三种红藻光合作用色素系统的比较研究

本研究分为三个部分：1.以坛紫菜（Porphyra haitanesis Chang et Zheng）的叶状体和丝状体为研究对象，比较坛紫菜叶状体和丝状体的光合色素、色素蛋白的组成，并提取纯化藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻胆体及类囊体膜和光系统。研究结果表明坛紫菜叶状体和丝状体色素及色素蛋白的含量不同，藻红蛋白是主要的色素蛋白，坛紫菜叶状体和丝状体的藻红蛋白的含量分别为2.9mg藻红蛋白/g鲜重、4.2mg藻红蛋白/g鲜重，这表明坛紫菜叶状体和丝状体藻红蛋白含量丰富，是提取藻红蛋白很好的材料。藻胆体的性质差异不大，但类囊体膜差异显著，从坛紫菜叶状体中分离到了两种不同的类囊体膜带，光系统Ⅰ(PSⅠ)和PSⅡ分别结合在两条类囊体膜带上，但从坛紫菜丝状体中也分离到两条类囊体膜带，它们的光谱性质和蛋白组成相似，仅放氧速率和DCIP活性有差异，从坛紫菜丝状体中我们仅分离到PSⅡ。坛紫菜叶状体PSⅡ有5种外在蛋白(33、20、Cytc 550、15、12kDa蛋白)，而坛紫菜丝状体外在蛋白仅有4条，缺少12kDa蛋白。2. 以在中国江苏部分地区进行了大规模的商业化栽培的突变体条斑紫菜（Porphyra yezoensis Ueda）和野生型条斑紫菜为研究对象，比较其色素及色素蛋白组成、对不能光质的利用率及藻胆体的组成。条斑紫菜和突变型条斑紫菜对不同的光质利用效果有差异，在白光的照射下，野生型紫菜的放氧速率最大，而突变型紫菜在黄光照射下的放氧速率最大。条斑紫菜野生型与突变型色素含量上有明显的差异,突变型紫菜的藻红蛋白含量明显减少而藻蓝蛋白的含量增加。通过杂交的方法证实诱变所获得条斑紫菜突变体为细胞质突变，但是突变型紫菜却发生了由细胞核编码的γ亚基的缺失，这表明突变型紫菜藻红蛋白含量和性质发生了明显的变化。3. 为了找出淡水红藻-深紫美芒藻(Compsopogon coeruleus (Balbis) Montagne)分布狭窄及生物产量低的原因，本文对深紫美芒藻在不同的盐离子浓度下的放氧速率及藻胆体色素组成和结构上进行研究。结果显示：微量的NaCl（0.1mM）促进深紫美芒藻放氧，而深紫美芒藻在较高的NaCl（1、10mM）, NaH2PO4 （0.1、1、10mM）和 NH4NO3（0.1、1、10mM）溶液中却没有检测到氧气的产生。这与深紫美芒藻生长的环境一致即深紫美芒藻生活在低盐浓度、低营养的泉水中。深紫美芒藻的藻胆体是由藻红蛋白、藻蓝蛋白及别藻蓝蛋白组成，上面结合α、β和γ亚基，含有藻红胆素、藻篮胆素，但缺乏缺少藻尿胆素。

刺参生态增养殖原理与关键技术

针对目前刺参养殖业中面临的问题，系统研究了刺参的基础生物学、组织学，生理生态学和呼吸生理学特征，评估了刺参的养殖容量，优化了养殖模式，以嵊泗列岛为例，系统研究了刺参南移后的存活和生长等特征。研究结果如下： 1．刺参体腔液细胞存在于刺参的体腔中，体腔液细胞行使免疫防御、营养贮存和运输的功能。根据形态和功能上的特征可分为小淋巴细胞、桑葚细胞、吞噬细胞、结晶细胞、纺缍细胞和振动细胞。体腔液细胞的形态和结构与其功能密切相关。不同特征的细胞可能是同一类型体腔液细胞的不同发育阶段。体腔液细胞平均密度为(3.79 ± 0.65)×106 cells /ml-1. 刺参的血淋巴细胞可分为小淋巴细胞、桑葚细胞、吞噬细胞和结晶细胞。刺参体腔液细胞可分为小淋巴细胞、桑葚细胞、吞噬细胞、结晶细胞、纺锤细胞和振动细胞。刺参吞噬细胞的吞噬率与温度呈正相关，并呈现出强烈的凝集现象。 2．刺参的血管、呼吸树、肌细胞和体腔内皮细胞的超微结构复杂，与其功能密切相关。夏眠前后刺参消化道明显萎缩，上皮细胞重吸收现象显著，结果显示组织结构的改变与外界环境相适应。刺参夏眠时体腔液pH和PO2升高，PCO2降低。连续取样对刺参体腔液血气指标没有显著性影响。刺参体腔液的%Extrw和%EwO2与体重呈负相关。 3．刺参的扰动导致底质中有机物含量、TOC、TN、叶绿素和细菌含量降低，刺参粪便中有机物含量高于周围底质，刺参对摄食底质具有选择性。刺参的扰动能增强底质的稳定性，与对照组相比，硫化物含量和氧化还原电位降低。 4．根据水体理化指标变化和自然沉积有机物的供饵力，结合不同温度下大规格刺参对自然生物沉积物的吸收率，计算刺参的养殖容量。浅海典型水域刺参的养殖容量约为109.40 g y-1m-2。 5．前三岛近岛水域底质有机物含量高于离岸深水水域，且粒度较离岸水域细，大多在0.20 mm以下。刺参的放流浓度和参礁的放置深度应选择在5-12m。刺参的放养规格宜为经人工越冬后体长在8-10厘米的参苗，体重超过30克。 6．研究了三种规格的刺参笼养殖存活和生长特征，初步建立了刺参筏式笼养技术。投喂海带，存活率达到83%以上。密度对刺参的生长有着显著的影响，随着实验的进行，放养密度增加，刺参的体重减小。4月后，随着温度的升高和海况的改变，刺参的生长率下降。刺参南移养殖模式的适宜放养密度应控制在3-5头，放养规格应在40g以上，经过5-6个月的生长能达到100g左右。

