der van HoveFunktion wird ein Slidingproze? beobachtet, der dasVerlassen des K?figs (im CRC Modell) und den Anfang dessubdiffusiven Bereichs einl?utet. DieZeitverz?gerung diesesProzesses im CRC Modell wird mit angeregtenSpr?ngen ?ber die Torsionsbarrieren in Verbindung gebracht.Durch den Slidingproze? wird die Isotropie der Bewegung inder Schmelze f?r kurze Zeiten verletzt, eineZeitskalentrennung zwischen longitudinaler undtransversaler Bewegung wird beobachtet.

Struktur und Eigenschaften von Polyelektrolyten im schlechten Lösungsmittel

In der vorliegenden Doktorarbeit werden Struktur undEigenschaften vonflexiblen Polyelektrolyten im schlechten Lösungsmittel mitHilfe vonMolekulardynamiksimulationen studiert. Die Schwerpunkteliegen in derUntersuchung der Einzelkettenstruktur, derGegenionenverteilung undder Struktur der Polyelektrolytlösung. Dabei wird dieAbhängigkeitvon Parametern wie Dichte, Kettenlänge, Linienladungsdichte,Bjerrum-Länge und Lösungsmittelqualität behandelt. DiestarkeKopplung zwischen Gegenionenverteilung und Struktur derLösung wirdaufgezeigt und diskutiert. Die Behandlung der vollen Coulomb Wechselwirkung und dieexpliziteBerücksichtigung der Gegenionen erfordert die effizientenumerischeBehandlung von langreichweitigen Wechselwirkungen. Dazuwurde derP3M Algorithmus für massiv parallele Rechnerplattformenimplementiert, optimiert und in ein effektivesMolekulardynamikprogramm integriert. Die räumliche Verteilung der Gegenionen um diePolyelektrolyte wirduntersucht und mit dem Zellenmodell verglichen. Dabei werdenEndeffekte und die inhomogene Verteilung der Gegenionenentlang derKettenkontur quantifiziert. Dabei konnte die Analogiezwischenschwach geladenen titrierenden Polyelektrolyten und starkgeladenenPolyelektrolyten mit fixierter Ladungsverteilung zusammenmit ihrenGegenionen nachgewiesen werden. Für die Untersuchung der Einzelkettenstruktur vonPolyelektrolyten imschlechten Lösungsmittel wurde eine Methode entwickelt,sogenanntePerlenkettenstrukturen zu charakterisieren. Sowohl füreinzelneKettenkonformationen, als auch für ein statistischesEnsemble vonKetten können damit der Strukturtyp, d.h. die Anzahl derPerlen undcharakteristische Größen, wie die Perlengröße, derenAusdehnung, sowie die Steglänge bestimmt werden. Durchdiesendirekten Zugang zu den Kettenkonformationen konnten dieSchwierigkeiten, Perlenketten experimentell nachzuweisen,aufgezeigtwerden. Insbesondere sind dies die Koexistenz verschiedenerStrukturtypen, breite Verteilungen für die Perlenausdehnungund denPerlen-Perlen Abstand. Die verschiedenen, in einer Polyelektrolytlösungauftretenden,partiellen Strukturfaktoren wurden mit Hilfe vonSimulationengroßer Systeme behandelt. Für die Skalierung der Positiondesfür Polyelektrolytlösungen charakteristischen Maximums inderInter-Ketten Strukturfunktion mit der Monomerdichte wurdeein Exponent0.35 +- 0.03 gefunden. Die Ketten durchlaufen mit steigenderDichtestarke Konformationsänderungen und bilden oberhalb derÜberlappkonzentration ein transientes, physikalischesNetzwerk.

Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie und -Spektroskopie von Sauerstofftransportproteinen

In dieser Arbeit wurde die intrinsische Tryptophanfluoreszenz von Proteinen nach Zwei-Photonen-Anregung untersucht. Als interessantes Modellsystem wurde das Sauerstofftransportprotein der Vogelspinne Eurypelma californicum gewählt. Zum einen besitzt das Protein 148 Tryptophan-Seitenketten, so daß deren geringer Absorptionsquerschnitt kompensiert werden kann und eventuell einzelne Proteine aufgrund ihrer Tryptophanfluoreszenz detektiert werden können. Zum anderen signalisiert diese Fluoreszenz die Sauerstoffbeladung, so daß die kooperative Sauerstoffbindung auf Einzelmolekülebene untersucht werden könnte. Als limitierender Faktor hat sich die Photostabilität der Tryptophane nach Zwei-Photonen-Anregung herausgestellt. Im Mittel können von einem Hämocyanin-Molekül drei Photonen detektiert werden, bevor alle 148 Tryptophan-Seitenketten geblichen sind. Dies ist ein für Einzelmolekülspektroskopie äußerst niedriger Wert. Trotz dieser geringen Photostabilität ist es zum erstem Mal gelungen, die Diffusion einzelner Proteine mit Hilfe ihrer intrinsischen Tryptophanfluoreszenz zu beobachten. Wenn in einer geeigneten Umgebung die Photostabilität der Tryptophane höher ist, so reicht die Zahl der detektierten Photonen aus, um einzelne Teilchen abzubilden. Überraschend hat sich ergeben, daß es möglich ist, durch Lichteinstrahlung von außen in das Sauerstoffbindungsgleichgewicht einzugreifen und die Reaktion des Proteins auf die Auslenkung aus dem Gleichgewichtszustand zu beobachten. Das intensitätsabhängige Sauerstoffbindungsverhalten wurde modelliert und an die Messungen angepaßt. Die lichtinduzierte Sauerstoffabgabe führt anscheinend nicht zu einem Konformationswechsel.

Durchdringungs- und Adsorptionsverhalten von Stern-Polymeren

Änderungen in der Architektur von Polymeren abweichend von einer linearen Kette, beeinflussen deren physikalisch-chemisches Verhalten. Eine mögliche Architektur der verzweigten Moleküle stellen sternförmige Polymere dar. An einem zentralen Molekül als Kern, beispielsweise einem Dendrimer, sind an dessen Endpunkte lineare Polymerketten kovalent gebunden. In dieser Arbeit wurden zwei Problemstellungen behandelt. Zunächst wurde das Verhalten von Sternpolymeren aus Polybutadien in einer Matrix aus linearem Polybutadien mittels Neutronenkleinwinkelstreuung untersucht. Die Molekulargewichte der linaren Ketten wurden so gewählt, daî eines ein kleineres und das zweite ein größeres Molekulargewicht hat, als der leichteste bzw. schwerste Arm der verwendeten Sternpolymere. Neben den Parametern Armanzahl und -gewicht wurde die Konzentrations- und Temperaturabhängig durchgeführt. Die aus diesen Messungen extrahierten Parameter wurden mit den theoretischen Vorhersagen bezüglich des Skalenverhaltens vonSternpolymeren in derartigen Mischungen verglichen. Weiterhin wurde ein Interaktionsparameter bestimmt und in einzelne Anteile verschiedener Arten der Wechselwirkungen zerlegt. Die zweite Fragestellung betraf das Adsorptionsverhalten von Sternpolymeren im Vergleich mit linearen Polymeren. Es wurde die Kinetik der Adsorption mittels Ellipsometrie, die Strukturbildung mit dem Rasterkraftmikroskop und Streuung unter streifendem Einfalluntersucht.

Bedeutung N- und C-terminaler Aminosäuren für die Monomer- und Dimerbildung von Lichtsammelproteinen des Photosystems I

Der LHCI-730 ist ein heterodimerer, Chlorophyll a/b-bindender Lichtsammelkomplex (LHC) des Photosystem I in höheren Pflanzen. Mit Hilfe rekombinanter, modifizierter Proteine wurde untersucht, welche terminalen Bereiche der Untereinheiten Lhca1 und Lhca4 für die Bildung von monomeren und dimeren Lichtsammelproteinen relevant sind. Durch PCR-Mutagenese modifizierte Apoproteine wurden in vitro mit Gesamtpigmentextrakt rekonstituiert und auf ihre Fähigkeit mono- bzw. dimere LHCs zu bilden untersucht.Für die Monomerbildung sind der extrinsische N-Terminus und die der amphipathischen vierten Helix folgenden Aminosäuren beider Proteine für die Faltung stabiler monomerer Pigmentproteinkomplexe nicht notwendig. Die Aminosäuren, mit deren Deletion die Monomerbildung an N- und C-Terminus verhindert wurde, verfügten über geladene (Glu, Asp), aromatische (Trp) oder neutrale Seitenketten (Leu).Die Untersuchungen zur Dimerbildung des LHCI-730 zeigten, daß am N-Terminus des Lhca1 nur bis zu einer Entfernung von drei Aminosäuren (Trp) eine Assemblierung der Untereinheiten möglich ist. Nur Phe (anstatt Trp) war in Substitutionsexperimenten im Vollängenprotein in der Lage, Dimere zu bilden. Das Ausbleiben der Dimerbildung der bis einschließlich zum Trp-39 und Ile-168 verkürzten Deletionsmutanten des Lhca4 ist vermutlich auf die Instabilität dieser Lhca4-Mutanten zurückzuführen. Die Deletion von Trp-185 am C-Terminus des Lhca1 führt zu einem Ausbleiben der Dimerbildung, die aber offensichtlich durch weitere, zuvor schon deletierte Aminosäuren beeinträchtigt wurde.

