Hepatische Überexpression des Interleukin-18 in transgenen Mäusen und dessen biologische und immunologische Funktion

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Interleukin-18 (IL-18) in der Leber untersucht. IL-18 wurde eine Bedeutung bei verschiedenen Lebererkrankungen zugeschrieben, die genauen Mechanismen sind jedoch nicht geklärt. IL-18 kann ein wesentlicher Faktor bei der Regulierung des Th1/Th2-Gleichgewichts in der Leber sein. Es wurden transgene Mäuse mit konstitutiver Überexpression der inaktiven Form von IL-18 (proIL-18) sowie transgene Mäuse mit Expression der aktiven Form von IL-18 ohne Signalpeptid (FLAG-IL-18) und mit Signalpeptid (SP-IL-18) in Hepatozyten unter der transkriptionellen Kontrolle des murinen Albumin-Promoters etabliert. In eigenen Vorarbeiten wurde eine konstitutive Expression von proIL-18 in Wildtyp-Hepatozyten festgestellt. Bei der Überexpression von proIL-18 in Hepatozyten zeigte sich eine Akkumulierung des Proteins in der Zelle und eine spontane entzündliche und fibrotische Aktivität in der Leber. Die Expression der aktiven Form von IL-18 ohne Signalpeptid (FLAG-IL-18) in Hepatozyten führte zu einer Speicherkrankheit in der Leber. Das Fusionieren des aktiven Teils von IL-18 mit IgG-k-Leadersequenz (SP-IL-18) ermöglichte die Sezernierung von IL-18 aus der Zelle ohne Einfluß auf die Produktion von IFN-g, TNF-a, IL-4 sowie Transaminasen. Die Rolle von IL-18 bei einem LPS-abhängigen Leberschaden mit und ohne Präkonditionierung mit CpG-Oligonukleotiden in vivo wurde untersucht. Die Behandlung proIL-18-transgener Mäuse mit LPS führte zur Sezernierung von biologisch aktivem IL-18 aus Hepatozyten. IL-18 hatte bei proIL-18- sowie bei SP-IL-18-transgenen Mäusen nach der LPS-Gabe keinen Einfluß auf die Leberschädigung und Produktion von IFN-g, TNF-a, IL-4. Nach sequenzieller Behandlung mit CpG und LPS fand sich bei SP-IL-18-transgenen Tieren im Gegensatz zu proIL-18-transgenen Mäusen eine stärkere Produktion von GOT, IFN-g und TNF-a im Vergleich zu Wildtyptieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß IL-18 alleine keine hepatotoxische Wirkung und keinen Einfluß auf die Produktion von IFN-g, TNF-a, IL-4 hat, wofür ein zusätzlicher Stimulus notwendig ist. Die in der vorliegenden Arbeit etablierten proIL-18- und SP-IL-18-transgenen Mausmodelle liefern die Grundlage zu weiteren Untersuchungen der Rolle von IL-18 in der Leber bei der Immunmodulation.

Carrier und Regulatoren des Tartrat- und C 4-Dicarboxylatstoffwechsels von Escherichia coli

In E. coli dient L-Tartrat als Elektronenakzeptor während des anaeroben Wachstums und wird schließlich zu Succinat umgesetzt. Der sekundäre Carrier TtdT (YgjE) von E. coli ist ein Antiporter, der die Aufnahme von L-Tartrat im elektroneutralen Austausch gegen intrazelluläres Succinat katalysiert. TtdT besitzt eine hohe Substratspezifität und katalysiert den Transport von L-Tartrat und Succinat, nicht aber von meso- und D-Tartrat. Das Gen ttdT (ygjE) bildet mit den Genen ttdA und ttdB, welche für die L-Tartratdehydratase kodieren, ein Operon. Das benachbarte Gen ttdR (ygiP) kodiert für TtdR (YgiP), einen Tartrat-spezifischen Regulator vom LysR-Typ. TtdR reguliert die L-Tartratfermentation direkt durch Induktion des ttdABT-Operons und durch Autoregulation. TtdR stellt damit den Tartrat-spezifischen Regulator dar, der auf die Expression des ttdR ttdABT-Genclusters spezialisiert ist. Dagegen reguliert DcuSR, das Zweikomponentensystem für C4-Dicarboxylate, die L-Tartratfermentation indirekt durch die Regulation der Gene für die Fumaratatmung. YfaV und YeaV sind weitere potentielle Tartrattransporter. YfaV katalysiert vermutlich den Transport von C4-Dicarboxylaten, einschließlich Tartrat, unter aeroben und anaeroben Bedingungen. YeaV wird nur in Anwesenheit von L- und meso-Tartrat und unter aeroben Bedingungen gebildet. Die yeaUVWX-Gene unterliegen der trankriptionellen Regulation durch YeaT, dessen Gen yeaT vor yeaU liegt. YeaT ist wie TtdR ein Tartrat-spezifischer Regulator und besitzt eine signifikante Ähnlichkeit zu TtdR.

