Überexpression und Charakterisierung des extrazellulären Teils der humanen alpha-Sekretase ADAM10

„ÜBEREXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DES EXTRAZELLULÄREN TEILS DER HUMANEN alpha-SEKRETASE ADAM10“ ALEXANDRA LEPTICH Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei enzymatisch aktive lösliche Proteinvarianten der humanen alpha-Sekretase ADAM10 in Insektenzellen exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Dabei entsprach eine der löslichen ADAM10-Varianten dem extrazellulären Bereich des Typ-I-Membranproteins, d.h. ihr fehlte die Transmembran- und cytoplasmatische Domäne. Die zweite Variante stimmt mit einer im menschlichen Gehirn auf mRNA-Ebene nachgewiesenen Splicevariante überein, die zusätzlich noch durch das Fehlen der Cystein-reichen Domäne gekennzeichnet ist. Die alpha-Sekretase ADAM10 spielt eine wichtige Rolle bei der nicht-amyloidogenen Prozessierung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP). Dabei erfolgt dessen Spaltung innerhalb der beta-Amyloidsequenz, so dass die Produktion von Abeta-Peptiden und damit die Bildung von Amyloid-Plaques während der Alzheimer’schen Erkrankung verhindert wird. Nach der Expression der beiden löslichen ADAM10-Proteine in Insektenzellen erfolgte die Reinigung der prozessierten und damit reifen Enzymform der jeweiligen ADAM10-Proteinvariante mittels Lektin-Affinitätschromatographie. Die anschließende Charakterisierung der beiden löslichen ADAM10-Proteine erfolgte durch einen auf HPLC-Analyse basierenden Enzymtest. Dabei wurden verschiedene sich von der beta-Amyloid-Sequenz ableitenden Peptidsubstrate in vitro eingesetzt, die zum einen den Aminosäuren 11-28 der Abeta-Sequenz, zum anderen dem kompletten Abeta40-Peptid entsprachen und damit die charakteristische alpha-Sekretasespaltstelle des Amyloid-Vorläufer-Proteins enthielten. Des Weiteren kamen jeweils entsprechende Peptidsubstrate zum Einsatz, die an den Positionen 21 und 22 der Abeta- Peptidsequenz vorkommenden Mutationen trugen. Die gewählten Abeta-Substrate konnten durch die löslichen Varianten der alpha-Sekretase ADAM10 an der alpha-Sekretasestelle gespalten werden. Dabei konnte bei den Abeta11-28-Peptiden deutlich die in der Literatur beschriebene Abhängigkeit der Spaltung von der a-helicalen Struktur des Substrats beobachtet werden, während bei den längeren Abeta40-Peptide diesbezüglich kein Zusammenhang hergestellt werden konnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ADAM10 hauptsächlich als alpha-Sekretase wirkt, weniger als ein Abeta-degradierendes Enzym. Ferner konnte unter Verwendung entsprechender muriner und humaner Abeta-Peptide eine verstärkte Spaltung der murinen Substrate Abeta1-28 und Abeta1-40 durch den extrazellulären Teil von ADAM10 in vitro gezeigt werden. Dieser Versuch bestätigt die Annahme, dass es bei Nagetieren durch die Bevorzugung der nichtamyloidogenen Prozessierung von APP durch die alpha-Sekretase ADAM10 zu keiner Bildung von Amyloid-Plaques kommt. Ein Einfluss auf die Spaltung von membrangebundenem APP und damit der Bildung von neuroprotektivem sAPPalpha durch die löslichen ADAM10-Proteine konnte im Zellsystem nicht beobachtet werden. Vielmehr scheint hier die Membranverankerung von Enzym und Substrat eine wichtige Voraussetzung zu bilden. Des Weiteren konnten die löslichen ADAM10-Proteine durch ein für die Inhibierung von ADAM10 spezifische Hydroxamat-Derivat in ihrer enzymatischen Aktivität gehemmt werden. Die exprimierten ADAM10-Proteine weisen die charakteristischen Eigenschaften der alpha-Sekretase ADAM10 auf, wobei deutlich wurde, dass das Fehlen der Cystein-reichen Domäne keinen Einfluss auf die Fähigkeit der katalytischen Domäne zur Substrat- und Inhibitorbindung hatte. Auch die Stabilität des Enzyms wurde durch das Fehlen der Domäne nicht negativ beeinträchtigt. Eine wichtige Aufgabe stellt nun der Nachweis der löslichen ADAM10-Proteine sowie die Identifizierung ihrer potentiellen Substrate und deren Lokalisation in vivo dar.

„OVEREXPRESSION UND CHARACTERISATION OF THE EXTRAZELLULAR DOMAIN OF THE HUMAN alpha-SEKRETASE ADAM10“ ALEXANDRA LEPTICH In this work, two enzymatic active soluble protein variants of the human alpha-secretase ADAM10 were expressed, purified und characterised. One of the soluble ADAM10 variant corresponds to the extracellular domain of the type-I-membrane protein that is without the transmembrane- and the cytoplasmatic domain. The second enzyme corresponds to a splice-variant of ADAM10 detected on mRNA-level in human brain. This enzyme also lacks the cysteine-rich domain. The alpha-secretase ADAM10 plays an important role in the non-amyloidogenic processing of the amyloid precursor protein (APP). The APP is cleaved by the alpha-secretase within the beta-amyloid sequence so that the production of Abeta-peptides and the following building of amyloid-plaques during Alzheimer disease is prevented. After expression both ADAM10-peptides in insect cells the purification of the processed and therefore mature forms of the particular variant of the ADAM10 protein was carried out through lectin affinity chromatography. The characterisation of both soluble ADAM10 proteins is raised by a HPLC-analyse based enzyme-assay. For these in vitro assays different peptides derived from the beta-amyloid sequence were used. The peptides correspond to the amino acids 11 to 28 of the Abeta-sequence and the complete Abeta40-peptide respectively and so contain the specific cleavage-site of the alpha-secretase inside the amyloid precursor protein. Furthermore peptides with mutations at position 21 and 22 of the Abeta peptide sequence were used. The chosen Abeta substrates were cleaved at the alpha-secretase cleavage-site by the soluble variants of the alpha-secretase ADAM10. Thereby it could be recognised that the cleavage of the Abeta11-28 peptides depend on alpha-helical structure of the substrate as described in literature. On the cleavage of the Abeta40- peptides this dependence could not be observed. These results point out that ADAM10 principally acts as alpha-secretase instead of an Abeta degrading enzyme. Furthermore there was an increased cleavage of murine Abeta1-28 and Abeta1-40 by the extracellular domain of ADAM10 compared to that of the human substrates in vitro. These results confirm that because of the activity of the alpha-secretase ADAM10 and therefore the preference of the not-amyloidogenic processing of APP rodents do not build amyloidplaques. There was no influence on the cleavage of membrane bound APP and therefore the building of neuroprotective sAPPalpha due to soluble ADAM10 proteins in the chosen cell system observed. In fact it seems that the cleavage depends on the membrane-bound forms of enzyme and substrate. In addition the soluble ADAM10 proteins could be inhibited with an ADAM10 specific inhibitor. The expressed ADAM10 proteins show the characteristic properties of the alpha-secretase. Here, the lack of the cysteine-rich domain did not influence the substrate and inhibitor binding abilities of the catalytic domain. The absent domain had also no negative effect on the stability of the enzyme. An important challenge will be the detection of soluble ADAM10 proteins as well as the identification of potential substrates and their localisation in vivo.