Mangia, bevi, ama. Cibo e rituali alimentari del matrimonio nell'Occidente altomedievale

La ricerca pone al centro dell’indagine lo studio dell’importanza del cibo nelle cerimonie nuziali dell’Europa occidentale nei secoli V-XI. Il corpus di fonti utilizzate comprende testi di genere diverso: cronache, annali, agiografie, testi legislativi, a cui si è aggiunta un’approfondita analisi delle antiche saghe islandesi. Dopo un'introduzione dedicata in particolare alla questione della pubblicità della celebrazione, la ricerca si muove verso lo studio del matrimonio come “processo” sulla base della ritualità alimentare: i brindisi e i banchetti con cui si sigla l’accordo di fidanzamento e i ripetuti convivi allestiti per celebrare le nozze. Si pone attenzione anche ad alcuni aspetti trasversali, come lo studio del caso della “letteratura del fidanzamento bevuto”, ossia una tradizione di testi letterari in cui il fidanzamento tra i protagonisti viene sempre ratificato con un brindisi; a questo si aggiunge un’analisi di stampo antropologico della "cultura dell’eccesso", tipica dei rituali alimentari nuziali nel Medioevo, in contrasto con la contemporanea "cultura del risparmio". L'analisi si concentra anche sulle reiterate proibizioni al clero, da parte della Chiesa, di partecipare a banchetti e feste nuziali, tratto comune di tutta l’epoca altomedievale. Infine, la parte conclusiva della ricerca è incentrata sulla ricezione altomedievale di due figure bibliche che pongono al centro della narrazione un banchetto nuziale: la parabola delle nozze e il banchetto di Cana. L’insistente presenza di questi due brani nelle parole dei commentatori biblici mostra la straordinaria efficacia del “linguaggio alimentare”, ossia di un codice linguistico basato sul cibo (e su contesti quali l’agricoltura, la pesca, ecc.) come strumento di comunicazione sociale di massa con una valenza antropologica essenzialmente universale.

Das Interleukin-1Beta-Rezeptor-Homolog im Modifizierten Vakziniavirus Ankara (MVA) - Charakterisierung und möglicher Einfluss auf MVA-basierte Impfvektoren

MVA ist ein attenuiertes Vakziniavirus, das durch wiederholte Passagierung von Chorioallantoisvirus Ankara auf Hühnerembryofibroblasten gewonnen wurde. Es ist bis auf wenige Ausnahmen nicht mehr in der Lage, in Säugerzellen zu replizieren, zeigt aber dennoch eine vollständige virale Proteinexpression und induziert nach Immunisierung eine zu VACV vergleichbare Immunantwort. Aus diesem Grund wurde es bereits als Impfstoff gegen die menschliche Pockenerkrankung eingesetzt, ohne hierbei die bei den klassischen Impfviren beobachtbaren Nebenwirkungen hervorzurufen. Das Genom von MVA enthält jedoch noch Immunmodulatoren, deren Deletion Ansatzpunkt für die weitere Verbesserung des Impfstoffes sein kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Deletionsmutante untersucht, bei der das Gen für den Interleukin-1β Rezeptor (IL-1βR) deletiert ist (MVA ΔIL-1βR). Es konnte nachgewiesen werden, dass der IL-1βR in murinen als auch in humanen Zellen exprimiertes IL-1β bindet und somit inaktiviert. Des Weiteren wurde gefunden, dass MVA in der Lage ist, IL-1β in antigenpräsentierenden Zellen zu induzieren, welches aber durch die Neutralisierung aufgrund des IL-1βR nur transient nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu induzierte MVA ΔIL-1βR eine anhaltende und um ein Vielfaches erhöhte Sekretion an IL-1β. Untersuchungen in antigenpräsentierenden Zellen aus knock-out Mäusen, die verschiedene Defizienzen in den Signalwegen zur IL-1β-Induktion trugen, zeigten, dass die Sekretion von IL-1β von Caspase-1 abhängig war, welches wahrscheinlich aus der vorgeschalteten Aktivierung der NLRP3- und/oder AIM2-Inflammasomen resultierte. Interessanterweise wurden auch Caspase-1 unabhängige Mechanismen beobachtet, die auf eine Inflammasom-unabhängige IL-1β-Induktion hinweisen könnten. In Bezug auf die Immunaktivierung führte die vermehrte Sekretion von IL-1β durch MVA ΔIL-1βR vermutlich zu einer verbesserten Antigenpräsentation, die die nachfolgende T-Zellantwort beeinflusste. In Übereinstimmung mit bereits veröffentlichten Daten wurde nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR eine effektivere Gedächtnis-T-Zellantwort festgestellt, deren Charakteristika und zu Grunde liegenden Mechanismen hier untersucht wurden. Jedoch konnten weder Unterschiede in weiteren pro-inflammatorischen Zytokinmustern noch im Verlauf insbesondere der CD8+ T-Zell-Aktivierung und -erhaltung zwischen MVA und MVA ΔIL-1βR beobachtet werden. Als mögliche weitere Ursache für die veränderte Gedächtnis-T-Zellantwort könnte daher eine vermehrte Stimulation durch antigenpräsentierende Zellen und eine IL-21-vermittelte bessere Unterstützungsfunktion der CD8+ Gedächtnis-T-Zellen durch CD4+ T-Zellen in Frage kommen. Zusammenfassend konnten hier neue molekulare Mechanismen, die zur Induktion von IL-1β nach einer MVA-Infektion führen, aufgedeckt werden. Darüber hinaus existieren bereits erste Hinweise auf einen Vorteil der Deletion des IL-1βR für MVA-basierte Vektorimpfstoffe. Die vorliegende Arbeit hat weitere Daten erhoben, die das Erzielen verbesserter Immunantworten nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR unterstützen, woraus sich neue Ansätze für die Entwicklung MVA-basierter Impfstoffe ergeben könnten.