Überexpression und Charakterisierung des extrazellulären Teils der humanen alpha-Sekretase ADAM10

„ÜBEREXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DES EXTRAZELLULÄREN TEILS DER HUMANEN alpha-SEKRETASE ADAM10“ ALEXANDRA LEPTICH Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei enzymatisch aktive lösliche Proteinvarianten der humanen alpha-Sekretase ADAM10 in Insektenzellen exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Dabei entsprach eine der löslichen ADAM10-Varianten dem extrazellulären Bereich des Typ-I-Membranproteins, d.h. ihr fehlte die Transmembran- und cytoplasmatische Domäne. Die zweite Variante stimmt mit einer im menschlichen Gehirn auf mRNA-Ebene nachgewiesenen Splicevariante überein, die zusätzlich noch durch das Fehlen der Cystein-reichen Domäne gekennzeichnet ist. Die alpha-Sekretase ADAM10 spielt eine wichtige Rolle bei der nicht-amyloidogenen Prozessierung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP). Dabei erfolgt dessen Spaltung innerhalb der beta-Amyloidsequenz, so dass die Produktion von Abeta-Peptiden und damit die Bildung von Amyloid-Plaques während der Alzheimer’schen Erkrankung verhindert wird. Nach der Expression der beiden löslichen ADAM10-Proteine in Insektenzellen erfolgte die Reinigung der prozessierten und damit reifen Enzymform der jeweiligen ADAM10-Proteinvariante mittels Lektin-Affinitätschromatographie. Die anschließende Charakterisierung der beiden löslichen ADAM10-Proteine erfolgte durch einen auf HPLC-Analyse basierenden Enzymtest. Dabei wurden verschiedene sich von der beta-Amyloid-Sequenz ableitenden Peptidsubstrate in vitro eingesetzt, die zum einen den Aminosäuren 11-28 der Abeta-Sequenz, zum anderen dem kompletten Abeta40-Peptid entsprachen und damit die charakteristische alpha-Sekretasespaltstelle des Amyloid-Vorläufer-Proteins enthielten. Des Weiteren kamen jeweils entsprechende Peptidsubstrate zum Einsatz, die an den Positionen 21 und 22 der Abeta- Peptidsequenz vorkommenden Mutationen trugen. Die gewählten Abeta-Substrate konnten durch die löslichen Varianten der alpha-Sekretase ADAM10 an der alpha-Sekretasestelle gespalten werden. Dabei konnte bei den Abeta11-28-Peptiden deutlich die in der Literatur beschriebene Abhängigkeit der Spaltung von der a-helicalen Struktur des Substrats beobachtet werden, während bei den längeren Abeta40-Peptide diesbezüglich kein Zusammenhang hergestellt werden konnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ADAM10 hauptsächlich als alpha-Sekretase wirkt, weniger als ein Abeta-degradierendes Enzym. Ferner konnte unter Verwendung entsprechender muriner und humaner Abeta-Peptide eine verstärkte Spaltung der murinen Substrate Abeta1-28 und Abeta1-40 durch den extrazellulären Teil von ADAM10 in vitro gezeigt werden. Dieser Versuch bestätigt die Annahme, dass es bei Nagetieren durch die Bevorzugung der nichtamyloidogenen Prozessierung von APP durch die alpha-Sekretase ADAM10 zu keiner Bildung von Amyloid-Plaques kommt. Ein Einfluss auf die Spaltung von membrangebundenem APP und damit der Bildung von neuroprotektivem sAPPalpha durch die löslichen ADAM10-Proteine konnte im Zellsystem nicht beobachtet werden. Vielmehr scheint hier die Membranverankerung von Enzym und Substrat eine wichtige Voraussetzung zu bilden. Des Weiteren konnten die löslichen ADAM10-Proteine durch ein für die Inhibierung von ADAM10 spezifische Hydroxamat-Derivat in ihrer enzymatischen Aktivität gehemmt werden. Die exprimierten ADAM10-Proteine weisen die charakteristischen Eigenschaften der alpha-Sekretase ADAM10 auf, wobei deutlich wurde, dass das Fehlen der Cystein-reichen Domäne keinen Einfluss auf die Fähigkeit der katalytischen Domäne zur Substrat- und Inhibitorbindung hatte. Auch die Stabilität des Enzyms wurde durch das Fehlen der Domäne nicht negativ beeinträchtigt. Eine wichtige Aufgabe stellt nun der Nachweis der löslichen ADAM10-Proteine sowie die Identifizierung ihrer potentiellen Substrate und deren Lokalisation in vivo dar.

Analyse der Transportfunktion und Proteinexpression des kationischen Aminosäure-Transporters hCAT-3 und des verwandten Proteins SLC7A4