Poly(para-phenylenethinylen)e - Synthese, Charakterisierung und Eigenschaften von endfunktionalisierten Polymeren und Stäbchen-Knäuel-Diblockcopolymeren

Der erste Teil der vorliegenden Dissertation beschäftigt sich mit der Eignung des ?,?-dithiolfunktionalisierten Poly(para-phenylenethinylen)s (PPE) als sogenannter „molekularer Draht“ für die molekulare Elektronik. Über die HECK-CASSAR-SONOGASHIRA-Reaktion wurden vollständig endfunktionalisierte, defektfreie Polymere mit durchschnittlichen Polymerisationsgraden von bis zu 45 Repetitionseinheiten synthetisiert. Die starke Aggregationsneigung der PPE, die die Anordnung der Polymerketten zwischen den Goldelektroden unterstützen soll, wurde mittels Rasterkraft- und Rastertunnelmikroskopie untersucht. Für die Untersuchungen zur Dotierbarkeit wurden ESR-, ENDOR-, UPS- und XPS-Messungen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass sich das PPE reduzieren lässt.Im zweiten Teil der Arbeit wurden die PPE zur Synthese von Stäbchen-Knäuel-Diblockcopolymeren eingesetzt. Die Darstellung erfolgte nach der 'grafting onto'-Methode, indem monocarboxyl-endfunktionalisiertes PPE mit flexiblen monohydroxyl-endfunktionalisiertem Polyethylenglykol, Polydimethylsulfoxid bzw. Polytetrahydrofuran verestert wurde. Den Nachweis der Diblockcopolymerbildung erbrachten die 1H?NMR-Spektroskopie und die für Diblockcopolymere noch wenig angewandte MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Mittels Rasterkraftmikroskopie und Computersimulationen zur Molekularmechanik und -dynamik wurden die Aggregationseigenschaften der Diblockcopolymere untersucht.