Pathomechanische Analysen zum Untergang retinaler Ganglienzellen im experimentellen autoimmunen Glaukom-Modell

In den vergangenen Jahren konnten zahlreiche Studien die Veränderung des natürlichen Autoantikörperrepertoirs bei Glaukompatienten aufzeigen. Zu den Antigenen zählen verschiedenen Hitzeschockproteinen, aber ebenso neuronal assoziierte Strukturproteine wie das Myelin basische Protein (MBP) oder das sauren Gliafaserprotein und einige neuropyhsiologische Proteine aus der Retina und dem Sehnerven. Da bei den Glaukompatienten nicht einzelne Antikörperreaktionen verändert sind, sondern vielmehr komplexe Autoantikörpermuster vorliegen, bestand das primäre Ziel der Dissertation zu zeigen, ob eine systemische Immunisierung mit MBP, Homogenaten opticus-assoziierter Antigene (ONA) und Antigenen der retinalen Ganglienzellschicht (RGA) den Verlust von retinalen Ganglienzellen (RGZ) in einem Experimentellen Autoimmunen Glaukom (EAG) Tiermodell auslösen können. Die systemische Injektion von MBP, ONA oder RGA induzierten ophthalmopathologische Veränderungen in der Retina, gekennzeichnet durch retinalen Ganglienzellverlust mitsamt Zerstörung der Axone im Sehnerv. Unter der Annahme, dass die Neurodegeneration durch Autoantiköper vermittelt ist, wurde ebenfalls untersucht, ob sich die Antikörperreaktivität gegen okulare Strukturen oder den Sehnerv im Verlauf der Studie verändern. Getestet wurde die Antikörperreaktivität gegen Gewebsschnitte gesunder Tiere mit dem Ergebnis einer signifikanten und zeitabhängigen Zunahme der Immunreaktivität. Darüber hinaus war es erstmals möglich die Ablagerung von IgG Autoantikörpern in der Retina und dem Sehnerv nachzuweisen sowie die Caspase mediierte Apoptose zu untersuchen. Ebenfalls konnte die Verteilung von aktivierten Mikroglia im optischen System evaluiert werden, wobei diese mehrmals in Kolokalisation mit den IgG-Autoantikörpern auftraten. Diese Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass die Immunreaktionen von Autoantikörpern alleine und im Zusammenspiel mit der Mikroglia im Zusammenhang mit der Neurodegeneration der retinalen Ganglienzelle im EAG Modell stehen könnten.

Exploring the function of IL-10, BTLA and DCs as regulators of immune responses

This thesis focuses on different aspects of immune regulation, both at the cellular and molecular levels. More specifically, this work concentrates on the importance of Interleukin-10, B and T Lymphocyte Attenuator (BTLA), and dendritic cells in respect to immune regulation, with special emphasis on autoimmunity. In this thesis, we show that the cellular source of IL10 production can dramatically influence the outcome of an autoimmune response. We show that T cell-derived IL10 plays an important role in controlling the viability of recently activated T cells, allowing them to become fully functional T effector cells. T cell-specific IL10-deficient mice failed to induce EAE when immunized with MOG peptide. Furthermore, when re-challenged with MOG or other stimuli, these T cells exhibited increased apoptosis rates. Here we report for the first time the generation of a novel mouse model that allows the conditional over-expression of BTLA. We show that BTLA can negatively regulate CD4+ T cells responses, when expressed by the T cells themselves. BTLA over-expression by CD8+ T cells or dendritic cells, however, resulted in enhanced viral clearance. In this study, we show that depletion of DCs, either early on from birth or later in adulthood, does not prevent EAE induction, but instead leads to a lower state of tolerance and stronger immune response. We also show that DCs are responsible for the upregulation of PD-1 on antigen-specific T cells and subsequently induce the formation of Tregs during immune responses.

Synthese von tumor-assoziierten MUC1-Mucin-Glycopeptid-Vakzinen und deren immunologische Evaluierung

Eine alternative Methode zur Therapie von Tumorerkrankungen bestünde in einer Immuntherapie ausgelöst durch synthetische Antitumor-Vakzine. Ein vielversprechendes Zielmolekül für eine solche Aktivimmunisierung ist das Glycoprotein MUC1, das auf nahezu allen Epithelgeweben exprimiert und auf Tumorgeweben stark überexprimiert wird. Seine extrazelluläre Domäne enthält eine Vielzahl von Tandem-Repeat-Sequenzen der Art: HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA mit fünf potentiellen O-Glycosylierungs-Positionen. Da die Form der Glycosylierung des MUC1 in Tumorzellen stark von der auf normalen Zellen abweicht, liegen auf Tumorzellen eine Reihe tumor-assoziierter Saccharidantigene und Peptidepitope vor.rnIn dieser Arbeit wurden tumor-assoziierte Glycopeptidantigene aus der MUC1-Tandem-Repeat-Region hergestellt. Die synthetisierten MUC1-Glycopeptide tragen in verschiedenen Positionen eine Glycosylierung mit den tumor-assoziierten Tn- und STn-Saccharid-Antigenen. Zur Gewinnung von Vakzinen wurden diese Glycopeptid-Antigene über einen Spacer mit immunstimulierenden Komponenten verknüpft. Als Immunstimulanzien wurden ein T-Zell-Epitop aus dem Ovalbumin (OVA323-339) sowie die Carrier-Proteine Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanus-Toxoid (TTox) verwendet. rnDie synthetischen MUC1-Glycopeptide wurden durch Immunisierung von Mäusen einer immunologischen Evaluierung unterzogen. Insbesondere die synthetischen MUC1-Glycopeptid-TTox-Vakzine lösen sehr starke Immunantworten aus. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierten Antikörper stark an Tumorzellen und auch an Mammakarzinom-Gewebe binden, was für die Entwicklung von Antitumor-Vakzinen als vielversprechend einzustufen ist.