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung des humanen kationischen Aminosäure-Transporters 3 (hCAT-3) und mit der Generierung spezifischer Antikörper gegen hCAT-3, mCAT-3 und das verwandte Protein SLC7A4. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass hCAT-3 glykosyliert und in der Plasmamembran lokalisiert ist. Transportstudien an hCAT-3-exprimierenden Xenopus laevis Oozyten demonstrierten einen selektiven Transport von kationischen L-Aminosäuren. Die Transporteigenschaften von hCAT-3 (KM, Vmax, Trans-Stimulation) ähnelten den der Isoform hCAT-2B am meisten. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu Untersuchungen an CAT-3 von Maus und Ratte, in denen nur eine geringe CAT-Aktivität gezeigt wurde, die zudem durch neutrale und anionische Aminosäuren und durch D-Arginin hemmbar war. Die höchste Expression von hCAT-3 wurde im Thymus gefunden, was bedeutet, dass er nicht auf neuronale Zellen beschränkt ist. Dieser Befund steht im Gegensatz zur ausschließlich neuronalen Expression von rCAT-3 bzw. mCAT-3. Ein Schwerpunkt der Arbeit lag in der Generierung spezifischer Antikörper gegen die C-Termini des humanen und murinen CAT-3 und des verwandten Proteins SLC7A4. Dafür wurden Antiseren gegen Fusionsproteine zwischen dem bakteriellen trpE-Protein und den C-Termini der jeweiligen Isoform gewonnen. Zur Aufreinigung der Antikörpern wurden Affinitätssäulen mit Fusionsprotein aus Glutathion S-Transferase und den jeweils gleichen carboxyterminalen Aminosäuren von hCAT-3, SLC7A4 und mCAT-3 hergestellt. Zur Überprüfung der Spezifität der Affinitäts-aufgereinigten Antikörper wurden Western-Blot-Analysen mit Lysaten von X. laevis-Oozyten durchgeführt, die mit cRNA der jeweiligen Isoform injiziert worden waren. Weiterhin wurden humane U373MG Glioblastom-Zellen, in denen die jeweilige Isoform überexprimiert worden war, zur Überprüfung der Antikörper verwendet. Es konnte nachgewiesen werden, dass die neu gewonnenen Antikörper das jeweilige glykosylierte und deglykosylierte CAT-Protein spezifisch erkannten. Die hCAT-3 Antikörper wurden dazu verwendet die endogene Expression in NT2-Teratokarzinom-Zellen nachzuweisen. Hierbei zeigte sich, dass die intrazelluläre Expression höher war als an der Zelloberfläche. Nur etwa 10-20% des hCAT-3-Gesamtproteins wurden an der Zelloberfläche exprimiert. Die gleiche subzelluläre Verteilung zeigte sich in mit hCAT-3.EGFP stabil transfizierten U373MG-Zellen. Um die Auswirkung einer PKC-Aktivierung auf die Aktivität und Expression von hCAT-3 untersuchen zu können, wurden Transportexperimente an Oozyten und Western-Blot Analysen mit biotinylierten Zelloberflächen-Proteinen durchgeführt. Der PKC-Aktivator PMA reduzierte die hCAT-3 Expression um ca. 35% reduziert. Sowohl in X. laevis Oozyten, als auch in U373MG-Zellen war die Verminderung der Transportaktivität von einer Reduktion der Zelloberflächen-Expression von hCAT-3 begleitet. Die Vorbehandlung mit dem PKC-Inhibitor Bisindolylmaleimid I (BIM I) reduzierte beide PMA-Effekt. Es ist daher davon auszugehen, dass die Reduktion der Zelloberflächen-Expression durch PKC vermittelt wurde. Ähnlich wie hCAT-1 scheint auch hCAT-3 durch eine klassische PKC, am wahrscheinlichsten PKC? und PKC?, herunterreguliert zu werden. Durch konfokale Mikroskopie von überexprimierten hCAT-3.GFP-Konstrukten in U373MG-Zellen konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Ähnliche Ergebnisse wurden auch unter Verwendung der selbst hergestellten Antikörper gegen den endogenen hCAT-3 in NT2 Teratokarzinom-Zellen erzielt.

Regulation und Funktion von hunchback in Neuroblasten-Zellstammbäumen von Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster wird das Nervensystem von neuralen Vorläuferzellen, den Neuroblasten (NB) gebildet. Diese teilen sich im Stammzellmodus und bringen bei jeder Teilung eine Ganglienmutterzelle (GMZ) hervor. GMZ teilen sich einmal und generieren zwei Zellen, die ein neuronales und/oder gliales Schicksal annehmen. Die Reihenfolge in der ein NB GMZ generiert, ist vermutlich ein zellautonomer Prozess, der an die transiente und sequenzielle Expression der Transkriptionsfaktoren Hunchback (Hb), Krüppel (Kr), Pdm, Castor (Cas) und Grainy head (Grh) gekoppelt ist. Hb ist der erste Faktor dieser Genkaskade. Damit der NB zur nächsten zeitlichen Identität übergehen kann, die in der Regel von Kr bestimmt wird, muss die Hb-Expression im NB beendet werden. Das Abschalten wird transkriptionell reguliert und ist von einer vorhergehenden Mitose abhängig. Im Gegensatz zum NB wird in der GMZ, die bei dieser Teilung entsteht, die Hb-Expression beibehalten. In der vorliegenden Arbeit wurde der Mitose-abhängige Mechanismus aufgeklärt, durch den eine selektive Abschaltung von hb im NB erfolgt, nicht aber in der GMZ. Der Transkriptionsfaktor Seven-up (Svp) beendet die hb-Expression im NB. svp wird vor der entscheidenden Zellteilung im NB transkribiert, aber kaum translatiert. Nach erfolgter Zellteilung wird Svp verstärkt translatiert und sowohl im NB als auch in der neu entstandenen GMZ exprimiert. Im NB führt die Svp-Funktion zur Abschaltung von Hb. In der ebenfalls Svp-positiven GMZ verhindert jedoch Prospero (Pros), das während der Teilung in diese Zelle segregiert ist, die Aktivität von Svp. Um zu überprüfen, ob Svp und Pros die Transkription von Hb entweder direkt oder indirekt regulieren, wurde eine Enhancerfragment-Analyse durchgeführt. Durch diese Unter-suchungen sollten relevante regulatorische Bereiche des hb-Gens identifiziert werden. Zusätzlich zu den bereits bekannten Regionen im 5´-Bereich von hb, konnten 3´ des transkribierten Bereiches weitere nervensystemspezifische Enhancerelemente gefunden werden. Neben der Spezifizierung von früh geborenen Nachkommen von NB hat Hb im Nervensystem die Funktion, den multipotenten Zustand junger NB aufrecht zu erhalten. Um den Beitrag einzelner Domänen des Hb-Proteins an diesen Aufgaben zu bestimmen, wurden verschiedene hb-Varianten, in denen spezifische Domänen deletiert bzw. mutiert waren, im NB7-1 überexprimiert und auf die Induktion von „frühem“ Schicksal getestet. In einem zweiten Ansatz wurden mutante hb-Allele analysiert. Es stellte sich heraus, dass der D-Box eine entscheidende Rolle bei der Spezifizierung von „frühem“ Schicksal zukommt. Die terminalen Zinkfinger sind vermutlich in die Aufrechterhaltung der Kompetenz von NB involviert. Eine Deletion der A-Box erhöht möglicherweise die Aktivität des Hb-Proteins.