大型海洋植物脂肪酸和极性脂组成的研究

我们利用气相色谱（GC)和薄层色谱（TLC）对青岛地区常见的22种大型海洋植物，包括10种红藻，5种褐藻，5种绿藻和2种海草的脂肪酸和极性脂的组成进行了研究。结果表明，红藻以含有大量的20碳高度不饱和脂肪酸（PUFAs），主要为二十碳五烯酸（EPA）和二十碳四烯酸（AA）；褐藻中以含有大量的18碳PUFAs和20碳PUFAs；绿藻以含有大量的16碳PUFAs和18碳PUFAs；海草以含有大量的18碳PUFAs为特点。大型海洋植物作为PUFAs的原料具有很大的潜力。大型海洋植物极性脂的组成具有明显的特点。10种红藻极性脂组成几乎相同，并唯一含有鞘磷脂酰肌醇（SPI）；2种马尾藻以含有二酰甘油羟甲基三甲基－β－丙氨酸（DGTA）和不含磷脂酰胆碱（PC）区别于其他3种褐藻；在3类大型海藻中，只有绿藻含有二酰甘油三甲基溶血丝氨酸（DGTS）和磷脂酰丝氨酸（PS），此外，石莼目（Ulvales）的3种绿藻以不含PC区别于管藻目（Siphonales）的2种绿藻。DGTA和PC在褐藻中的相对分布，以及DGTS和PC在绿藻中的相对分布显示出和这些藻系统分类位置的联系。在两种海草中没有检测到DGTS。我们的结果不仅为寻求具有生物活性的PUFAs的原料提供了大量信息而且有利于海洋植物化学分类学的研究。

大菱鲆（Scophthatmus maximus）两种转基因方法的研究

本实验对外源基因导入大菱鲆的两种方法进行了研究。采用经过改进的电脉冲方法以及哺乳动物细胞中常用的转染法将该外源DNA片段导入到大菱鲆（Scophthalmus maximus）受精卵内，并对两种方法进行比较。 本实验综合考虑仔鱼的孵化率和外源DNA的导入率，确定了电脉冲最佳导入条件：脉冲电压为300 V/cm，脉冲次数为5，外源DNA浓度为20 mg/L。首先分别对脉冲电压、脉冲次数和外源DNA的浓度进行单因子实验，得到各因素的适宜水平范围。然后利用最适导入条件，实现基因元件大规模转移。转染试剂使用参数的确定根据Qbiogene公司用户手册上的使用说明进行，转染法的最佳操作时间为受精后50 min。应用上述两种方法进行批量转基因鱼实验，采用PCR技术对一月龄的原代转基因大菱鲆仔鱼的染色体DNA进行分析，得到外源基因的导入率分别为20~28％和60~70％。本实验表明利用转染试剂jetPEI处理单细胞期的大菱鲆受精卵能得到较高的孵化率及较高的转基因效率。 本实验初步建立了利用电脉冲精子载体法和转染法实现基因转移的作方法，为经济鱼类转基因育种及其生产应用提供了理论及方法依据。