Synthesis and investigation of functional polymer materials

Funktionelle Materialien sind in einer Vielzahl von Materialklassen wie Polymeren, Biomaterialien, Gläsern, Metallen, Keramiken und Verbundwerkstoffen anzutreffen. Sie besitzen eine spezifische, intrinsische Funktion, welche auf dem zu Grunde liegenden Design der Verbindung beruht. In dieser Dissertation wurden zwei funktionelle Materialien studiert: ein durch Phosphonatadditive mechanisch verstärktes Epoxidharz und protonenleitende Blockcopolymere, welche Potential für den Einsatz in Brennstoffzellen besitzen. Die Materialien wurden vorranging mittels Festkörper Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) untersucht, welche sich besonders für die Untersuchung der lokalen Struktur und Dynamik amorpher Polymere eignet.rnrnPhosphonate sind eine neue Klasse sogenannter molekularer Verstärker, die die mechanischen und thermischen Kennzahlen geeigneter Epoxidharze erhöhen. Es wurde eine Reihe von Phosphonatderivaten synthetisiert um systematische den Effekt der chemischen Struktur und des Aushärteprozesses auf die Eigenschaften eines Modellepoxidharzes zu untersuchen. Die Aufklärung des Verstärkungsmechanismus ergab, dass die Phosphonate währen der thermischen Aushärtung des Epoxidharzes die Aminofunktionalitäten des Härters alkylieren. Dies führt zu der Bildung von homogen verteilten, positiven Ladungen auf der Polymerkette, während negative Phosphonatanionen als Gegenionen wirken. Es konnte gezeigt werden, dass die Struktur des Additivs einen entscheidenden Einfluss auf die Eigenschaften des ausgehärteten Epoxidharzes sowie seine Alterung, d.h. den allmählichen Verlust der Verstärkung, hat.rnrnDes Weiteren wurde eine Serie von sulfonierten Blockcopolymeren synthetisiert. Es handelte sich hierbei um Multiblockcopolyimide, wobei die Polymerketten aus einer alternierenden Sequenz von sulfonierten (hydrophilen) und unsulfonierten (hydrophoben) Blöcken bestanden. Diese Polymere bilden nach einem ‚solvent cast‘ Prozess feste, duktile und transparente Membrane. Sulfonierte Blockcopolymermembrane zeigten im Vergleich mit statistisch sulfonierten Vergleichssubstanzen eine erhöhte Leitfähigkeit, sowie eine erhöhte Wasseraufnahme. Dies wurde auf eine bessere Phasenseparation im Festkörper zurückgeführt. Die Morphologie der Filme war eindeutig anisotrop und stark abhängig von der Blocklänge der Polymere. Durch diverse Festkörper-NMR Methoden konnte gezeigt werden, dass die Protonenmobilität in den Membranen von der betrachteten Längenskala abhängig ist und nicht notwendigerweise mit der makroskopisch beobachteten Leitfähigkeit korreliert.

Inhibition allergenspezifischer Immunantworten im Mausmodell der Typ-I Allergie nach biolistischer Vakzinierung mit allergenkodierenden Plasmiden in Kombination mit für immunmodulatorische Moleküle kodierender Plasmid-DNA