Untersuchungen zur Funktion und Regulation der Rezeptor-Tyrosin-Phosphatase RPTPlambda bei der Entwicklung des Mittel- und Hinterhirns

Der isthmische Organisator liegt an der Grenze zwischen dem sich entwickelnden Mittel- und Hinterhirn und kontrolliert Wachstum und Musterbildung dieser beiden Hirnregionen. In der vorliegenden Arbeit wird die räumliche und zeitliche Expression der Rezeptor-ähnlichen Protein Tyrosin Phosphatase lambda aus dem Huhn (cRPTPλ, auch als cRPTPψ bekannt) während der Entwicklung dieser Struktur beschrieben. Nach einer anfänglich weitläufigen Expression im kaudalen Vorderhirn und in der Mittelhirnregion, beschränkt sich die Expression von cRPTPλ zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 auf die ventrale Mittellinie des Neuralrohrs, den Bereich der späteren neuralen Retina und Linse und auf einen schmalen Ring anterior der isthmischen Einschnürung, welcher der molekularen Mittel- / Hinterhirngrenze (MHO) entspricht. Ab dem embryonalen Tag E3.5 wird RPTPλ dann auch im gesamten Mittelhirn gebildet. Um Hinweise auf die Funktion von cRPTPλ zu bekommen, wurde die Regulation dieses Moleküls untersucht. Die Expression von cRPTPλ am MHO wird von dem Fibroblasten Wachstumsfaktor Fgf8 und dem Transkriptionsfaktor Lmx1b, nicht aber von dem sezernierten Glykoprotein Wnt1 induziert. Der Transkriptionsfaktor En-1 unterdrückt die Expression von cRPTPλ am MHO. cRPTPλ-Expression im Mittelhirn wird negativ durch das sezernierte Protein Sonic Hedgehog reguliert, während Lmx1b und En-1 dort keinen Einfluss auf das Expressionsmuster von cRPTPλ haben. Fgf8 und Wnt1 sind maßgeblich an der Regulation von Wachstum und Musterbildung des embryonalen Mittelhirns beteiligt. Funktionelle Studien zu RPTPλ deuten darauf hin, dass dieses Protein als negativer Rückkopplungsmechanismus beider Signalwege wirken kann. RNAi- und Überexpressionsstudien am MHO lieferten Hinweise darauf, dass RPTPλ der Induktion der Wnt1-Expression durch Fgf8 entgegenwirkt. Dies scheint durch Interaktion noch unbekannter Faktoren mit der Juxtamembrandomäne von RPTPλ vermittelt zu werden. Auf das Expressionsmuster von Fgf8 selbst, oder einer Reihe anderer Faktoren, die ebenfalls von Fgf8 reguliert werden, hat RPTPλ allerdings keinen Einfluss. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine „künstliche“ Aufrechterhaltung der Expression von cRPTPλ im Mittelhirn zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 zu einem stark verkleinerten Mesenzephalon führt. RPTPλ bindet in vivo an β-Catenin, ein zentrales Protein des kanonischen Wnt-Signalweges, und moduliert dadurch vermutlich das Wnt-Signal, welches seinerseits Proliferation im Mesenzephalon fördert. Durch diesen Mechanismus könnte cRPTPλ als „Bremse“ des kanonischen Wnt-Signalweges im Mittelhirn wirken.

Identifizierung und Charakterisierung glialer Gene im embryonalen zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster

Im embryonalen Nervensystem von Drosophila wird gliales Schicksal durch den Transkriptionsfaktor gcm induziert. Es konnte gezeigt werden, daß die ektopische Expression von gcm im Nervensystem einen Überschuß an Gliazellen generiert, während Funktionsverlustmutanten von gcm nahezu keine Gliazellen mehr besitzen. Im Gegensatz zu der beschriebenen Funktion von gcm als binäres Schaltergen zwischen neuronalem und glialem Schicksal, gibt es nur wenig Hinweise auf Mechanismen zur weiteren Spezifizierung und Differenzierung der verschiedenen glialen Subtypen und den daran beteiligten Genen. Die vorliegende Arbeit beschreibt die auf Microarray-Experimenten basierende Genom-weite Suche nach neuen gcm-abhängigen glialen Genen. Diese Analyse vergleicht die ektopische Expression von gcm im gesamten Nervensystem und zum ersten Mal die gcm Funktionsverlustmutante mit dem Wildtyp. Beide Ansätze wurden als Zeitverlaufsexperimente durchgeführt, die den Zeitraum der Gliogenese in Drosophila umfassen. Im Vorfeld durchgeführte Kontrollexperimente ermöglichten die Bestimmung des methodischen und genetischen Hintergrundrauschens, die eine Reduktion von "falsch positiven" Genen ermöglichte und die Sensitivität der Microarray-Auswertung erhöhte. Durch manuelle Filterschritte wurde der Schwerpunkt der Daten-Interpretation eher auf biologische Aspekte als auf eine rein statistische Auswertung gelegt und dies brachte deutlich Vorteile in der Auswahl der potentiellen Zielgene. Insbesondere die Analyse der temporalen Expressionsprofile, der Vergleich der antagonistischen Ansätze sowie eine ausführliche Recherche der vorhandenen Datenbanken im Hinblick auf bekannte Expression und Funktion der differentiell regulierten Gene, ermöglichten die Identifizierung von etwa 400 potentiellen Zielgenen. Für mehr als 30% dieser Gene konnte Expression in den gcm-abhängigen Gliazellen, hämatopoetischen Zellen oder den "tendon cells" nachgewiesen werden. Hierunter befinden sich mehr als 50 Gene, deren Abhängigkeit von gcm bisher nicht bekannt war. Eine zelluläre Analyse ausgewählter Kandidatengene auf Einzelzellebene, ihre Abhängigkeit von gcm sowie eine regulatorische Analyse in verschiedenen mutanten Hintergründen bekannter glialer Gene, geben Einblick in die verschiedenen Mechanismen glialer Regulation. An einigen Beispielen wird eine mögliche Funktion der aus dieser Analyse hervorgegangen Gene in den bekannten Kontext glialer Differenzierung und Funktion für Drosophila diskutiert.