中国若干典型海域作用于浮游植物上、下行效应的研究

在胶州湾内、东海与南海通过现场实验(营养盐添加实验与稀释实验)的方法，对N(N0_3~--N、NH_4~+-N)、P、Fe、Si营养盐以及小型浮游动物对浮游植物生长的调控机制进行了初步研究。同时还在胶州湾内开展了上、下行效应的比较研究，主要结果如下：1 在胶州湾内共进行了25次富营养现场实验与12次稀释实验，网采浮游植物(20-200μm)与微型浮游植物(2-20μm)是叶绿素a生物量的主要组成部分，比较而言，在周年的水平上，微型浮游植物比网采浮游植物更多的支配着浮游植物群落的叶绿素a生物量。在营养盐添加实验中，培养后期浮游植物群落也都是网采浮游植物与微型浮游植物占叶绿素a生物量的优势地位。胶州湾是营养盐含量较高，且营养盐变化不规律的海区，但胶州湾各季节的DIN／P基本都大于16:1的Redfield比值。营养盐添加实验的结果显示，在湾内，似乎在秋季无营养盐限制浮游植物生长的情况发生；而在冬、春季发生Si限制的可能性很大；除Fe外，在夏季似乎N(NO_3~--N、NH_4~+-N)、P、Si营养盐限制都有可能发生，但无明显的规律性。在周年的水平上，Si似乎是最主要的限制性营养盐，而P与N都可能产生次级营养盐限制。营养盐添加实验中分级叶绿素的结果显示，网采浮游植物与微型浮游植物在冬、春季一般会经历较显著的Si限制作用，在夏季N似乎对网采浮游植物与微型浮游植物的生长有更重要的调控作用。超微型浮游植物的生长似乎主要受到P的调控。在胶州湾内，网采浮游植物的生长似主要受到上行效应的调控，而下行效应似是控制超微型浮游植物生长的主要机制。从整个浮游植物群落(<200μm)的周年变化情况来看，在控制浮游植物的生物量上，似乎下行效应比上行效应更有效。 2在东海，除402站(122°33'E、30°45'N)位于长江口，受到显著的陆源输入影响外(特别是该站有相当高的SiO_3~(2-)-Si含量)，418站(127°30'E、27°55'N)、Y136站(128°、30°27')与E064(125°14'E、25°48'N)站都位于开放海区，营养盐含量都很低。1999年的航次，表层的硝酸盐与铵盐含量都比1998年的航次高，但另外三种常量营养盐含量都低。402站有较高比例的网采浮游植物与微型浮游植物叶绿素a生物量，相应的超微型浮游植物占总叶绿素a生物量的比例则显著低于其它三站。位于陆架区的Y136站，其微型浮游植物叶绿素a生物量则显著低于沿岸海区，但超微型浮游植物叶绿素a生物量则显著增加，占总叶绿素a的50％以上。处于开放海区的418站与E064站，网采浮游植物叶绿素a生物量所占的比例已经很低，而无一例外的是超微型浮游植物叶绿素a生物量贡献了总叶绿素a生物量的大部分。但在培养后期，各组处理中网采浮游植物占总叶绿素a生物量的比例都高于初始值。营养盐添加实验的结果显示，沿岸海水中，从比例上看，浮游植物的生长似乎更需要N而不是P，但是太高的N／P添加对浮游植物生长的促进作用反不如适中的N／P的添加；在418站，各种营养盐的添加对浮游植物的生长都有促进作用(Fe除外)，但P的作用更显著一些，在添加的两种N源中，NH_4~+-N的作用比NO_3~--N的作用更显著；在E064站，培养中各实验组的总叶绿素a生物量都有不同程度的增加，但NH_4~+-N与NO_3~--N的作用更显著；Y136站的实验结果与E064站相似，也是NH_4~+-N与NO_3~--N的作用更显著，而且该站Si的作用还比较显著(强于P)。在开放海区，1998年夏季，似乎是P限制着浮游植物群落的生长，但在1999年春季则可能是N限制着浮游植物的生物量。稀释实验的结果显示，在长江口附近的402站与开放海区的E064站浮游植物的生长率都显著高于大陆架的Y136站。小型浮游动物的摄食率则无明显的空间变化趋势，除开放海区的E064站显著高外，其它三站摄食率接近。这一结果与浮游物的群落组成，浮游植物的群落组成以及光照、温度等条件有关。营养盐添加实验与稀释实验的结果都证实，更可能是营养盐通过上行效应，而不是小型浮游动物实施下行效应控制着网采浮游植物的的生长；在东海的实验区域似乎是上行效应控制着微型浮游植物的种群数量变动，从营养盐添加实验的结果看，由于时间的不同，似乎有春季N限制与夏季P限制的季节交替；超微型浮游植物的生长也主要受到营养盐的控制，似乎也有春季N限制与夏季P限制的季节交替；摄食对微型浮游植物的生长有一定的调控作用，但这一调控机制并不是十分有效。3　在南海的航次中，表层硝酸盐的平均浓度较低，经常检测不出，但表层磷酸盐、铵盐与硅酸盐的浓度要比东热带太平洋等贫营养海区高。4 断面沿经度横跨大洋，其表层各种营养盐的平均浓度均低于2断面与5断面，（硝酸盐一般都在检测限之下，铵盐与磷酸盐的平均值分别为0.20与0.12 μM)，属于营养盐较低的海区；2断面表层各种营养盐的平均浓度最高(硝酸盐、铵盐与磷酸盐分别为0.29、1.17与O.19μM)；5断面表层平均的营养盐含量介于2断面与4断面之间，但硝酸盐含量经常在检测限之下。K206与K508站在培养实验的初始时刻都是超微型浮游植物占总叶绿素a生物量的大部分，但K409站网采浮游植物、微型浮游植物与超微型浮游植物的叶绿素a生物量分别占总叶绿素a生物量的30％左右。培养中，各组处理中网采浮游植物叶绿素a生物量占总叶绿素a生物量的比例都增加。K409站位于南海中央，该站浮游植物对各种营养盐的添加都有显著的响应效果；K206站位于2断面中部巴士海峡处，本站除P的添加效果较明显外，另外几种营养盐的富营养效果都不显著；K508站磷酸盐与硝酸盐的添加效果较明显。总的来说，各种营养盐的添加对浮游植物的生长都有促进作用，但磷酸盐的作用似乎更显著一些。实验结果可能更反应了N、P、Fe这几种营养盐的共同限制作用。Si限制不如其它几种营养盐显著。南海Fe的限制情况也不严重。各站浮游植物摄食率(g)与生长率(u)的空间变化都不显著。各站的g／u都在0.4左右，说明在南海小型浮游动物的摄食压力比较一致。K409站与K508站浮游植物的生长率显著高于K206站。小型浮游动物的摄食率与浮游植物生长率的变化趋势一致，都是中部的K409站与南边的K508站高于北边的K206站。这可能是各采样站点浮游动物种类组成不同的结果。网采浮游植物似乎主要受到各种营养盐的限制，其中P的作用最显著，N也较显著，随地域不同，间或有Fe的限制作用发生。在南海的中部，可能存在N、P、Fe营养盐对微型浮游植物的共同限制作用，但在北部，可能有微弱的P限制作用，而在大洋的南部，几乎无营养盐限制微型浮游植物的生长，摄食在控制微型浮游植物的生物量上并不是十分有效。超微型浮游植物的生长似乎同时受到营养盐与小型浮游动物摄食的控制，营养盐添加实验的结果显示可能P对超微型浮游植物的生长促进作用最大，同时进行的稀释实验证实，小型浮游动物的摄食活动在调节超微型浮游植物的生长上也相当有效。