Die Induktion von Toleranz spielt bei der Inhibition allergischer Immunreaktionen eine wichtige Rolle. Hierbei ist die Induktion regulatorischer T Zellen (Treg) von großer Bedeutung. Da zu einer erfolgreichen Behandlung von allergischen Erkrankungen bisher nur wenige Therapiemöglichkeiten zur Verfügung stehen wie die spezifische Immuntherapie (SIT), die allerdings nicht immer zum Erfolg führt, ist es wichtig neue Therapieformen zu entwickeln. rnIn dieser Arbeit wurde daher die biolistische DNA-Immunisierung mit Kombinations-Vakzinen bestehend aus einem allergenkodierenden Plasmid (βGalaktosidase (βGal)) in Kombination mit einem Plasmid, welches für ein immunmodulatorisches Molekül kodiert (Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO), Transforming Growth Factor beta (TGF-β) oder Interleukin-10 (IL-10)), durchgeführt und im Mausmodell der allergeninduzierten IgE-vermittelten Atemwegsinflammation auf ihre Wirksamkeit untersucht. Die Expression des Allergens zusammen mit dem immunregulatorischen Molekül in transfizierten Dendritischen Zellen (DCs) sollte zu einer Induktion von Treg führen und somit eine Suppression der Immunantwort bewirken. rnIn den Versuchen wurde zunächst der Effekt einer Transgenexpression unter der Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors mit dem der Transgenexpression unter der Kontrolle des Fascin-Promotors, der eine Genxpression spezifisch in DCs erlaubt, verglichen. Hierbei stellte sich heraus, dass es wichtig ist die Expression des Antigens mit Hilfe des Fascin-Promotors auf DCs zu beschränken. Einzig in diesem Fall konnte nach der Vakzinierung ein inhibitorischer Effekt auf die Entwicklung einer Atemwegshyperreaktivität durch Expression des Immunmodulatoren IDO beobachtet werden. Es zeigte sich auch, dass es von Vorteil ist, wenn das immunregulatorische Molekül unter Verwendung des CMV-Promotors in allen transfizierten Zellen exprimiert wird. Dies bewirkt, dass IDO in ausreichenden Konzentrationen vorhanden ist. rnDie Expression von βGal unter der Kontrolle des Fascin-Promotors (pFascin-βGal) in Kombination mit der Expression der Moleküle IL-10, TGF-β oder IDO unter Kontrolle des CMV-Promotors (pCMV-IL-10, pCMV-TGFβ, pCMV-IDO) bewirkte eine Immunsupprimierung, die sich in einer inhibierten Produktion antigenspezifischer Antikörper, einer verminderten Zytokin-Produktion, einer reduzierten Induktion zytotoxischer T-Zellen und in einer Inhibition der allergeninduzierten Atemwegshyperreaktivität zeigte, im Vergleich zu einer Vakzinierung mit pFascin-βGal in Kombination mit einem Kontroll-Plasmid. Bei nachfolgender Proteinsensibilisierung blieben diese Effekte jedoch nicht bestehen. Einzig durch Vakzinierung mit IL-10-kodierenden Plasmiden konnte eine moderate Verminderung der Atemwegsreaktivität nachgewiesen werden. rnIn einem therapeutischen Modell der Atemwegsinflammation, in dem die Mäuse vor der DNA-Immunisierung mit dem Protein sensibilisiert wurden, wurde demonstriert, dass im Vergleich zu Mäusen, die nur mit dem Protein sensibilisiert wurden, eine DNA-Immunisierung mit pFascin-βGal aber auch mit pCMV-βGal einen inhibierenden Einfluss auf die Entwicklung einer Atemwegsinflammation hat. Eine weitere Reduktion der Atemwegsreaktivität durch eine kombinierte Vakzinierung mit pCMV-IDO wurde nur erreicht, wenn βGal unter der Kontrolle des Fascin-Promotors exprimiert wurde, nicht aber unter Kontrolle des CMV-Promotors.rn

Präklinische Evaluierung von therapeutischer Vakzinierung zur Effizienzsteigerung der adoptiven Immuntherapie von Cytomegalovirus-Erkrankungen

Klinische Manifestationen einer Cytomegalovirus (CMV)-Infektion gefährden den therapeutischen Erfolg der hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT). Dabei stellt insbesondere die Reaktivierung von latentem CMV im HSCT-Rezipienten das häufigste Infektionsrisiko dar. Die Inzidenz der CMV-Erkrankung kann durch Rekonstitution adoptiv transferierter CMV-spezifischer CD8 T-Zellen im HSCT-Rezipienten reduziert werden. Das Modell der sogenannten adoptiven Immuntherapie wurde zunächst im murinen Modell entwickelt und bereits in klinischen Studien bestätigt. Jedoch ist der adoptive Transfer (AT) aufgrund der nur limitiert zur Verfügung stehenden therapeutisch effektiven Zellzahlen zurzeit in der klinischen Routine nicht einsetzbar.rnZiel dieser Arbeit war daher die präklinische Evaluierung einer Kombinationstherapie aus AT einer limitierten Anzahl CMV-spezifischer T-Zellen und deren in vivo Expansion durch therapeutische Vakzinierung nach HSCT. Zur Testung dieser Therapie wurde ein murines Modell auf der Grundlage von rekombinanten murinen CMV (mCMV) und rekombinanten HCMV Dense Bodies (DB) etabliert. Beide exprimieren das gut charakterisierte MHC-Klasse-I Kb-restringierte SIINFEKL-Peptid (OVA257-264) des Ovalbumins (OVA) bzw. die Funktions-verlustmutante SIINFEKA als Modellantigen. In den rekombinanten mCMV, mCMV-Δm157Luc/m164-SIINFEKL/-A (mCMV-SIINFEKL/-A), wurde mittels orthotopen Peptid-austauschs das m164257-265 Peptid des gp36,5/m164 Proteins deletiert und durch das SIINFEKL- bzw. SIINFEKA-Peptid ersetzt. Anhand von Priming-Analysen konnte gezeigt werden, dass nach Infektion von C57BL/6 Mäusen mit mCMV-SIINFEKL SIINFEKL-spezifische T-Zellen nachweisbar sind und das im CMV-Genom integrierte SIINFEKL funktional prozessiert und präsentiert wird. Parallel hierzu konnte nach Immunisierung mit DB-SIINFEKL in vivo ein SIINFEKL-spezifisches CD8 T-Zell-Priming induziert werden. In weiteren Experimenten konnte nach DB-SIINFEKL-Immunisierung im poplitealen Lymphknoten sowie in der Milz eine Proliferation von adoptiv transferierten CD8 T-Zellen beobachtet werden. Die anschließenden Challenge-Versuche zeigten, dass eine DB-SIINFEKL-Immunisierung epitopspezifisch vor einer hoch dosierten Challenge-Infektion mit mCMV-SIINFEKL schützt. Im AT-Modell konnte gezeigt werden, dass adoptiv transferierte OT-I Zellen hämatoablativ behandelte Rezipienten epitopspezifisch vor einer mCMV-SIINFEKL-Infektion schützen können, wobei der erzielte Schutz durch zusätzliche Vakzinierung mit DB-SIINFEKL deutlich verbessert werden konnte. Im Anschluss konnte im HSCT-Rezipienten erstmals eine durch zusätzliche Vakzinierung signifikante Verbesserung des protektiven Potenzials adoptiv transferierter OT-I Zellen bestätigt werden. Diese Verstärkung der Protektion ermöglicht die Reduktion der Anzahl der für den Schutz benötigten Zellzahl und erhöht damit die Effizienz der adoptiven Immuntherapie.