Charakterisierung der Apolipoprotein J-Genregulation in Fibroblasten und glatten Gefäßmuskelzellen durch nekrotische Zellen und Toll-like Rezeptoren

Apolipoprotein J (ApoJ) ist ein sezerniertes heterodimeres 80kDa Glykoprotein mit zytoprotektiven und antiinflammatorischen Eigenschaften, das ein nahezu ubiquitäres Expressionsmuster aufweist. Eine stark erhöhte ApoJ-Expression ist mit neurodegenerativen Erkrankungen, Atherosklerose, myokardialem Infarkt sowie einer Vielzahl anderer pathophysiologischer Bedingungen assoziiert. Die potentielle Bedeutung von ApoJ umfasst eine Funktion als extrazelluläres Chaperon, Komplementinhibitor, NF-kB-Inhibitor sowie eine Beteiligung an der Endozytose von nekrotischen Zellfragmenten. Unter Bedingungen, die zu einer massiven Akkumulation von absterbenden Zellen führen, ist eine vermehrte Expression von ApoJ auf die überlebenden Nachbarzellen in den betroffenen Geweben beschränkt. Die molekularen Mechanismen, die dieser gesteigerten ApoJ-Genexpression zugrunde liegen, sind jedoch unbekannt. Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass eine Inkubation mit nekrotischem Zellmaterial in vitro eine Akkumulation von ApoJ-mRNA in Fibroblasten der Zelllinie Rat1 induziert, was darauf hindeutet, dass unter pathophysiologischen Bedingungen von nekrotischen Zellen exponierte bzw. freigesetzte Faktoren zu einer gesteigerten ApoJ-Genexpression in umliegenden vitalen Zellen beitragen können. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigen eine Korrelation zwischen der Expression von Toll-like Rezeptoren (TLRs) in Fibroblasten (Rat1), glatten Gefäßmuskelzellen (CRL2018) sowie embryonalen Dottersackzellen (10A) und einer durch nekrotische Zellen induzierten ApoJ-mRNA-Expression in diesen Zelllinien. Es wird angenommen, dass TLRs neben pathogenassoziierten Strukturen (PAMPs) auch durch körpereigene Agonisten wie Hitzeschockproteine und Nukleinsäuren aktiviert werden. In weiterführenden Experimenten stellte sich unter anderem heraus, dass neben nekrotischen Zellen auch der TLR3-spezifische Agonist Poly(I:C), eine synthetische doppelsträngige RNA, ausschließlich in den beiden TLR3-exprimierenden Zelllinien CRL2018 und Rat1, nicht jedoch in TLR3-defizienten 10A-Zellen, die ApoJ-mRNA-Expression induziert. Darüber hinaus führt auch die Inkubation mit eukaryotischer RNA (Gesamt-RNA, t-RNA) zu einer Akkumulation von ApoJ-mRNA in CRL2018-Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals, dass die Expression von ApoJ-mRNA durch extrazelluläre Ribonukleinsäuren in TLR3-abhängiger Weise induziert wird, was darauf hindeutet, dass in verletzten Geweben aus post-apoptotischen oder nekrotischen Zellen freigesetzte Ribonukleinsäuren zu einer vermehrten ApoJ-Genexpression in vitalen Nachbarzellen beitragen.

In vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Immunantwort und Parasitenentwicklung bei Infektionen mit dem Darmparasiten Cryptosporidium parvum

Cryptosporidium parvum ist ein intrazellulärer protozoischer Darmparasit (Apikomplexa), der weltweit zu den bedeutendsten Erregern von Diarrhöen beim Menschen und einer Reihe von Nutztieren zählt. Vor allem immunkompromittierte Personen wie zum Beispiel AIDS-Patienten erleiden schwere, chronische bis lebensbedrohende Erkrankungen. Da nach wie vor keine effektive Therapie gegen eine Kryptosporidiose in Form eines spezifisch wirkenden Chemotherapeutikums oder einer Vakzine existiert, ist es notwendig, die Immunantwort des Wirtes gegen den Parasiten und dessen Bindung, Invasion und die intrazelluläre Entwicklung in den Epithelzellen eingehend zu studieren, um neue Ansatzpunkte zu entwickeln. Wohingegen Menschen zeitlebens suszeptibel für eine Infektion mit C. parvum sind, entwickeln Mäuse eine natürliche Resistenz und können als adulte Tiere nicht mehr infiziert werden. Daher sind Mausmodelle der Kryptosporidiose auf neonatale oder immunsupprimierte und immundefiziente adulte Mäuse beschränkt. Bei der Überwindung einer C. parvum-Infektion sind Effektoren der natürlichen und adaptiven Immunität beteiligt. Die zentrale Rolle spielen CD4+-T-Zellen, sowie Interferon-gamma und Interleukin-12. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Infektionen in IFN-gamma (GKO)- und IL-12 p40 (IL12KO)-Knockout-Mäusen (C57BL/6) etabliert, für die bereits gezeigt wurde, dass sie eine Suszeptibilität gegenüber einer Erstinfektion besitzen. Erstmals wurden die beiden Infektionsmodelle parallel unter denselben Bedingungen analysiert, um Rückschlüsse auf die Funktion und die Bedeutung der beiden Th1-Zytokine IFN-gamma und IL-12 bei der Auseinandersetzung mit dem Parasiten und der Überwindung einer Infektion ziehen zu können. Es wurden deutliche Unterschiede im Infektionsverlauf, bei der Höhe und Dauer der Parasitenausscheidung und der induzierten systemischen und mukosalen Antikörperantwort beobachtet. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass neben IL12KO auch GKO in der Lage sind, eine erste Infektion zu überwinden und eine Resistenz gegenüber einer erneuten Konfrontation mit dem Parasiten zu entwickeln. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Etablierung einer protektiven Immunität gegen eine Kryptosporidiose generell unabhängig von der Anwesenheit der Zytokine IFN-gamma und IL-12 ist, der Verlust von IFN-gamma jedoch schwerer wiegt. Bei GKO-Mäusen persistierte der Parasit in Form einer niedriggradigen chronischen Infektion. Die beiden Infektionsmodelle stellten sich als ideales System für die Etablierung einer effektiven Immunisierungsstrategie heraus. Intranasale Immunisierungen, welche neben einer systemischen auch eine mukosale Immunantwort induzieren können, schienen einen richtigen Ansatz darzustellen. Intraperitoneale und subkutane Immunisierungen führten zwar zur Ausbildung einer starken spezifischen IgG-Antwort im Serum, diese war jedoch nicht in der Lage, einen Schutz vor einer Infektion zu vermitteln. Neben den in vivo Untersuchungen wurde des Weiteren auch die intrazelluläre Entwicklung von C. parvum in einem in vitro Kultursystem verfolgt. Zum ersten Mal wurde die Genexpression von vier Oberflächenproteinen der invasiven Zoitenstadien und eines Oozystenwandproteins parallel durch RT-PCR analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Gene während der intrazellulären Entwicklung differentiell exprimiert werden, was eine unterschiedliche Funktion der Proteine während des Entwicklungszyklus nahe legt. Das Expressionsmuster der verschiedenen Gene charakterisiert bestimmte Abschnitte innerhalb des Entwicklungszyklus. Dabei wurden Marker für die Invasion (CP17) sowie für die asexuelle (GP900) und sexuelle Replikation (COWP) identifiziert.

