Imunofenotipagem e remodelamento da matriz extracelular na sarcoidose pulmonar e extrapulmonar

OBJETIVO: Investigar o significado de marcadores de imunidade celular e de componentes el��sticos/col��geno da matriz extracelular em estruturas granulomatosas em bi��psias de pacientes com sarcoidose pulmonar ou extrapulmonar. M��TODOS: Determina����es qualitativas e quantitativas de c��lulas inflamat��rias, de fibras de col��geno e de fibras el��sticas em estruturas granulomatosas em bi��psias cir��rgicas de 40 pacientes com sarcoidose pulmonar e extrapulmonar foram realizadas por histomorfometria, imuno-histoqu��mica, e t��cnicas de colora����o com picrosirius e resorcina-fucsina de Weigert. RESULTADOS: A densidade de linf��citos, macr��fagos e neutr��filos nas bi��psias extrapulmonares foi significativamente maior do que nas bi��psias pulmonares. Os granulomas pulmonares apresentaram uma quantidade significativamente maior de fibras de col��geno e menor densidade de fibras el��sticas que os granulomas extrapulmonares. A quantidade de macr��fagos nos granulomas pulmonares correlacionou-se com CVF (p < 0,05), ao passo que as quantidades de linf��citos CD3+, CD4+ e CD8+ correlacionaram-se com a rela����o VEF1/CVF e com CV. Houve correla����es negativas entre CPT e contagem de c��lulas CD1a+ (p < 0,05) e entre DLCO e densidade de fibras col��genas/el��sticas (r = -0,90; p = 0,04). CONCLUS��ES: A imunofenotipagem e o remodelamento apresentaram caracter��sticas diferentes nas bi��psias dos pacientes com sarcoidose pulmonar e extrapulmonar. Essas diferen��as correlacionaram-se com os dados cl��nicos e espirom��tricos dos pacientes, sugerindo que h�� duas vias envolvidas no mecanismo de depura����o de ant��genos, que foi mais eficaz nos pulm��es e linfonodos.

Transcriptional regulation of human mu-opioid receptor gene: functional characterization of activating and inhibitory transcription factors