Synthese und Strukturierung von funktionalisierten Oligothiophenen

AbstractIn this thesis t-BOC and methacrylate functionalisedoligothiophenes with 3 – 5 thiophene units where synthesizedby Stille coupling. The material was structured by methodslike stamping and photolithography.The polymerizability of the methacrylates was proved by thepolymerization in solution with AIBN and subsequent analysisby gel permeation chromatography and differential scanningcalorimetry. The conductivities of the doped polymer filmswere in the range published for oligothiophenes.The optical and electrochemical properties of the compoundswere measured and compared to known compounds.The cleavage of the t-BOC groups was followed bythermogravimetry and infrared spectroscopy. The cleavagetemperature can be lowered by up to 100 °C by the use ofphoto acid generators. The cleavage is complete after 2hours annealing.The methacrylates were structured by microinjection mouldingin capillaries (MIMIC), stamping with soft silicone moulds,filling of patterned substrates and preperation of an opalreplica. By MIMIC line patterns with 5- 50 µm line widthswere obtained. The stamping succeeded in structures with 500nm line width only, on which liquid crystals wereorientated. This shows the possible application asorientation layers in LED’s with polarized emission. Withsilica opal templates the three-dimensional structuring ofthe oligomers succeeded.ZusammenfassungIn dieser Arbeit wurden neue funktionalisierteOligothiophene hergestellt und unter Anwendung verschiedenerVerfahren wie Stempeltechniken oder Photolithographiestrukturiert. Dazu wurden Oligothiophene mit drei bis fünfThiopheneinheiten durch Stille-Kupplung synthetisiert. Alsfunktionelle Gruppen wurden t-BOC-Ester undMethacrylsäureester eingeführt.Die Polymerisierbarkeit der Methacrylate wurde durch diePolymerisation mit AIBN in Lösung und anschließendeGelpermeationschromatographie und Differentialkalorimetrienachgewiesen. Die Leitfähigkeiten der dotierten Polymerfilmelagen im Bereich der für Oligothiophene bekannten Werte.Die optischen und elektrochemischen Eigenschaften derVerbindungen wurden untersucht und mit den Eigenschaftenbekannter Verbindungen verglichen. Die Abspaltung der t-BOC-Gruppen wurde thermogravimetrischund infrarotspektroskopisch verfolgt. Es wurde gezeigt, daßdie Abspaltungstemperatur durch den Zusatz einesPhotosäuregenerators um bis zu 100°C gesenkt wird und dieAbspaltung nach zweistündigem Tempern vollständig ist.Die methacrylatfunktionalisierten Verbindungen wurdenstrukturiert durch Micro Injection Moulding in Capillaries(MIMIC), Prägen mit weichen Silikonstempeln, Füllen vonstrukturierten Substraten und die Herstellung einerOpalreplika. Durch die Strukturierung mit MIMIC wurdenLinienstrukturen mit Linienbreiten von 5-50 µm erhalten.Durch Prägen wurden Strukturen mit Linienbreiten von nur 500nm erreicht, auf diesen gelang die Orientierung vonFlüssigkristallen. Dies zeigt die mögliche Anwendung alsOrientierungsschichten in Leuchtdioden mit polarisierterEmission. Durch die Verwendung von Siliziumoxidopalen alsTemplate gelang die dreidimensionale Strukturierung derOligomere.

Synthese und Charakterisierung von Polymakromonomeren unterschiedlicher Topologie

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Topologien von Polymakromonomeren auf unterschiedlichen chemischen Routen synthetisiert und mit verschiedenen Methoden charakterisiert. Es wurden Polyalkylmakromonomere, Kern-Schale zylindrische Bürsten (Poly[styrol-block-alkylmakromonomere]), Polystyrolmakromonomere und Blockcopolymere aus zylindrischer Polystyrolbürste und linearem t--BuMA--Knäuel synthetisiert. Die Synthese der Polyalkylmakromonomere und der Kern--Schale zylindrischen Bürsten wurde durch die freie radikalische Polymerisation von Makromonomeren erreicht. Die unterschiedlichen Eigenschaften der Polymakromonomere wurden mit verschiedenen Methoden (Lichtstreuung, Neutronenstreuung, DSC, AFM und NMR) untersucht. Die metalloceninitiierte Polymerisation von Polystyrolmakromonomeren führte zum ersten Mal zu Polymerisationsgraden der Hauptkette von mehr als 1000, so dass eine neue chemische Route zur Synthese von zylindrischen Bürsten entwickelt werden konnte. Die partiell lebende metalloceninitiierte Polymerisation erlaubt weiterhin zum ersten Mal die Synthese von Blockstrukturen, die einen zylindrischen Bürstenteil und einen linearen Knäuelteil (t--BuMA) aufweisen. Diese Blockcopolymere bilden nach Abspaltung der tert.--Butylgruppe und Neutralisation der freien Polymethacrylsäure mit Cäsiumhydroxid ein sehr großes Amphiphil, das in einem selektiven Lösungsmittel (z.~B. THF) eine mizellare überstruktur ausbildet. Der mizellare Charakter dieser überstrukturen wurde mit der hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopie/EDX bewiesen. Der mit der TEM beobachtete Durchmesser einer solchen Riesenmizelle erreicht Werte von bis zu 300 nm.