环境因子对龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）营养枝生长的影响

本文在室内人工控制条件下，用切枝培养的方法研究了环境因子对龙须菜生长的影响。环境因子包括：海水温度、光照强度、硝酸盐浓度、磷酸盐浓度、盐度和维生素B_(12)。生长指标用切枝的长度增长和鲜重增加表示。首行以单因子实验找出该因子影响切枝生长的适宜范围，最后运用正交表L25(5~6)，采用正交设计法进行多因子实验，选择的变化因子和其级别是根据单因子实验来定。实验结果表明：在本实验条件下，龙须菜切枝生长的最适条件是，温度20 ℃，光照强度8750Lux，NO3-N10mM, PO4-Po.1mM, 盐度31%。切枝生长的适宜条件是，温度15-25 ℃，光照强度是3900-9500Lux, NO3-N 1-10mM.PO4-P0.01-0.1mM，盐度20-45%，VB_(12)对切枝长生的影响不显著。本实验的研究方法和结果对大型海藻的人工栽培工作有一定的参考价值。

两株海藻内生真菌次生代谢产物及其生物活性研究

海洋微生物拥有丰富多样的次生代谢途径，其中海洋生物内生真菌次生代谢产物研究日益受到天然产物化学界的重视。本论文以菌丝体生物量、发酵产物重量、抗菌与细胞毒活性、薄层色谱分析结果以及高效液相色谱分析结果等为评价依据对采自青岛沿海的13株海藻内生真菌在四种液体培养基上的静置发酵产物进行了综合评价，并从中选择了黑曲霉Aspergillus niger EN-13（分离自褐藻囊藻Colpomenia sinuosa）和杂色曲霉A. versicolor EN-7（分离自褐藻鼠尾藻Sargassum thunbergii）两株真菌进行了30升规模发酵（分别采用GPYM培养基和PDB培养）和化学成分的研究，对分离得到的大部分化合物进行了初步的生物活性筛选。 发酵提取物采用常规的硅胶柱层析、反相硅胶柱层析，凝胶Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析、半制备高效液相色谱以及重结晶等分离手段，得到单体化合物。利用各种现代波谱技术(IR、UV、EI-MS、FAB-MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等)并结合化学方法从两种菌株发酵提取物中鉴定了55个化合物的结构。其中从菌株A. niger EN-13分离鉴定了31个化合物，发现9个新化合物，包括2个鞘酯类化合物（AN-1~2）、3个萘并-γ-吡喃酮类化合物（AN-3~5）、3个苯乙基取代的α-吡喃酮类化合物（AN-17, AN-19~20）和1个甾体Diels-Alder加成产物（AN-21），另有1个新的天然环二肽（AN-27）被分离鉴定；从菌株A. versicolor EN-7分离鉴定了24个化合物，发现2个新化合物，为蒽醌AV-12与AV-17，另外，从前一菌株（A. niger EN-13）中鉴定的2个新鞘酯类化合物（AN-1~2）在A. versicolor EN-7中也被再次分离到。 对大部分单体化合物进行了抗菌活性、DPPH自由基清除活性和细胞毒活性测试。结果显示新化合物AN-1、AN-5和AN-20具有弱或中等强度的抑制白色念珠菌生长的活性，AN-4、AN-5、AN-21显示了弱或中等强度的抑制黑曲霉生长的活性，AV-12、AV-17显示了弱的抑制大肠杆菌生长的活性。在DPPH自由基清除活性筛选中，AN-5显示了中等强度的活性，其EC50为109.3 mM，与阳性对照BHT相近（EC50为81.8 mM）。其它部分已知化合物在抗菌和DPPH自由基清除活性的筛选中也显示了弱或中等强度的活性。在针对人肝癌细胞株SMMC-7721和人肺腺癌细胞株A549的体外细胞毒活性筛选中，所测样品均未显示显著活性。