The organization of the nervous and immune systems is characterized by obvious differences and striking parallels. Both systems need to relay information across very short and very long distances. The nervous system communicates over both long and short ranges primarily by means of more or less hardwired intercellular connections, consisting of axons, dendrites, and synapses. Longrange communication in the immune system occurs mainly via the ordered and guided migration of immune cells and systemically acting soluble factors such as antibodies, cytokines, and chemokines. Its short-range communication either is mediated by locally acting soluble factors or transpires during direct cell���cell contact across specialized areas called ���immunological synapses��� (Kirschensteiner et al., 2003). These parallels in intercellular communication are complemented by a complex array of factors that induce cell growth and differentiation: these factors in the immune system are called cytokines; in the nervous system, they are called neurotrophic factors. Neither the cytokines nor the neurotrophic factors appear to be completely exclusive to either system (Neumann et al., 2002). In particular, mounting evidence indicates that some of the most potent members of the neurotrophin family, for example, nerve growth factor (NGF) and brainderived neurotrophic factor (BDNF), act on or are produced by immune cells (Kerschensteiner et al., 1999) There are, however, other neurotrophic factors, for example the insulin-like growth factor-1 (IGF-1), that can behave similarly (Kermer et al., 2000). These factors may allow the two systems to ���cross-talk��� and eventually may provide a molecular explanation for the reports that inflammation after central nervous system (CNS) injury has beneficial effects (Moalem et al., 1999). In order to shed some more light on such a cross-talk, therefore, transcription factors modulating mu-opioid receptor (MOPr) expression in neurons and immune cells are here investigated. More precisely, I focused my attention on IGF-I modulation of MOPr in neurons and T-cell receptor induction of MOPr expression in T-lymphocytes. Three different opioid receptors [mu (MOPr), delta (DOPr), and kappa (KOPr)] belonging to the G-protein coupled receptor super-family have been cloned. They are activated by structurallyrelated exogenous opioids or endogenous opioid peptides, and contribute to the regulation of several functions including pain transmission, respiration, cardiac and gastrointestinal functions, and immune response (Zollner and Stein 2007). MOPr is expressed mainly in the central nervous system where it regulates morphine-induced analgesia, tolerance and dependence (Mayer and Hollt 2006). Recently, induction of MOPr expression in different immune cells induced by cytokines has been reported (Kraus et al., 2001; Kraus et al., 2003). The human mu-opioid receptor gene (OPRM1) promoter is of the TATA-less type and has clusters of potential binding sites for different transcription factors (Law et al. 2004). Several studies, primarily focused on the upstream region of the OPRM1 promoter, have investigated transcriptional regulation of MOPr expression. Presently, however, it is still not completely clear how positive and negative transcription regulators cooperatively coordinate cellor tissue-specific transcription of the OPRM1 gene, and how specific growth factors influence its expression. IGF-I and its receptors are widely distributed throughout the nervous system during development, and their involvement in neurogenesis has been extensively investigated (Arsenijevic et al. 1998; van Golen and Feldman 2000). As previously mentioned, such neurotrophic factors can be also produced and/or act on immune cells (Kerschenseteiner et al., 2003). Most of the physiologic effects of IGF-I are mediated by the type I IGF surface receptor which, after ligand binding-induced autophosphorylation, associates with specific adaptor proteins and activates different second messengers (Bondy and Cheng 2004). These include: phosphatidylinositol 3-kinase, mitogen-activated protein kinase (Vincent and Feldman 2002; Di Toro et al. 2005) and members of the Janus kinase (JAK)/STAT3 signalling pathway (Zong et al. 2000; Yadav et al. 2005). REST plays a complex role in neuronal cells by differentially repressing target gene expression (Lunyak et al. 2004; Coulson 2005; Ballas and Mandel 2005). REST expression decreases during neurogenesis, but has been detected in the adult rat brain (Palm et al. 1998) and is up-regulated in response to global ischemia (Calderone et al. 2003) and induction of epilepsy (Spencer et al. 2006). Thus, the REST concentration seems to influence its function and the expression of neuronal genes, and may have different effects in embryonic and differentiated neurons (Su et al. 2004; Sun et al. 2005). In a previous study, REST was elevated during the early stages of neural induction by IGF-I in neuroblastoma cells. REST may contribute to the down-regulation of genes not yet required by the differentiation program, but its expression decreases after five days of treatment to allow for the acquisition of neural phenotypes. Di Toro et al. proposed a model in which the extent of neurite outgrowth in differentiating neuroblastoma cells was affected by the disappearance of REST (Di Toro et al. 2005). The human mu-opioid receptor gene (OPRM1) promoter contains a DNA sequence binding the repressor element 1 silencing transcription factor (REST) that is implicated in transcriptional repression. Therefore, in the fist part of this thesis, I investigated whether insulin-like growth factor I (IGF-I), which affects various aspects of neuronal induction and maturation, regulates OPRM1 transcription in neuronal cells in the context of the potential influence of REST. A series of OPRM1-luciferase promoter/reporter constructs were transfected into two neuronal cell models, neuroblastoma-derived SH-SY5Y cells and PC12 cells. In the former, endogenous levels of human mu-opioid receptor (hMOPr) mRNA were evaluated by real-time PCR. IGF-I upregulated OPRM1 transcription in: PC12 cells lacking REST, in SH-SY5Y cells transfected with constructs deficient in the REST DNA binding element, or when REST was down-regulated in retinoic acid-differentiated cells. IGF-I activates the signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3) signaling pathway and this transcription factor, binding to the STAT1/3 DNA element located in the promoter, increases OPRM1 transcription. T-cell receptor (TCR) recognizes peptide antigens displayed in the context of the major histocompatibility complex (MHC) and gives rise to a potent as well as branched intracellular signalling that convert na��ve T-cells in mature effectors, thus significantly contributing to the genesis of a specific immune response. In the second part of my work I exposed wild type Jurkat CD4+ T-cells to a mixture of CD3 and CD28 antigens in order to fully activate TCR and study whether its signalling influence OPRM1 expression. Results were that TCR engagement determined a significant induction of OPRM1 expression through the activation of transcription factors AP-1, NF-kB and NFAT. Eventually, I investigated MOPr turnover once it has been expressed on T-cells outer membrane. It turned out that DAMGO induced MOPr internalisation and recycling, whereas morphine did not. Overall, from the data collected in this thesis we can conclude that that a reduction in REST is a critical switch enabling IGF-I to up-regulate human MOPr, helping these findings clarify how human MOPr expression is regulated in neuronal cells, and that TCR engagement up-regulates OPRM1 transcription in T-cells. My results that neurotrophic factors a and TCR engagement, as well as it is reported for cytokines, seem to up-regulate OPRM1 in both neurons and immune cells suggest an important role for MOPr as a molecular bridge between neurons and immune cells; therefore, MOPr could play a key role in the cross-talk between immune system and nervous system and in particular in the balance between pro-inflammatory and pro-nociceptive stimuli and analgesic and neuroprotective effects.