Lokalisation und Verteilung von Synapsen auf identifizierten Zellen im Zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster

Wir präsentieren zwei Techniken, mit deren Hilfe es erstmals möglich ist, zentralnervöse Synapsen im Zentralen Nervensystem (ZNS) von Drosophila melanogaster reproduzierbar darzustellen und experimentellen Methoden zugänglich zu machen. Die erste Technik beruht auf dem UAS/Gal4-System und ermöglicht die Expression markierter synaptischer Proteine in bekannten reproduzierbaren Neuronen. Die zweite Technik beruht auf der Einzel-Zelltransplantation und erlaubt die reproduzierbare Visualisierung von Synapsen in allen neuralen Zell-Linien des Drosophila Bauchmark.Mit Hilfe dieser Techniken konnte gezeigt werden, dass Neuriten im Bauchmark von Drosophila mindestens drei unterschiedliche Kompartimente aufweisen: 1. Primäre, häufig transversal verlaufende Neurite ohne Output-Synapsen, 2. Seitenneurite von vermutlich rein postsynaptischer Natur und 3. Seitenneurite, die präsynaptisch spezialisierte Regionen aufweisen. Des Weiteren konnten wir nachweisen, dass die Seitenneurite von Motroneuronen im ZNS vermutlich rein postsynaptisch sind. Weitere Beobachtungen veranlassen uns zu der Hypothese, dass motorneuronale Seitenneurite in Drosophila homolog oder analog zu Dendriten in Vertebraten sein könnten.Mit Hilfe der Transplantationstechnik untersuchten wir weiterhin die Funktion des Gens kakapo im ZNS. Obwohl kakapo für die Entwicklung von Synapsen an der Neuromuskulären Verbindung wichtig ist, konnten wir im ZNS keinen Phänotyp feststellen. Dies legt nahe, dass zwischen der Entwicklung von periphären und zentralnervösen Synapsen klare Unterschiede bestehen.

Design und Synthese von Oligopyrrolcarboxamiden als neue DNA-Liganden mit potentieller Antitumoraktivität

Zusammenfassung der Arbeit: 'Design und Synthese von Oligopyrrolcarboxamiden als neue DNA-Liganden mit potentieller Antitumoraktivität' (deutsch)

Kontaktmechanik und Strukturierung von festkörperunterstützen Lipidmembranen

Die vorliegende Arbeit beschreibt unter anderem die Realisierung eines Assays aus mikrostrukturierten und selektiv funktionalisierten künstlichen Membransegmenten auf einem Chip. Die Strukturierungsmethode kombiniert die softlithographische Technik des Mikroformens in Kapillaren mit der Vesikelspreittechnik und bietet ein elegantes Verfahren, einzeln adressierbare Lipidsegmente im Mikrometer Regime zu erzeugen. Unter Berücksichtigung des hydrodynamischen Fließverhaltens und der Stabilitätskriterien für PDMS-Elastomere wurden außerdem neue Strukturen entwi-ckelt, die für den kombinierten Einsatz von Rasterkraftmikroskopie und Fluoreszenz-mikroskopie optimiert sind. Die Anwendbarkeit des Lab-On-A-Chip-Devices als Bio-sensor wurde durch zwei prominente Protein-Rezeptor-Bindungsstudien fluores-zenzmikroskopisch und rasterkraftmikroskopisch belegt. Im zweiten Teil der Arbeit sind die mechanischen und adhäsiven Eigenschaften aus-gewählter Lipidsysteme mit einer neuen Charakterisierungstechnik untersucht wor-den, die die Kontaktmechanik von Rastersonden und Lipidmembranen auf Basis der Digitalisierung von Hochgeschwindigkeitskraftkurven und einer automatisierten Multi-parameteranalyse quantitativ erfasst. Dabei konnte die Korrelation zwischen der Ad-häsion und den materialspezifischen Durchbruchlängen und Durchbruchkräften, die charakteristische Stabilitätsparameter der Lipidmembran darstellen, auf Systemen mit variierenden Kopfgruppen und Kettenlängen analysiert werden. Das Verfahren erlaubte zudem die simultane Quantifizierung der elastischen Eigenschaften der Li-piddoppelschichten. Zu den Kraftkurven wurden Simulationen der Systemantwort durchgeführt, die ein tieferes Verständnis der Kontrastentstehung ermöglichen.