Entstehung und Dynamik des Keratinfilament-Netzwerks

Das zytoplasmatische Zytoskelett besteht aus drei Filamentsystemen, die aus Aktin, Tubulin und Intermediärfilamentproteinen aufgebaut sind und dreidimensionale Netzwerke ausbilden. Das Intermediärfilamentsystem, dem vor allem mechanische Stabilisierungsfunktionen zugesprochen werden, unterscheidet sich von den anderen durch seine Fähigkeit, spontan aus seinen Polypeptiduntereinheiten ohne weitere Kofaktoren zu polymerisieren und durch seinen unpolaren Aufbau. Es ist bis heute unbekannt, wie Intermediärfilamentnetzwerke in vivo moduliert werden und wie ihre Anordnung in den Kontext des Gesamtzytoskeletts koordiniert wird. Am Beispiel der epithelialen Intermediärfilamentproteine, den Keratinen, sollte daher untersucht werden, wie und wo neue Intermediärfilamente entstehen, welche Bedeutung den anderen Filamentsystemen bei dem Netzwerkaufbau und –Turn-Over zukommen und wie die Netzwerkbildung gesteuert wird. Zur Beantwortung dieser Fragestellungen wurden Zellklone hergestellt, die fluoreszierende Keratine synthetisieren. In der Zelllinie SK8/18-2, deren gesamtes Netzwerk aus derartigen Chimären aufgebaut ist, konnten anhand von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen der Fluoreszenzmuster Keratinfilamentvorläufer (KFP) identifiziert und deren Dynamik direkt in lebenden Zellen verfolgt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die KFP in einem Plasmamembran-nahen Bereich entstehen, in dem sie zuerst als punktförmige Partikel detektiert werden. Nach einer initialen, sphäroidalen Wachstumsphase elongieren die Partikel zu kleinen Filamentstückchen. Diese können miteinander fusionieren und werden über ihre Enden in das periphere Netzwerk integriert. Der Wachstumsprozess ist gekoppelt an eine kontinuierliche, langsame Bewegung in Richtung auf das Zellzentrum. Diese Motilität sistiert vollständig nach pharmakologisch induziertem Abbau der Aktinfilamente. In Zeitraffer-aufnahmen kann jedoch in derartig behandelten Zellen ein wesentlich schnellerer Transport, der in verschiedene Richtungen verläuft und durch lange Ruhephasen unterbrochen wird, beobachtet werden. Dieser Modus, der gelegentlich auch in unbehandelten Zellen gefunden wurde, ist abhängig von intakten Mikrotubuli. Erst durch Zerstörung der Aktinfilamente und der Mikrotubuli erlischt die Motilität der KFPs vollständig. Bei der Suche nach Regulatoren der Keratinnetzwerkbildung wurde die p38 MAPK als zentraler Faktor identifiziert. Erstmals konnte eine direkte räumliche und zeitliche Korrelation zwischen einer spezifischen Enzymaktivität durch Nachweis der phosphorylierten p38 MAPK, der daraus folgenden Phosphorylierung eines Keratins, hier Serin 73 des Keratin 8, und der daraus resultierenden Veränderung des Netzwerkaufbaus, d. h. der Ausbildung von Keratingranula, nachgewiesen werden. Diese koordinierten Veränderungen wurden in unterschiedlichen Stresssituationen in verschiedenen Zellsystemen und in Zellen mit mutierten Keratinen beobachtet. Genetische (shRNA) und pharmakologische Manipulationen der p38 MAPK-Aktivität deuten auf einen engen kausalen Zusammenhang hin.