Selezione e processazione di cellule Natural Killer da donatore aploidentico "KIR-ligand" incompatibile per l'immunoterapia adottiva di pazienti con Leucemia Acuta Mieloblastica ad alto rischio

The effector function of natural killer (NK) cells is regulated by activating and inhibitory receptors, termed killer immunoglobulin-like receptors (KIRs). In haploidentical T-cell depleted transplantation the donor/recipient KIR mismatch significantly impacts on NK-mediated tumor cell killing, particularly in acute myeloid leukaemia (AML). Thirty-four high risk AML patients entered a phase I-II study of adoptive NK-cell based immunotherapy and were screened for the availability of one haploidentical KIR ligand mismatched donor. Thirteen of them resulted as having one suitable donor. NK cells were enriched from steady-state leukaphereses by using a double-step immunomagnetic separation system, consisting in depletion of CD3+ T cells followed by positive selection of CD56+ NK cells. CD56+ cells were enriched from 7,70% (1,26-11,70) to 93,50% (66,41-99,20) (median recovery 53,05% (30,97-72,85), median T-depletion 3,03 log (2,15-4,52) viability >92%) and their citotoxic activity was inalterate. All patients (4 progressions, 1 partial remission and 8 complete remissions) received NK cell infusion which was preceeded by immunosuppressive chemotherapy (fludarabine and cyclophosphamide) and followed by interleukin 2 injections. The median number of reinfused NK cells was 2,74x10(e)6/kg(1,11-5,00) and contamining CD3+ T cells were always less than 1x10(e)5/kg. The procedure was well-tolerated and no significant toxicity, including GvHD, related to NK cell infusion was observed. The donor NK cells were demonstrated in 5/10 patients. Among the 8 patients in complete remission 5 patients are stable after 18, 15, 4, 2 months of follow-up. Three other patients relapsed after 2 and 7 months. The patient in partial remission obtained a complete remission, which lasted for 6 months. The 4 patients with active/progressive disease showed the persistence of disease. This clinical observation may be correlated with in vitro studies, indicating that AML cells are capable to induce NK cell apoptosis in a dose-depend manner. In summery, a two-step enrichment of CD56+ NK cells allows the collection of a suitable number of target cells to be used as adoptive immunotherapy in AML patients. Infusion of NK cells is feasible and safe and adoptively transferred NK cells can be detected after infusion.

Untersuchungen zur Lymphozytotoxizit��t gegen Tumoren in Nierenzellkarzinom-Patienten und HLA-kompatiblen gesunden Spendern