海洋经济动物精子超低温保存的研究

从1949年以来经过近五十年的发展，超低温保存种质细胞技术已经趋于成熟，特别是在家畜推广良种化的过程中发挥重要作用。对海洋动物种质细胞保存研究的范围主要集中在鲑鳟鱼类和牡蛎等少数几种海洋生物上。本研究结合“国家自然科学基金”研究项目，进行了三种贝类和两种鱼类精子的超低温保存实验，得到了它们在液氮（－196 ℃）条件下的适宜保存条件。栉孔扇贝（Chlamys farreri）冻精解冻后复苏比例、受精率和孵化率最高可达到49.39％、42.06％和12.15睦栉孔扇贝精子超低温保存时发生冷冻伤害的温度范围在－30 ℃～－60 ℃；其低温保存的最适降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）的最适浓度为5 ℃，其保存效果优于甘油；样品保存的最佳体积为0.6ml～1ml；解冻精子的最适水温为35 ℃，50 ℃次之，20 ℃最差；用自然海水激活解冻后精子的效果好于低盐度溶液；在0 ℃进行预处理平衡时间不宜太长；在抗冻液中加入蛋黄对保存效果没有改善，并且会对冻精的孵化率有抑制作用；用20 ℃／min和5％DMSO冷冻精子，液氮中保存栉孔扇贝精子55天后其复苏比例达到42.17％。超低温保存紫贻贝（Mytilus galloprovincialis Lamarck）精子，解冻后其复苏比例、受精率和孵化率最高可达到41.63％、69.52％和54.74％。保存紫贻贝精子最适降温速率为5 ℃／min，发生冻伤的温度范围是－20 ℃～－60 ℃；使用抗冻剂DMSO的保存效果好于甘油，且使用抗冻剂DMSO的最适浓度为15％；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；样品体积（在0.2～1ml之间）对保存效果没有影响；采用15％DMSO和5 ℃／min的降温速率处理精子，液氮中保存90天后复苏比例仍达到41.8％。保存菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum （Adams and Reeve））精子的最适降温速率为5 ℃／min，发生冻伤的温度范围是－30 ℃～－60 ℃；抗冻剂DMSO的保存效果好于甘油，也用DMSO与甘油混合使用，使用抗冻剂DMSO的最适浓度为10％；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH的溶液；样品体积（在0.2％～1.6ml之间）对保存效果有显著影响。冷冻保存后精子复苏比例、受精率和孵化率最高达到40.84％、68.87％和47.17％；以最适降温速率和抗冻剂浓度处理精子，并在液氮中保存36天后冻精复苏比例仍可以达到38.54％。黑鲷（Sparus macrocephalus）精子经过超低温保存后复苏率、存活率最高可以达到61.37％和61.4。保存黑鲷精子时发生冷冻伤害的温度范围是－20 ℃～－60 ℃，适宜的降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％；样品体积对保存效果有相关性；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；使用20％DMSO和20 ℃／min降温速率处理，在液氮中保存黑鲷精子66天后解冻，其复苏率和存活率分别为59.81％和58.45％。在液氮中保存真鲷（Pagrosomus major）精子时发生冷冻伤害的温域为－30 ℃～－60 ℃，适宜的降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％；采用低盐度或高pH值的溶液激活冻精的效果不如自然海水。真鲷冻精的复苏率和存活率最高可达到50.73％和62.5；以20 ℃／min和20％DMSO处理真鲷精子，保存在液氮中46天后冻精复苏率和存活率为50.63％和61.02％。通过对多种贝类和鱼类精子的超低温保存实验，不仅获得超低温保存基本条件，并且通过显微镜观察结合前人的研究，对产生冻伤的原因和保护的机理提出了一个模式。