In-vitro-Rekonstitution des vesikulären Transportes zu Recycling-Endosomen und Analyse von sekretiertem Caveolin-1 aus humanen Prostatakrebszellen

Der Transferrin-Zyklus ist ein wichtiges Modell für denintrazellulären Transport, daher sollten in der vorliegendenArbeit einzelne, immer noch unverstandene Prozesse desvesikulären, intrazellulären Transportes durch dieCharakterisierung einen in vitro-Transportassay untersuchtwerden. Der Ansatz eines in vitro-Systems wurde deshalbgewählt, um mit Experimenten in denen einzelne Faktoren undbestimmte Konditionen untersucht werden sollten, diese unterdefinierten, reproduzierbaren Konditionen durchzuführen, diein einem in vivo-System kaum zu gewährleisten sind. Ohne denEinfluss von „störenden“, weil unkontrollierten Faktoren,wie es bei in vivo-Systemen der Fall ist, konnte imvorliegende Ansatz der Transport zu immunisoliertenRecycling-Endosomen (die Isolierung erfolgte hierbei mitanti-Rab11-Antikörpern, einem Marker fürRecycling-Endosomen) unter bestimmten Bedingungen untersuchtwerden. Dabei wurde als Marker Acridinium-markiertesTransferrin gewählt, welches in Zellen internalisiert wurde.Die Spezifität des Transportes in dem zellfreien System warhierbei sehr hoch, wie Kontrollexperimente inImmunisolierungsansätzen ohne Rab11-Antikörper zeigten. ImRahmen einer ersten Charakterisierung des Transportassayswurden essentielle, für den in vivo-Transport essentielleParameter auch in den in vitro-Experimenten untersucht.Hierbei wurde zum einen der Faktor Temperatur gewählt, daTransport in Zellen bei 4°C in der Regel zum Erliegen kommt.Dies konnte auch in dem vorgestellten System gezeigt werden.Ein weiterer, essentieller Faktor ist Energie in Form vonATP. ATP-Depletion wurde in den Experimenten durch Hinzugabeeines ATP-erschöpfenden Systems erzielt. Auch hier zeigteder Transport von Ac-Tfn zu Recycling-Endosomen eine starkeInhibierung. Mit Hilfe des so charakterisierten Assayskonnten anschließend weitere Experimente durchgeführtwerden, die den Einfluss von bestimmten Reagenzien undKonditionen auf den Transport untersuchten. So zeigte derTransport in Zeitverlaufsexperimenten einen Anstieg desTransportes bis 30 Minuten, bei 30 Minuten wurde ein Maximumerreicht. Nach Erreichen dieses Maximums war nachfolgendeine leichte Abnahme des Transfers von Ac-Tfn zu denRecycling-Endosomen zu beobachten. Da Rab-Proteine alsSchlüsselregulatoren für den intrazellulären, vesikulärenTransport gelten, und die Immunisolierungen mitanti-Rab11-Antikörpern durchgeführt wurden, wurde somit auchder Einfluss dieser GTPasen auf das Transportsystemuntersucht. Zugegebenes GDI, welches in der Lage istRab-Proteine in GDP-gebundener Form von spezifischenMembranen zu extrahieren, und daher ein gut untersuchterInhibitor von Rab-Funktionen ist, konnte auch in diesemTransportassay den Transport von Transferrin inhibieren. Einweiterer Aspekt war die Rolle des Cytoskelettes imintrazellulären Transport. Da in früheren Untersuchungen(Trischler et al., 1999) Aktin auf Recycling-Endosomengefunden wurde, erfolgte in diesen Arbeiten eineKonzentration auf die Rolle des Aktin in diesenTransportprozessen. Durch die Zugabe von Cytochalasin D, daseinen Aufbau von Aktingerüsten verhindert, wurde derTransport ebenfalls inhibiert. Durchaffinitätschromatographische Aufreinigungen konnte einestarke Interaktion von Aktin an immobilisiertes Rab11gezeigt werden. Die eluierten Fraktionen, die neben Aktinnoch weitere, jedoch unbekannte Proteine enthielten, konntenin dem in vitro-Fusionsassay eingesetzt werden und führtendort zu einer Stimulation des Transportes. Neben demgefundenen Aktin, könnten somit noch weitere, unbekannteProteine in dem Proteingemisch wichtige Funktionen imintrazellulären, vesikulären Transport übernehmen. EineIdentifizierung dieser Proteine ist dabei für weiterführendeArbeiten essentiell.Caveolin-1, Markerprotein für die Caveolae-Membrandomänewird überraschenderweise von verschiedenen Zellensekretiert. Da Caveolin-1 normalerweise ein integralesMembranprotein ist, wird von einer Sekretion alsLipoproteinpartikel ausgegangen. Die Rolle diesessekretierten Partikels ist unbekannt, wobei einige Autoreneine Funktion als autokrinen/ parakrinen Faktor vorschlagen(Tahir et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit solltendiese Partikel daher aufgereinigt und erstmalscharakterisiert werden. Die Partikel wurden aus transienttransfizierten LNCaP-Zellen gewonnen, die Cav-1 in dasserumfreie Medium abgaben. In einer erstenGrößenuntersuchung durch FPLC konnte ein Molekulargewichtzwischen 2.000.000 Da und 660.000 Da bestimmt werden. DieseResultate konnten durch den Ansatz der nativenBlau-Gelelektrophorese bestätigt werden. In einem weiterenAnsatz, der die Dichte der Partikel charakterisieren sollte,wurde in zwei unterschiedlichen Ansätzen (CsCl-, sowieOptiprep Dichtezentrifuagtion) eine ähnliche Dichte desPartikels wie HDL ermittelt. Um eine stärkere Aufreinigungder Partikel zu erzielen, wurde eine Aufreinigung mit Hilfevon Ni-NTA-Agarose durchgeführt. Dies war möglich, denn diebei der Transfektion verwendete C-DNA trug einen His6-tag.Die so aufgereingten Partikel verloren auch nach derNi-NTA-Chromatographie nicht ihre biochemischenEigenschaften, wie in überprüfenden CsCl-Gradienten zu sehenwar. Die Partikel konnten anschließend zum ersten Mal inelektronenmikroskopischen Aufnahmen (Negativkontrastierung)visualisiert werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es,zu untersuchen ob auf Cav-1 Lipoproteinpartikeln nochweitere Proteine zu finden waren. Durch eine kombinierteAufreinigung über Ni-NTA Chromatographie undCsCl-Dichtezentrifugation und im Vergleich mit demAusgangsmaterial konnten in der Silberfärbung Proteinbandenerkannt werden, die wie Cav-1 in den Fraktionen angereichertvorlagen. Eine massenspektroskopische Identifikation einerder Banden ergab, dass es sich hierbei um nm 23(Nukleosid-diphosphat-kinase) handelte, einem Protein dasebenfalls von verschiedenen Tumoren sekretiert wird.