In der vorliegenden Arbeit wurden Blutlymphozyten, die aus allogenen, serologisch HLA (humanes Leukozytenantigen)-identischen gesunden Geschwisterspendern von Nierenzellkarzinom (RCC, engl. renal cell carcinoma)-Patienten isoliert wurden, auf ihre antitumorale Reaktivit��t in vitro untersucht. Dazu war die vorangehende Generierung von stabil in vitro wachsenden Tumorzelllinien der Patienten zwingende Voraussetzung. Insgesamt wurden aus prim��rem Tumorgewebe von 65 Nierenzellkarzinom-Patienten Tumorzellen isoliert und daraus Zellkulturen angelegt. In 28 % der F��lle gelang es, eine konstant in Zellkultur wachsende Tumorzelllinie zu etablieren. Daneben wurden aus 56 Tumorpatienten auch die aus dem angrenzenden Nierengewebe gewonnenen nicht-malignen Nierenzellen ��ber wenige Zellkultur-Passagen expandiert. In vier Patienten mit stabil in vitro wachsender Tumorzelllinie war ein allogener HLA-identischer Geschwisterspender verf��gbar. In diesen Modellsystemen wurden in gemischten Lymphozyten-Tumorzell-Kulturen (MLTCs, engl. mixed lymphocyte tumor cell cultures) die Blutlymphozyten der Patienten und der gesunden Geschwisterspender mit der jeweiligen Nierenzellkarzinom-Zelllinie stimuliert und tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs, engl. cytotoxic T-lymphocytes) generiert. Wenn m��glich wurden aus den so gewonnenen ���Responder���-Massenkulturen CD8+ T-Zellklone isoliert und hinsichtlich ihrer Funktionalit��t in IFN-��-ELISpot-Assays und 51Chrom-Zytotoxizit��tstests untersucht. Durch Blockade der HLA-Molek��le mit monoklonalen Antik��rpern wurden die HLA-Restriktionselemente sowie weitere an der Erkennung beteiligte Oberfl��chenmolek��le analysiert. Kreuzreaktivit��tsuntersuchungen mit einem breiten Zielzell-���Panel��� gaben Aufschluss ��ber die Reaktivit��t der CTLs gegen RCC, nicht-maligne Nierenzellen, h��matopoetische Zielzellen von Patient und Geschwisterspender und weitere Tumorzelllinien aus Nierenzellkarzinomen und anderen Tumorentit��ten. Interessanterweise zeigten die Geschwister-MLTC-���Responder���-Lymphozyten im Vergleich zu den autologen MLTC-���Responder���-Lymphozyten eine st��rkere Proliferation und Zytotoxizit��t nach Stimulation mit Tumorzellen. Die allogenen tumorreaktiven ���Responder���-Lymphozyten entstammten der CD8+ CD62L(high)+ Subpopulation, die naive Vorl��ufer- und ���central memory���-T-Zellen enth��lt. Im Gegensatz zu autologen MLTC-Lymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten konnte aus nahezu allen allogenen MLTCs mithilfe des Grenzverd��nnungsverfahrens ein breites Spektrum an tumorreaktiven CTL-Klonen expandiert werden. Diese lysierten entweder ausschlie��lich die autologe RCC-Zelllinie oder kreuzreagierten mit autologen nicht-malignen Nierenzellen. Eine Minderheit der CTL-Klone erkannte au��erdem h��matopoetische Zellen des Patienten oder allogene Tumorzellen. Als HLA-Restriktionselemente der allogenen tumorreaktiven CD8+ CTL-Klone wurden HLA-A2, -A3, -A11, -A24 und -B7 identifiziert. Weiterhin wurden in einem Modellsystem bisher unbekannte, stark proliferierende CD3+ CD16+ CD57+ CTL-Klone mit nicht-HLA-restringierter Tumorreaktivit��t isoliert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmals, dass allogene Blutlymphozyten von HLA-identischen gesunden Geschwistern eine Vielfalt von tumorreaktiven CD8+ CTL-Klonen enthalten. Im direkten Vergleich mit autologen Blutlymphozyten der betroffenen Patienten besitzen allogene Blutlymphozyten der Geschwister eine st��rkere proliferative und zytotoxische Tumorreaktivit��t. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermutigen weitere Bem��hungen, tumorreaktive T-Zellen aus dem Blut von HLA-identischen gesunden Geschwisterspendern in vitro zu generieren. Solche T-Zellen w��ren in zweierlei Hinsicht von Interesse: Zum einen erm��glichen sie die Identifizierung der Zielantigene, die von T-Zellen aus gesunden Individuen auf Tumoren erkannt werden und als Zielstrukturen von antigenspezifischen Immuntherapien (z. B. Vakzination) dienen k��nnten. Zum anderen k��nnten diese T-Zellen m��glicherweise f��r eine adoptive Immuntherapie der betroffenen Tumorpatienten verwendet werden.