四种海藻热休克蛋白70（HSP70）基因的克隆与表达分析

热休克蛋白70是热休克蛋白家族中重要的成员，参与新生蛋白的折叠、转运、重折叠变性蛋白、协助降解变性蛋白和抗逆环境胁迫等功能。海带和裙带菜是浅海潮下带典型的褐藻，孔石莼和浒苔是潮间带典型的绿藻，四种大型海藻均有重要的经济价值和生态价值。随着潮汐变化固着藻类生境理化因素变化剧烈，藻类面临着严重的环境胁迫，因此研究藻类抗逆机理有着重要的意义。 本研究采用同源克隆法配合RACE-PCR，克隆了海带、孔石莼、裙带菜和浒苔HSP70基因的全序列（分别命名为LJHSP70、UPHSP70、QDHSP70和EPHSP70）。利用生物信息学方法分析了四种藻类HSP70结构特征、同源性关系和进化地位。获得的海带HSP70基因全序列长为2918 bp，5’非翻译区为248 bp，3’非翻译区为696 bp，开放阅读框为1974 bp，编码657个氨基酸，预测的分子量为72.03 kDa，等电点为4.97。获得的裙带菜HSP70基因全序列长为3243 bp，5’非翻译区为248 bp，3’非翻译区为1021 bp，开放阅读框为1974 bp，编码657个氨基酸，预测的分子量为72.03 kDa，等电点为4.96。获得的孔石莼HSP70基因全序列长为2283 bp，5’非翻译区为65 bp，3’非翻译区为247 bp，开放阅读框为1971 bp，编码656个氨基酸，预测的分子量为71.13 kDa，等电点为5.04。获得的浒苔HSP70基因全序列长为2265 bp，5’非翻译区为65 bp，3’非翻译区为217 bp，开放阅读框为1983 bp，编码660个氨基酸，预测的分子量为71.39 kDa，等电点为5.03。四种海藻HSP70氨基酸序列均含有四肽重复序列GGMP，具有三个典型的HSP70签名基序。细胞质定位的HSP70 C-末端特征基序为EEID或EEVD，并且N-端氨基酸序列保守性高于C-端。海带和裙带菜HSP70蛋白同源性为98%，孔石莼和浒苔HSP70蛋白同源性为96%，四种海藻HSP70蛋白序列与陆地植物和其他藻类HSP70蛋白序列同源性为70-80%。 利用荧光定量RT-PCR技术对不同胁迫条件处理的海带和孔石莼HSP70 mRNA的表达水平进行定量分析。不同热激温度（5-40 ℃）处理组中，30 ℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量最高是10 ℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量的3倍，而35 ℃或40 ℃处理组的海带HSP70表达量却低于25 ℃或30 ℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量。25 ℃不同热激时间（0-12 h）处理组中，海带HSP70 mRNA表达量呈先上升后下降趋势。热激1 h后海带HSP70 mRNA表达量迅速上升，热激7 h后mRNA表达量达到最大，是对照组表达量的4倍。不同盐度（0‰-45‰）胁迫处理组中，0‰或5‰盐度处理组的海带HSP70 mRNA表达量是30‰盐度处理组海带HSP70 mRNA表达量的3倍。35‰、40‰和45‰盐度处理组之间HSP70 mRNA表达量较低且无显著差异。 不同热激温度（5-40℃）处理组中，20 ℃或25 ℃处理的孔石莼HSP70 mRNA表达量较低，而5 ℃、35 ℃、或40 ℃处理组的孔石莼HSP70 mRNA的表达量是25 ℃处理组孔石莼HSP70 mRNA表达量的2倍以上。30 ℃不同热激时间（0-12 h）处理组中，孔石莼HSP70 mRNA表达量也呈先上升后下降趋势。热激5 h后孔石莼HSP70 mRNA表达量达到最大，是对照组的3.5倍。不同盐度（0‰-45‰）胁迫处理组中，0‰或5‰盐度处理组的孔石莼HSP70 mRNA表达量是30‰盐度处理组孔石莼HSP70表达量的3倍。30‰、40‰和45‰盐度处理组孔石莼HSP70 mRNA表达量较低，且无显著差异。不同紫外线照射时间（0-4.0 h）和不同干燥时间（0-4.0 h）处理组中，孔石莼HSP70 mRNA表达量都在3 h后达到最高值，之后表达量维持在较高水平。 为进一步研究藻类HSP70的生物学功能，将海带HSP70基因的开放阅读框区域克隆到表达载体pEASY-E2中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。将阳性重组子培养于含有AMP（100 U/mL）的LB培养基，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导，其表达量达到平台期，继续培养HSP70表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导海带HSP70蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。