Synthese und Charakterisierung von Modellen für Photoschalter und elektronische Ventile

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Synthese von organischen Photoschalter-Modellen auf der Basis von mesoionischen Pyrimidinium-olaten und Bis(thienylperfluorocyclopentenen), sowie die Darstellung substituierter Biphenyl-Biradikale als Modelle für Ventil-Systeme im Sinne eines neuen Schalter-Ventil-Konzeptes.Aufbauend auf meiner Arbeit über mesoionische Pyrimidinium-olate wurde ein henkelverbrücktes Ansa-Mesoion mit einem 16-gliedrigen Makrocyclus, sowie drei mehrcyclische mesoionische Systeme synthetisiert und auf ihr Schaltverhalten hin untersucht. Das Ansa-Mesoion stellt ein erstes einfaches Modell für Schalter-Ventil-Konjugate dar. Zur Darstellung der photochromen Bis(thienylethene) wurden die aus der Literatur bekannten Syntheserouten nach Irie als auch nach Feringa auf neue Strukturen angewandt und die Schalteigenschaften der Bis(thienylethene) optisch nachgewiesen. Die Anordnung der reaktiven Endgruppen in den synthetisierten Verbindungen schafft ideale Voraussetzungen für eine große konformelle Änderung, welche im Schalter-Ventil-Konjugat erwünscht ist. Durch vielfaches Durchlaufen des Schaltprozesses (> 100 Cyclen) konnte die hohe Reversibilität des Schaltvorganges belegt werden.Als Ventilmodelle wurden mit stabilen Nitroxidradikalen substituierte Biphenyle verwendet, deren primärer konformativer Freiheitsgrad durch die Drehung um die Phenyl-Phenyl-Einfachbindung gegeben ist. Experimentelle ESR-Daten und deren Vergleich mit Spektrensimulationen bestätigten die Abhängigkeit der Austauschwechselwirkung J zwischen den Radikalen vom Biphenyldiederwinkel.