Untersuchungen zur Regulation von T-Effektorzellen im peripheren Blut von MS-Patienten und humanisierten Mäusen mit einer induzierten autoimmunen Enzephalitis

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunkrankheit des zentralen Nervensystems, bei der sich autoreaktive T-Effektorzellen der Kontrolle durch regulatorische T-Zellen (Treg) entziehen. Innerhalb dieser Arbeit wurde gezeigt, dass T-Effektorzellen von MS-Patienten insensitiv gegenüber der Suppression durch Treg sind. Hervorgerufen wird diese Treg-Resistenz durch Interleukin-6 (IL-6). Die Inhibition des IL-6-Signalweges stellt die Treg-vermittelte Suppression der T-Effektorzellen wieder her. Es zeigte sich, dass die Bildung von IL-6 und die Expression des IL-6-Rezeptors in MS-Patienten in einer positiven Rückkopplungsschleife von IL-6 selbst induziert werden.rnZur Analyse humaner Immunantworten in vivo und deren Modulation durch humanspezifische Therapeutika wurden humanisierte Mausmodelle etabliert. Der adoptive Transfer humaner Immunzellen in immundefiziente Mäuse erlaubte die Untersuchung von T-Lymphozyten, die aus dem Blut von MS-Patienten isoliert wurden. Es zeigte sich, dass Treg-resistente T-Effektorzellen aus den MS-Patienten in den Tieren eine letale Graft-versus-Host-Erkrankung auslösten, die nicht durch aktivierte Treg therapiert werden konnte. Erst eine Behandlung mit dem humanspezifischen anti-IL-6-Antikörper Tocilizumab in vivo konnte die Erkrankung der Tiere deutlich abmildern.rnIm zweiten Modell wurden immundefiziente Mäuse mit humanen CD34+ Blutstammzellen immunologisch rekonstituiert. Diese Tiere entwickelten ein nahezu vollständig humanes Immunsystem. Die Immunisierung mit dem murinen Myelin-Oligodenrozyten-Glykoprotein löste in den humanisierten Mäusen eine MS-ähnliche Autoimmunität aus. Die Neuroinflammation wurde durch humane T- und B-Zellen vermittelt, korrelierte mit erhöhter IL-17-Produktion und führte zu einer IL-6-abhängigen Treg-Resistenz der T-Effektorzellen. Somit eignen sich die etablierten Modelle, um zukünftig die Wirksamkeit neuer Therapeutika zur Behandlung der MS präklinisch zu testen.rn

Einfluss subviraler Partikel des humanen Cytomegalovirus auf die Induktion der antiviralen Immunantwort

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der insbesondere bei Patienten mit unreifem oder geschwächtem Immunsystem schwere, teilweise lebensbedrohliche Erkrankungen verursacht. Aufgrund der klinischen Relevanz wird die Entwicklung einer Impfung gegen HCMV mit großem Nachdruck verfolgt. Subvirale Partikel des HCMV, sogenannte Dense Bodies (DB), stellen eine vielversprechende Impfstoff-Grundlage dar. Die innere Struktur der Partikel besteht aus viralen Proteinen, die als dominante Antigene der zellulären Immunantwort gegen HCMV identifiziert wurden. Die äußere Hülle der Partikel entspricht der Virushülle, sie enthält die viralen Oberflächenproteine als Zielantigene der neutralisierenden Antikörper (NTAk)-Antwort in ihrer natürlichen Konformation. Die für ein Totantigen außergewöhnlich hohe Immunogenität der Partikel wurde bereits in Vorarbeiten dokumentiert. Ein Ziel dieser Arbeit war es, den molekularen Hintergrund für die herausragenden, immunogenen Eigenschaften von DB aufzuklären. Im ersten Teil der Arbeit wurde daher die Hypothese geprüft, dass DB geeignet sind, die Ausreifung und Aktivierung von dendritischen Zellen (DC) zu vermitteln und damit deren Fähigkeit zur Antigenpräsentation zu stimulieren. Derart aktivierten DC kommt eine wichtige Rolle beim Priming der T-lymphozytären Immunantwort zu. In der Tat konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von unreifen dendritischen Zellen (iDC) mit DB zu verstärkter Expression von solchen Molekülen auf der DC-Oberfläche führt, die mit Ausreifung der Zellen verknüpft sind. Der Nachweis der verstärkten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine belegte die Aktivierung der Zellen im Sinne einer entzündlichen Reaktion. Die erfolgreiche Stimulation von CD4 und CD8 T-Lymphozyten durch DB-behandelte DC belegte schließlich die funktionelle Relevanz der Ergebnisse. Zusammengefasst konnten in diesem Abschnitt der Arbeit die molekularen Grundlagen der adjuvanten Wirkung von DB aufgeklärt werden. rnIn einem zweiten Abschnitt wurde die NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung näher untersucht. Der humoralen Immunantwort kommt eine entscheidende Bedeutung bei der Prävention der HCMV-Übertragung zu. Hier galt es zu prüfen, welchen Einfluss stammspezifische Unterschiede in der Expression viraler Oberflächenproteine auf die Induktion der NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung nehmen. Im Fokus stand dabei die variable Expression des pentameren Proteinkomplexes aus den viralen Proteinen gH/gL/pUL128-UL131A. Dieser Komplex wird nur von kliniknahen HCMV-Stämmen (HCMVKlin) exprimiert und ist für deren breiten Zelltropismus verantwortlich. Der pentamere Komplex fehlte in allen bisherigen Analysen der DB-Immunogenität, die auf der Grundlage von Laborstämmen des HCMV (HCMVLab) durchgeführt worden waren. Ein erster Versuchsansatz zeigte, dass die NTAk-Antwort, die durch DB von HCMVLab (DBLab) induziert wird, auch gegen die Infektion mit HCMVKlin einen gewissen Schutz vermittelt. Dies war ein überraschender Befund, da Antikörpern gegen den pentameren Komplex eine entscheidende Rolle bei der Neutralisation von HCMVKlin zugeschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass Antikörper gegen andere Zielstrukturen zur Neutralisation von HCMVKlin beitragen. Hieraus resultierte unmittelbar die Frage, inwieweit eine Aufnahme des pentameren Komplexes in einen DB-basierten Impfstoff überhaupt notwendig war. Um dies zu beantworten war es notwendig, DB herzustellen, die den pentameren Komplex enthielten. Hierzu wurde ein HCMVLab durch Mutagenese des 235 kpb Genoms so modifiziert, dass von dem resultierenden Stamm der pentamere Komplex exprimiert wurde. In gereinigten DB dieses Stammes konnten die Komponenten des pentameren Komplexes nachgewiesen werden. Die Seren von Tieren, die mit DB dieses neuen Stammes immunisiert wurden, zeigten in der Tat eine deutlich gesteigerte Kapazität zur Neutralisation von HCMVKlin auf verschiedenen Zielzellen. Diese Ergebnisse unterstreichen schlussendlich, dass die Expression des pentameren Komplexes einen Vorteil bei der Induktion der antiviralen NTAk-Antwort erbringt. Zusammengefasst liefern die Erkenntnisse aus dieser Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der immunogenen Wirkung von DB. Auf dieser Grundlage war es nunmehr möglich, ein Projekt zur Austestung der DB-Vakzine in einer ersten klinischen Studie zu initiieren.