真鲷(Pagrosomus major)胚胎冷冻保存损伤机理及冷冻精子遗传物质稳定性研究

本文对真鲷心跳期胚胎对5种常用渗透性抗冻剂（DMSO、甘油、甲醇、丙二醇、乙二醇）和3种非渗透性抗冻剂（PVP、PEG-8000、蔗糖）的耐受性进行了研究。渗透性抗冻剂分6个浓度梯度（5%；10%；15%；20%；25%；30%）和3个时间组（10min；30min；1h）。非渗透性抗冻剂中，PVP、PEG-8000分3个浓度梯度（5%、10%、15%）和2个时间组（10min、30min），蔗糖为4个浓度梯度（5%、10%、15%、20%）和2个时间组（10min、30min）。实验结果表明，在渗透性抗冻剂组中，浓度为5%的处理组的孵化率（>90%）与对照组差异均不显著，随着抗冻剂浓度增大及处理时间的延长，真鲷心跳期胚胎的孵化率显著下降（P<0.05），在最高浓度的最长处理时间中胚胎孵化率均降到了0。总体上，真鲷心跳期胚胎对五种渗透性抗冻剂的耐受性从小到大依次为：甲醇 < 甘油 < 乙二醇 < DMSO < 丙二醇。对影响胚胎孵化率的三个因素（抗冻剂、浓度、时间）进行的因素效应分析结果表明，三种因素对孵化率的影响显著（P<0.05），并且浓度效应 > 时间效应 > 抗冻剂效应。在非渗透性抗冻剂组中，蔗糖组胚胎孵化率未呈显著变化；PVP组随着浓度及时间的增大，孵化率显著下降（P<0.05）；PEG-8000组随着浓度增大孵化率显著下降（P<0.05），但在两个时间组间差异不显著。相同处理情况下PEG-8000对真鲷心跳期胚胎的毒性要小于PVP。因素效应分析比较结果表明仅时间效应不显著，且抗冻剂效应 > 浓度效应 > 时间效应。 对所用各种抗冻剂进行了渗透压测量，实验中使用的渗透性抗冻剂（5%-30%）的渗透压值在959-7980mOsm/kg之间，均高于使用海水的渗透压值（919mOsm/kg）；使用的非渗透性抗冻剂的渗透压值在316-1040mOsm/kg之间，除20%蔗糖渗透压值（1040mOsm/kg）高于海水外，其他非渗透性抗冻剂的渗透压值均要低于海水。对孵化率与相应的溶液渗透压值进行相关回归分析结果表明，渗透性抗冻剂的渗透压与孵化率呈显著的负相关（P<0.05），而非渗透性抗冻剂的渗透压与孵化率相关不显著。渗透性抗冻剂组的回归分析结果表明，二次方程的曲线拟合度最高，得到的回归方程分别为：Y10min = -2×10-8X2 10min - 6×10-5 X 10min + 1.5635 （R2 = 0.713），Y30min= 5×10-8X2 30min－0.0007 X 30min + 2.097（R2 = 0.681），Y1h = 7×10-8X2 1h－0.0008 X 1h+ 2.0397（R2= 0.725）。 在真鲷胚胎对抗冻剂耐受性实验的基础上，挑选五种抗冻剂--10%DMSO、5%甘油、10%甲醇、20%丙二醇、10%乙二醇，浸泡真鲷心跳期胚胎30min后，分别以超速（130℃/min）、快速（20℃/min）、慢速（3℃/min）的速度降温并使用低温显微镜进行观察，依次记录Toif（油球结冰）、Teif（胚胎外部结冰）、Tiif（胚胎内部结冰）等结冰点，Toif值在-9~-23℃之间；Teif值在-21~-35℃之间；Tiif值在-21~-52℃之间。结冰顺序为先油球结冰，然后胚胎外部结冰随之内部马上瞬间变黑形成内部冰晶。随着降温速度的提高，各结冰温度值显著下降。各抗冻剂之间的Teif及Tiif值不同，Toif值之间没有显著差异。对两种玻璃化冷冻方法进行模拟观察，发现胚胎冰晶形成的顺序与非玻璃化过程不同--先内部结冰然后逐渐蔓延至外部形成外部冰晶，而且模拟玻璃化的内部结冰温度Tiif值（-52.56℃）显著（P<0.05）低于使用低浓度的同种抗冻剂超速降温组的Tiif值（-40.11℃）。在快速及慢速降温组中，20%丙二醇组的Tiif要显著的低于其他组（P<0.05）；在超速降温中，甲醇组的Tiif值要显著的低于其他组（P<0.05）。在Tiif小于30℃的实验组中获得形态完整胚胎的比例平均仅有30.77%；在Tiif大于30℃的实验组中获得形态完整胚胎的平均比例高达70.37%，模拟玻璃化组达到100%。各抗冻剂之间，复温后胚胎形态完整率10%甲醇组最高（77.78%）；其次依次为10%乙二醇（66.67%）、20%丙二醇（55.56%）和10%DMSO（55.56%）；5%甘油组最低（11.11%）；推测甲醇的对胚胎的渗透效果要好于其他组。综上推测：使用丙二醇、甲醇作为抗冻剂以及玻璃化冷冻保存方法对真鲷心跳期胚胎超低温保存也许较为合适。 我们对低温保存的真鲷精子核DNA损伤进行了研究以期为下一步胚胎遗传物质稳定性研究提供参考依据。研究方法为单细胞凝胶电泳（SCGE），针对研究对象，在实验过程中对传统的碱性单细胞凝胶电泳在铺胶方法、电泳条件等进行了改进。对精子细胞进行预处理，在碱性电泳液中使核DNA双链解链变性后电泳，EB染色lOmin后，在荧光显微镜下观察，每次随机观察50个左右的核DNA。结果表明，对荧光显微镜下观察到的精子核按彗尾长度及荧光强度划分等级，出现损伤的精子核DNA的损伤程度主要为轻度损伤和中度损伤，很少见有完全损伤的真鲷精子核。经5%、10%、18%、20%、25%、30%DMSO冷冻保存后的精子彗星率分别为33.47％ ± 8.95％; 35.91％ ± 19.44％; 48.95％ ± 8.90％; 43.33％ ± 11.19％; 55.80％ ± 38.94％。鲜精彗星率为31.43 ％ ± 2.68％。对比真鲷冷冻精液与新鲜精液的精子DNA的损伤状况，表明仅用30％ DMSO冷冻精子DNA损伤状况与鲜精差异显著(P<0.05)。 综上所述，渗透性抗冻剂对胚胎的毒性与其渗透压值呈显著的负相关关系。丙二醇对真鲷心跳期胚胎毒性最小，甲醇较其他抗冻剂能更好的渗透入胚胎；玻璃化方法能显著降低Tiif值并能更好的保持超低温保存后胚胎的形态完整性，因此，使用丙二醇、甲醇作为抗冻剂以及玻璃化冷冻保存方法对真鲷心跳期胚胎超低温保存也许较为合适。常规使用的用于超低温保存真鲷精子的DMSO（浓度<15%）不会对精子核物质稳定性造成明显影响。由于胚胎较精子结构要复杂许多，对于真鲷胚胎损伤机理的研究还有大量工作可以开展。

Impacts of HAB species Heterosigma akashiwo on early development of the scallop Argopecten irradians Lamarck