Einfluss immunevasiver Strategien des humanen Cytomegalovirus auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der viralen Antigene pp65 und IE1

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) stellt eine große Bedrohung für Patienten mit geschwächtem oder unausgereiftem Immunsystem dar. Bei immunkompetenten Personen hingegen werden schwere Erkrankungen insbesondere durch die Wirkung antiviraler zytotoxischer CD8+-T-Lymphozyten (CTL) weitgehend verhindert. Aus Zellkultur-Systemen war bekannt, dass virale Glykoproteine, welche in der US2-US11-Region des HCMV-Genoms kodiert werden, inhibitorisch in den MHC-Klasse-I-Präsentationsweg eingreifen und somit die entsprechende Präsentation durch infizierte Zellen behindern. Über die Bedeutung dieser US2-US11-vermittelten Immunevasion für die Präsentation viraler Antigene im Kontext der Virusinfektion war jedoch nichts bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher der Einfluss der Immunevasion auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der beiden wichtigsten CTL-Zielstrukturen von HCMV, dem Tegumentprotein pp65 und dem regulatorischen immediate early Protein IE1, untersucht werden. In Ergänzung dazu sollte das immunevasive Potential eines durch HCMV kodierten Homologs des immunmodulatorischen Zytokins Interleukin-10 (cmvIL-10) analysiert werden. Hierzu wurden über Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener Mäuse CTL-Klone hergestellt, welche ausgesuchte Peptide aus pp65 und IE1 in Assoziation mit HLA-A2 mit hoher Spezifität und Sensitivität erkannten. Auf diese Weise konnte eine direkte Beeinflussung der MHC-Klasse-I-Präsentation durch cmvIL-10 falsifiziert und somit der Hypothese, dass das von infizierten Zellen freigesetzte Zytokin die MHC-Klasse-I-Präsentation nicht infizierter Nachbarzellen beeinflussen könnte, widersprochen werden. Mit Hilfe einer US2-US11-Deletionsmutante des Virus konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Präsentation von sowohl pp65 als auch IE1 durch die Immunevasion beeinträchtigt wird. Dabei war die Präsentation des IE1-Peptids zu jedem untersuchten Zeitpunkt nach Infektion vollständig unterdrückt. Die Präsentation des pp65-Peptids hingegen war noch bis zu 72 Stunden nach Infektion detektierbar. Diese anhaltende Präsentation wurde dabei durch MHC-Klasse-I-Komplexe hervorgerufen, die trotz der Expression der US2-US11-Region an die Zelloberfläche transportiert wurden. Anhand des pp65 konnte somit erstmals gezeigt werden, dass die Immunevasion von HCMV Bildung und Transport bestimmter MHC-Klasse-I-Peptid-Komplexe zwar beeinträchtigen, jedoch nicht vollständig blockieren kann. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Präsentation von IE1-Peptiden durch das Vorhandensein des pp65-Proteins nicht beeinflusst wurde. Damit konnten aus der Literatur bekannte Daten anderer widerlegt werden. Mit Hilfe einer weiteren Virusmutante konnte schließlich gezeigt werden, das die Expression eines der Immunevasine, des gpUS11, hinreichend ist, die IE1-Präsentation vollständig zu unterdrücken, jedoch keinerlei messbaren Einfluss auf die Präsentation von pp65 ausübt. Die vorliegende Arbeit hat wichtige Erkenntnisse erbracht, die die Grundlage für weiterführende Untersuchungen zur Aufklärung der Bedeutung der einzelnen Immunevasionsgene für die Präsentation viraler Antigene im Rahmen der Virusinfektion darstellen.

Die kutane murine Mastzelle als Initiator angeborener und adaptiver Immunreaktionen der Haut

Für lange Zeit wurde die Mastzelle nur als Effektorzelle im Rahmen von Erkrankungen des atopischen Formenkreises gesehen. Erst lange Zeit nach ihrer ersten Beschreibung konnte gezeigt werden, dass die Mastzelle einen wichtigen Beitrag zur Abwehr von Pathogenen leistet. Dies wird vor allem durch Wege der alternativen Mastzellaktivierung, z.B. über Toll- like Rezeptoren, ermöglicht. In dieser Arbeit sollte daher zunächst die mögliche Funktion der Mastzelle bei der durch den synthetischen TLR7- Liganden Imiquimod induzierten Entzündungsreaktion der Haut und der Auswanderung von Langerhans Zellen in einem Mausmodell untersucht werden. Beide Reaktion waren dabei von Mastzellen abhängig sind. Für die frühe und schnelle Induktion der Entzündungsreaktion zeigten sich vor allem die Mastzellcytokine IL-1 und TNF-α verantwortlich. Bei der Auswanderung der Langerhans Zellen hingegen spielt das Mastzell-IL1 eine entscheidende Rolle. Imiquimod wurde in Form der Creme Aldara bereits erfolgreich zur transkutanen Immunisierung (TCI) in Mausversuchen verwendet. Da die oben beschriebenen Reaktionen, welche durch Imiquimod vermittelt werden, eine deutliche Abhängigkeit von Mastzellen zeigten, sollte nun auch die Funktion der Mastzelle bei der Entstehung einer adaptiven Immunantwort am Modell der transkutanen Immunisierung untersucht werden. Der Immunisierungserfolg und damit die Entstehung einer adaptiven Immunantwort konnte auch hier auf die Anwesenheit von Mastzellen zurückgeführt werden. Mastzellen können somit als ein weiteres wichtiges Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität gesehen werden und können so einen entscheidenden Einfluß auf die Entstehung einer adaptiven Immunantwort nehmen.