Picard-Fuchs equations of dimensionally regulated Feynman integrals

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit besch¨aftige ich mich mit Differentialgleichungen von Feynman– Integralen. Ein Feynman–Integral h¨angt von einem Dimensionsparameter D ab und kann f¨ur ganzzahlige Dimension als projektives Integral dargestellt werden. Dies ist die sogenannte Feynman–Parameter Darstellung. In Abh¨angigkeit der Dimension kann ein solches Integral divergieren. Als Funktion in D erh¨alt man eine meromorphe Funktion auf ganz C. Ein divergentes Integral kann also durch eine Laurent–Reihe ersetzt werden und dessen Koeffizienten r¨ucken in das Zentrum des Interesses. Diese Vorgehensweise wird als dimensionale Regularisierung bezeichnet. Alle Terme einer solchen Laurent–Reihe eines Feynman–Integrals sind Perioden im Sinne von Kontsevich und Zagier. Ich beschreibe eine neue Methode zur Berechnung von Differentialgleichungen von Feynman– Integralen. ¨ Ublicherweise verwendet man hierzu die sogenannten ”integration by parts” (IBP)– Identit¨aten. Die neue Methode verwendet die Theorie der Picard–Fuchs–Differentialgleichungen. Im Falle projektiver oder quasi–projektiver Variet¨aten basiert die Berechnung einer solchen Differentialgleichung auf der sogenannten Griffiths–Dwork–Reduktion. Zun¨achst beschreibe ich die Methode f¨ur feste, ganzzahlige Dimension. Nach geeigneter Verschiebung der Dimension erh¨alt man direkt eine Periode und somit eine Picard–Fuchs–Differentialgleichung. Diese ist inhomogen, da das Integrationsgebiet einen Rand besitzt und daher nur einen relativen Zykel darstellt. Mit Hilfe von dimensionalen Rekurrenzrelationen, die auf Tarasov zur¨uckgehen, kann in einem zweiten Schritt die L¨osung in der urspr¨unglichen Dimension bestimmt werden. Ich beschreibe außerdem eine Methode, die auf der Griffiths–Dwork–Reduktion basiert, um die Differentialgleichung direkt f¨ur beliebige Dimension zu berechnen. Diese Methode ist allgemein g¨ultig und erspart Dimensionswechsel. Ein Erfolg der Methode h¨angt von der M¨oglichkeit ab, große Systeme von linearen Gleichungen zu l¨osen. Ich gebe Beispiele von Integralen von Graphen mit zwei und drei Schleifen. Tarasov gibt eine Basis von Integralen an, die Graphen mit zwei Schleifen und zwei externen Kanten bestimmen. Ich bestimme Differentialgleichungen der Integrale dieser Basis. Als wichtigstes Beispiel berechne ich die Differentialgleichung des sogenannten Sunrise–Graphen mit zwei Schleifen im allgemeinen Fall beliebiger Massen. Diese ist f¨ur spezielle Werte von D eine inhomogene Picard–Fuchs–Gleichung einer Familie elliptischer Kurven. Der Sunrise–Graph ist besonders interessant, weil eine analytische L¨osung erst mit dieser Methode gefunden werden konnte, und weil dies der einfachste Graph ist, dessen Master–Integrale nicht durch Polylogarithmen gegeben sind. Ich gebe außerdem ein Beispiel eines Graphen mit drei Schleifen. Hier taucht die Picard–Fuchs–Gleichung einer Familie von K3–Fl¨achen auf.