The effects of Heterosigma akashiwo on the early development of Argopecten irradians Lamarck: eggs, D-shaped larvae, eye-spot larvae and juveniles, were investigated under laboratory conditions. Exposing fertilized eggs to various densities of H. akashiwo algal culture revealed that the development of the embryos to the gastrula was significantly slowed at densities of more than 1 X 10(4) cells/ml algal cells, and mostly was arrested when the embryos reached the trochophore larvae stage. At this stage, several trochophore larvae were adhered together by the algal cells, resulting in the inhibition of their swimming activity. Larvae had still not developed into D-shaped larvae after 30 h, and therefore did not finish the hatching process. The attachment and adherence of the algal cells to the larvae might be an important process in the mechanism of the impact on egg hatching success. The activity of the D-shaped larvae was significantly inhibited after 48 h exposure to H. akashiwo at a density of 15 X 10(4) cells/ml and after 96 h at 10 X 10(4) cells/ml. The survival rate of the eye-spot larvae was decreased significantly after 48 h exposure to the algal culture at densities of more than 1 X 10(4) cells/ml. However, all the juveniles could survive and their climbing and attachment activity were not affected after 1 and 5 h exposure to the algal culture at all the various algal cell densities tested from 5 to 20 X 10(4) cells/ml. The results indicated that susceptibility of embryos or larvae to the alga H. akashiwo differs depending on the developmental stage. The embryos and the eye-spot larvae of A. irradians are more sensitive stages to the toxicity of H. akashiwo. Observed effects of H. akashiwo exposure on early development of A. irradians serve to point out to the potential danger of this alga for scallop populations. The possible toxicological mechanisms of H. akashiwo on the scallop embryos and larvae are discussed. (c) 2005 Elsevier B.V All rights reserved.

2-（11H-苯[a]咔唑）乙基氯甲酸酯柱前衍生化用于氨基酸的高效液相色谱分析

利用新型荧光试剂2-（11H-苯[a]咔唑）乙基氯甲酸酯（BCEC-Cl）作为柱前衍生化试剂,在HypersilBDS C_(18)（200mm×4.6mm,5μm）反相色谱柱上,采用梯度洗脱对20种氨基酸衍生物进行了分离检测。在乙腈与Na_2B_4O_7缓冲液中,室温下BCEC-Cl与氨基酸反应5min可实现完全衍生。检测的激发和发射波长分别为λ_(ex)=279nm,λ_(em)=380nm。采用柱后质谱电喷雾离子源（ESI source）正离子模式,实现了水解牛血清白蛋白中氨基酸和油菜蜂花粉中氨基酸的定性定量检测。荧光定性检测的线性回归系数均大于0.9990,检出限为1.49~19.74fmol（S/N=3）。

青海湖地区围栏封育芨芨草种子形态及其萌发特性

以青海湖地区三角城种羊场的芨芨草(Achnatherum splendens)为观测对泉,研究围栏内外芨芨草的种子外观特征差异,及其在5,10,15,20,25,30℃时的萌发特性,以期评价围栏封育对种子形态和萌发特性的影响.结果表明,围栏内芨芨草种子无论是颗粒大小,还是饱满程度均好于围栏外;在温度低于5℃时,芨芨草种子将不萌发,随着温度的升高,发芽率不断上升,高于25℃发芽率有下降的趋势.低温或高温均不利于种子萌发,即低于20℃或超过25℃萌发均受到不同程度抑制,芨芨草种子萌发适宜温度为20～25℃.围栏内芨芨草种子的萌发状况好于围栏外.

高寒湿地太阳辐射和地表反射率变化的统计学特征

依据祁连山海北高寒湿地植物生长期观测的太阳总辐射(E_g)和反射辐射(E_r)资料, 分析了高寒湿地Eg和地表反射率(A)的日及季节变化特征. 结果表明:祁连山海北高寒湿地, 有较强的Eg, 但A较低. 年内1～12月E_g的平均日总量达17.3 MJ•m~(-2), 其中植物生长期的5～9月平均日总量为20.0MJ•m~(-2), 表现出4～7月高, 冷季低的变化特征. A的日、季节变化均表现 "U"型变化过程. 2004年1～12月A的年平均值为0.32, 植物生长季的5～9月平均值为0.18, 植物非生长季的10月～翌年4月平均值为0.43. 其中1月最高(0.70), 7月最低(0.16).

不同牦牛放牧率下江河源区垂穗披碱草／星星草混播草地第一性生产力及其动态变化

江河源区2龄和3龄混播草地（垂穗披碱草＋星星草）牦牛放牧试验结果表明：在两个放牧季内，不同处理组的地上生物量开始阶段逐渐增加。之后逐渐下降。且随放牧率的增加同一时期地上生物量减小；2003年从7月20日开始、2004年从8月5日开始至9月20日，不同放牧率下同一时期的地上生物量差异显著（P〈0．05）；各放牧处理区2003年同一时期的地上生物量均高于2004年。且牧草生长季节地上平均生物量及其年度变化之间的差异显著（P〈0．05）。此外，不同放牧率下同一时期各土壤层地下生物量及其百分比组成、相同放牧强度下不同时期各土壤层地下生物量及其百分比组成均没有明显的趋向性变化；牧草生长季节地上平均生物量与放牧强度之间呈线性回归关系。0～30cm的地下生物量（包括活根和死根）与放牧强度之间呈二次回归关系；牧草生长季节地上与地下平均生物量之间呈二次回归关系，说明轻度放牧和中度放牧能刺激牧草的生长，具有补偿或超补偿生长的特点。