Funktion des Rezeptors der sekretorischen Phospholipasen A 2 bei der Signaltransduktion in glomerulären Mesangiumzellen und entzündlichen Erkrankungen der Niere

Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind Enzyme, welche die Hydrolyse der Esterbindung an der sn-2-Position von Phospholipiden katalysieren, wodurch freie Fettsäuren, welche als Vorläufermolekül von Eicosanoiden dienen, freiwerden. Außerdem wurde gezeigt, dass sPLA2s auch unabhängig von ihrer katalytischen Aktivität durch die Bindung an einen spezifischen sPLA2-M-Typ-Rezeptor (MTR) intrazelluläre Signalwege, wie z.B. die Induktion von proinflammatorischen Genen, aktivieren können. Deshalb wurden in dieser Arbeit weiterführende Studien zur Aufklärung der Lokalisation und der Signaltransduktion der sPLA2s sowie die Bedeutung des MTR durchgeführt. Als Zellmodell für in-vitro-Studien wurden glomeruläre Mesangiumzellen verwendet, da diese Zellen eine zentrale Rolle bei entzündlichen Nierenerkrankungen, wie z.B. der Glomerulonephritis spielen. Durch Isolierung von Mesangiumzellen aus MTR-knockout-Mäusen (C57BL/6) sollten potentielle Unterschiede in der MTR-vermittelten Signaltransduktion im Vergleich zu Mesangiumzellen isoliert aus (C57BL/6) Wildtyp-Mäusen herausgearbeitet werden. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass verschiedene sPLA2-Enzyme in Maus-Mesangiumzellen exprimiert werden und diese an der konstitutiven Biosynthese von Prostaglandinen beteiligt sind. Der spezifische M-Typ-Rezeptor wird in diesen Zellen im Gegensatz zu Ratten-Mesangiumzellen weder unter physiologischen noch unter proinflammatorischen Bedingungen exprimiert und spielt daher vermutlich keine Rolle bei der Signaltransduktion durch sPLA2s.

Untersuchungen zur mikrobiellen Methylquecksilberbildung in Termiten und im Faulschlamm

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine in vivo Methylierung von Quecksilber in Insekten nachgewiesen. Des Weiteren wurde die Kinetik der Quecksilbermethylierung im Faulschlamm untersucht und eine Identifizierung der für die Methylierung verantwortlichen Bakteriengruppe durchgeführt. Die Methylquecksilberbestimmung erfolgte mittels Purge&Trap Gaschromatographie-Atomfluoreszenzspektrometrie nach einer sauren Phasenextraktion. Zur Untersuchung einer in vivo Methylquecksilberbildung in Insekten wurde die australischen Termite Mastotermes darwiniensis als Modellorganismus verwandt. Den Tieren wurde über einen Zeitraum von vierzehn Tagen Quecksilber(II)chlorid in unterschiedlichen Konzentrationen mit der Nahrung zugeführt und anschließend die Methylquecksilberkonzentration in den Termiten bestimmt. Mit zunehmender Quecksilberkonzentration in der Nahrung (0 µg bis 150 µg Hg2+/g) stieg die Methylquecksilberkonzentration von ca. 5 ng auf 53,8 ng pro g Termite Trockengewicht. Bei höheren Quecksilberkonzentrationen in der Nahrung wurde kein weiterer Anstieg in der Methylquecksilberkonzentration in den Termiten festgestellt. Die Untersuchung der Methylquecksilberbildung im Faulschlamm des Klärwerks Mainz-Mombach zeigte, dass die Methylquecksilberkonzentration zu Beginn der Inkubationsphase rasch anstieg und mit zunehmender Inkubationsdauer eine Sätti-gung erreichte. Nach 164 Stunden waren insgesamt 2,6 % des eingesetzten Quecksilbers zu Methylquecksilber umgesetzt. Anhand von Hemmstoffversuchen wurden Sulfat-reduzierende Bakterien als hauptverantwortliche Organismengruppe für die Quecksilbermethylierung identifiziert.

Detektion neuroaktiver Substanzen durch Modifikation des Aktivitätsmusters neokortikaler Netzwerke auf Multielektrodenarrays – Charakterisierung und Optimierung eines neuronalen Biosensors

In dieser Arbeit wurden kortikale neuronale Netzwerke auf Multielektrodenarrays auf ihre Tauglichkeit als zellbasiertes Biosensorsystem untersucht. Der Schwerpunkt der pharmakologischen Untersuchungen an den ausgereiften kortikalen Netzwerken lag auf dem Einsatz von Substanzen, welche auf den GABAA-Rezeptor einwirken. Die Modifikation des spontan generierten Aktivitätsmusters ließ dabei Rückschlüsse auf die Wirksamkeit und den Wirkungsmechanismus der Testsubstanzen zu. Ferner war in den meisten Fällen eine Diskriminierung der auf den gleichen Rezeptor einwirkenden Substanzen möglich. Die Analyse der Spikerate und verschiedener auf Bursts beruhender Messparameter machte deutlich, dass die Burstrate bei den extrazellulären Ableitungen auf Netzwerkebene den sensitivsten und verlässlichsten Parameter zum Nachweis der Substanzeffekte darstellte. Durch die Verwendung kortikaler Netzwerke unter optimierten Kulturbedingungen und einer auf das System abgestimmten Analysesoftware konnte die Reproduzierbarkeit und Sensitivität im Vergleich zu anderen Studien deutlich verbessert werden. Um die extrazelluläre Signalableitung von einer möglichst geringen Zellanzahl und damit einem überschaubaren zellulären Netzwerk auf Multielektrodenarrays zu ermöglichen, wurden die Oberflächeneigenschaften der Substrate so modifiziert, dass die Lokalisation der Zellsomata und das Auswachsen der Neurite einer geometrischen Kontrolle unterlag. Die kontrollierte Substratbeschichtung des Adhäsionspromotors Poly-D-Lysin in einem triangulären Muster konnte dabei durch die Methode des Mikrokontaktstempelns realisiert werden. Durch das kontrollierte Zellwachstum konnte die extrazelluläre Ableitung von Netzwerken einer geringen Zelldichte über einen Zeitraum von mehreren Wochen ermöglicht werden. Die Untersuchung struktureller und morphogenetischer Eigenschaften, sowie elektrophysiologische Untersuchungen der strukturierten Netzwerke bewiesen, dass die kontrollierte Substratbeschichtung sich nicht negativ auf das Wachstum, die Synaptogenese und die Funktionalität auswirkte.