The role of SENP1 in B cell development and differentiation

SUMOylation is a highly dynamic and reversible posttranslational protein modification closely related to ubiquitination. SUMOylation regulates a vast array of different cellular functions, such as cell cycle, nuclear transport, DNA damage response, proliferation and transcriptional activation. Several groups have shown in in vitro studies how important SUMOylation is for early B cell development and survival as well as for later plasma cell differentiation. This thesis focuses on the deSUMOylation protease SENP1 and its in vivo effects on B cell development and differentiation. For this a conditional SENP1 knockout mouse model was crossed to the CD19-Cre mouse strain to generate a B cell specific SENP1 knockout mouse.rnIn our conditional SENP1ff CD19-Cre mouse model we observed normal numbers of all B cell subsets in the bone marrow. However in the spleen we observed an impairment of B cell survival, based on a 50% reduction of the follicular B cell compartment, whereas the marginal zone B cell compartment was unchanged. T cell numbers were comparable to control mice. rnFurther, impairments of B cell survival in SENP1ff CD19-Cre mice were analysed after in vivo blocking of IL7R signalling. The αIL7R treatment in mature mice blocked new B cell formation in the bone marrow and increased apoptosis rates could be observed in splenic SENP1 KO B cells. Additionally, a higher turnover rate of B cells was measured by in vivo BrdU incorporation.rnSince it is known that the majority of transcription factors that are important for the maintenance of the germinal centre reaction or for induction of plasma cell development are SUMOylated, the question arose, how defective deSUMOylation will manifest itself in these processes. The majority of in vitro cultured splenic B cells, stimulated to undergo class switch recombination and plasma cell differentiation underwent activation induced cell death. However, the surviving cells increasingly differentiated into IgM expressing plasma cells. Class switch recombination to IgG1 was reduced. These observations stood in line with observation made in in vivo sheep red blood cell immunization experiments, which showed increased amounts of germinal centres and germinal centre B cells, as well as increased amounts of plasma cells differentiation in combination with decreased class switch to IgG1.rnThese results lead to the conclusion that SENP1 KO B cells increasingly undergo apoptosis, however, B cells that survive SENP1 deficiency are more prone to undergo plasma cell differentiation. Further, the precursors of these plasma cells either are not as capable of undergoing class switch recombination or they do switch to IgG1 and succumb to activation induced cell death. One possible explanation for both scenarios could be a defective DNA damage response mechanisms during class switch recombination, caused by impaired deSUMOylation. rn

On the aetiology of bovine neonatal pancytopenia (BNP)

Bovine Neonatal Pancytopenia (BNP) is a novel haemorrhagic disease in sucking calves, characterised by bleeding, haematological changes and high mortality. Dams that gave birth to BNP affected calves were immunized with PregSure® BVD, a highly adjuvanted vaccine against Bovine Viral Diarrhoea (BVD). We can show that bioprocess impurities in the vaccine, originating from the cell line used for vaccine production induces alloantibodies in vaccinated cattle. Via flow cytometry and immunoprecipitation we can demonstrate that PregSure® BVD immunization leads to BNP alloantibody production. BNP alloantibodies target highly polymorphic bovine MHC-I molecules (BoLA I). We sequenced eight BoLA I variants expressed by the production cell line and identified three alleles which are responsible for the majority of PregSure® BVD induced BoLA I reactivity. The BoLA I alleles of BNP unaffected calves are not recognized by the BNP associated alloantibodies of their respective dams. We also examined whether BNP alloantibodies cross-react with human cells, thus being a potential hazard for human colostrum consumers and could show that BNP alloantibodies are cross-reactive to human MHC-I and can even be found in commercial colostrum powder manufactured from cows immunized with PregSure® BVD. Overall we can demonstrate that BNP is a vaccine induced alloimmune disease.

Der Einfluss von Chemotherapeutika mit Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF)-modulierendem Potential sowie eines Verlustes des HIF-Regulators von Hippel-Lindau (VHL) auf den Phänotyp und die Funktion dendritischer Zellen

Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF) gibt dem Organismus die Möglichkeit, sich auf zellulärer Ebene an unterschiedliche Sauerstoffverhältnisse anzupassen. Vor allem Tumorzellen weisen aufgrund ihres ungeregelten Wachstums und der daraus resultierenden unzureichenden Durchblutung (hypoxisches Milieu) eine erhöhte HIF-Expression auf. Die erhöhte HIF-Expression stellt somit ein interessantes Ziel in der Tumortherapie dar. Dendritische Zellen (DCs) besitzen eine bedeutende Rolle in der Generierung und Modulierung von Antitumor-Immunantworten. Aus diesem Grund ist es überaus wichtig zu wissen, welche Effekte Antitumor-Agenzien, im Besonderen HIF-Inhibitoren, auf DCs und somit auch auf die Generierung von adäquaten Immunantworten besitzen.rnIm ersten Teil dieser Arbeit wurde aus diesem Grund der Einfluss der Antitumor-Agenzien Geldanamycin (GA) und Topotecan (TPT) auf den Phänotyp und die Funktion von DCs untersucht. Hierfür wurden Monozyten aus humanen, mononukleären, peripheren Blutzellen isoliert und unter DC-differenzierenden Konditionen kultiviert. Diese immaturen monozytenabgeleiteten DCs (Mo-DCs) wurden mithilfe eines Reifungscocktails ausgereift. Die Applikation der Antitumor-Agenzien erfolgte während der Differenzierungs- bzw. Ausreifungsphase. Abhängig vom Reifungsgrad der Mo-DCs konnte ein differentieller Einfluss von GA bzw. TPT auf die DC-Aktivierung beobachtet werden. Eine Behandlung von unstimulierten Mo-DCs mit GA resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung basierend auf einem noch unbekannten Mechanismus. Ebenso führte eine Behandlung von unstimulierten Mo-DCs mit TPT zu einer funktionellen Aktivierung der DCs, die mit einer vermehrten AKT-Expression korrelierte. Die jeweilige Koapplikation der Antitumor-Agenzien mit dem DC-Reifungscocktail führte zu einer reduzierten DC-Aktivierung, die sich in einer verminderten NF-κB-Aktivierung, einer verringerten Oberflächenexpression der getesteten kostimulatorischen Moleküle, einer verringerten Migrationsfähigkeit und einem reduzierten Zellstimulierungspotential widerspiegelte.rnDie autosomal dominant vererbte Tumorerkrankung von Hippel-Lindau (VHL) wird häufig durch genetische Mutationen des als HIF-Negativregulator fungierenden VHL-Gens hervorgerufen. Patienten, die an dem VHL-Syndrom erkrankt sind, weisen oft benigne oder maligne Tumore und Zysten in den verschiedensten Organsystemen auf. Wie schon zuvor erwähnt, besitzen DCs eine essentielle Rolle in der Initiierung und Aufrechterhaltung von Antitumor-Immunantworten. Deshalb wurde im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit ein partieller Verlust von VHL Auswirkungen auf die Ausprägung desrnPhänotyps und der Funktion von DCs hat. Mittels Cre/lox-Technologie wurden transgene Mäuse mit einem heterozygoten Verlust von Exon 1 bzw. Exon 2 des VHL-Gens generiert. Aus diesen Mäusen wurden Knochenmarkszellen isoliert und unter DC-differenzierenden Konditionen kultiviert. Die immaturen knochenmarkabgeleiteten DCs (BM-DCs) wurden mit LPS ausgereift. Weder der heterozygote Verlust von Exon 1 noch von Exon 2 des VHL-Gens bewirkte eine Veränderung der Oberflächenmarkerexpression, der in vitro-Migrations- undrnEndozytosekapazität, sowie der allogenen T-Zellstimulierungskapazität. Allerdings zeigten Mäuse mit einem partiellen Verlust von Exon 2 im Vergleich zu Kontrollmäusen nach Immunisierung und Provokation mit dem Modellallergen OVA eine verminderte Atemwegshyperreaktion, die möglicherweise auf die beobachtete Abnahme der Migrationsfähigkeit in vivo und die verminderte OVA-spezifische T-Zellstimulierungskapazität der DCs zurückzuführen ist.

Hydrodynamics and solid dosage form disintegration/dissolution : immediate release tablets and novel in situ polyelectrolyte gastroretentive drug delivery systems

Solid oral dosage form disintegration in the human stomach is a highly complex process dependent on physicochemical properties of the stomach contents as well as on physical variables such as hydrodynamics and mechanical stress. Understanding the role of hydrodynamics and forces in disintegration of oral solid dosage forms can help to improve in vitro disintegration testing and the predictive power of the in vitro test. The aim of this work was to obtain a deep understanding of the influence of changing hydrodynamic conditions on solid oral dosage form performance. Therefore, the hydrodynamic conditions and forces present in the compendial PhEur/USP disintegration test device were characterized using a computational fluid dynamics (CFD) approach. Furthermore, a modified device was developed and the hydrodynamic conditions present were simulated using CFD. This modified device was applied in two case studies comprising immediate release (IR) tablets and gastroretentive drug delivery systems (GRDDS). Due to the description of movement provided in the PhEur, the movement velocity of the basket-rack assembly follows a sinusoidal profile. Therefore, hydrodynamic conditions are changing continually throughout the movement cycle. CFD simulations revealed that the dosage form is exposed to a wide range of fluid velocities and shear forces during the test. The hydrodynamic conditions in the compendial device are highly variable and cannot be controlled. A new, modified disintegration test device based on computerized numerical control (CNC) technique was developed. The modified device can be moved in all three dimensions and radial movement is also possible. Simple and complex moving profiles can be developed and the influence of the hydrodynamic conditions on oral solid dosage form performance can be evaluated. Furthermore, a modified basket was designed that allows two-sided fluid flow. CFD simulations of the hydrodynamics and forces in the modified device revealed significant differences in the fluid flow field and forces when compared to the compendial device. Due to the CNC technique moving velocity and direction are arbitrary and hydrodynamics become controllable. The modified disintegration test device was utilized to examine the influence of moving velocity on disintegration times of IR tablets. Insights into the influence of moving speed, medium viscosity and basket design on disintegration times were obtained. An exponential relationship between moving velocity of the modified basket and disintegration times was established in simulated gastric fluid. The same relationship was found between the disintegration times and the CFD predicted average shear stress on the tablet surface. Furthermore, a GRDDS was developed based on the approach of an in situ polyelectrolyte complex (PEC). Different complexes composed of different grades of chitosan and carrageenan and different ratios of those were investigated for their swelling behavior, mechanical stability, and in vitro drug release. With an optimized formulation the influence of changing hydrodynamic conditions on the swelling behavior and the drug release profile was demonstrated using the modified disintegration test device. Both, swelling behavior and drug release, were largely dependent on the hydrodynamic conditions. Concluding, it has been shown within this thesis that the application of the modified disintegration test device allows for detailed insights into the influence of hydrodynamic conditions on solid oral dosage form disintegration and dissolution. By the application of appropriate test conditions, the predictive power of in vitro disintegration testing can be improved using the modified disintegration test device. Furthermore, CFD has proven a powerful tool to examine the hydrodynamics and forces in the compendial as well as in the modified disintegration test device. rn