Wirkmechanismen der trifunktionalen Antik��rper catumaxomab und ertumaxomab in humanen Tumorsph��roid-Kokulturen

Ein neuer Ansatz der immunologischen Krebstherapie ist die Verwendung der bispezifischen, trifunktionalen Antik��rper catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) und ertumaxomab (anti-Her2/neu x anti-CD3). Die Bispezifit��t besteht in der Bindung eines Tumor-assoziierten Antigens (EpCAM bzw. Her2/neu) und des CD3 Molek��ls auf der Oberfl��che von T-Zellen. Dar��ber hinaus stellt die Interaktion des Fc-Teils mit Fc��RI/IIa/III positiven akzessorischen Immunzellen die dritte Funktion der Antik��rper dar. Diese einzigartige Kombination erm��glicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes. In klinischen Studien konnte bereits die Wirksamkeit beider Antik��rper nachgewiesen werden. Die eigentlichen Wirkmechanismen der trifunktionalen Antik��rper jedoch sind noch nicht ausreichend bekannt. Um die Wechselwirkung zwischen den stark EpCAM- und schwach Her2/neu-positive FaDu- sowie den stabil mit humanem Her2/neu transfizierten FaDu E593-Tumorzellen, peripheren Blutmonozyten (PBMC) und trifunktionalen Antik��rpern systematisch zu untersuchen wurde ein 3D-Tumormodell, die so genannten multizellul��ren Tumorsph��roide (MCTS), angewandt. Als Endpunkte zur Beurteilung der Therapieeffizienz dienten das Volumenwachstum der Sph��roide, sowie die Klonogenit��t und die Zellvitalit��t. Zur Beurteilung der PBMC-Penetration in die Sph��roide erfolgten immunhistochemische F��rbungen und molekularbiologische Nachweise der Abwehrzellantigene. Entsprechend wurden in den Sph��roiden die Proliferationsrate ��ber eine Ki67-F��rbung sowie die Apoptoserate ��ber eine FragEL-Markierung identifiziert. Die Aktivit��t der PBMC wurde durch die Bestimmung ausgew��hlter Zytokine (ELISA) und der Zellzahl aus den Medien��berst��nden charakterisiert. Die an den FaDu- und E593-Sph��roiden erzielten Ergebnisse zeigten, dass catumaxomab und ertumaxomab eine konzentrations- und zeitabh��ngige Abnahme des Sph��roidvolumens bewirkten. Die Schrumpfung der Tumorsph��roide ging mit einer Reduktion des proliferativen und mit einer Steigerung des apoptotischen Tumorzellanteils einher. Die histologischen Befunde weisen darauf hin, dass die Volumenreduktion durch eine gesteigerte Anzahl infiltrierender Leukozyten bedingt ist. Auf verschiedenen Methoden basierende Analysen der Immunzellsubtypen zeigten eine dominierende Infiltration von zytotoxischen T-Zellen in die Tumorsph��roide. Der Aktivit��tsnachweis der T-Zellen wurde ��ber die Detektion der IL-2 mRNA und des sekretierten Zytokins erbracht. Einen zus��tzlichen Hinweis auf eine zellul��re Immunantwort liefert das Zytokinmuster mit hohen Konzentrationen an IFN-��. Der direkte Vergleich beider Antik��rper zeigte, dass der anti-tumorale Effekt abh��ngig von der Antigenexpression auf den Tumorzellen war. Die Analyse von Medien��berst��nden wies auf eine mehrheitlich h��here Zytokinaussch��ttung in Gegenwart des Tumorantigens hin. Sph��roid-Kokulturen, die mit dem parentalen anti-EpCAM Antik��rper behandelt wurden, zeigten keine Volumenreduktion. Im Gegensatz dazu f��hrte der parentale CD3-Antik��rper, das CD3- und Tumorzell-bindende catumaxomab F(ab')2 Fragment oder eine Kombination beider parentaler Antik��rper zu einer anti-tumoralen Wirkung, die jedoch nicht so stark war wie die des trifunktionalen Antik��rpers catumaxomab. Demnach ist f��r catumaxomab gezeigt, dass f��r die Effektivit��t des Antik��rpers die Trifunktionalit��t unabdingbar ist. Daraus leitet sich ab, dass die Aktivierung der Abwehrzellen durch kostimulatorische Signale notwendig ist und ��ber die Tumorantigenbindung Mechanismen wie ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) zum Tragen kommen. Die Experimente mit gleichzeitiger Gabe von trifunktionalen Antik��rpern und Immunsuppressiva haben gezeigt, dass eine Kombination beider Agenzien m��glich ist. Die Konzentrationen sind jedoch sorgf��ltig derart zu w��hlen, dass die Zytokinaussch��ttung und die damit verbundenen Nebenwirkungen reduziert sind, ohne dass die anti-tumorale Wirkung der Antik��rper ma��geblich beeinflusst wird. T-Zellen bedienen sich nach Aktivierung f��r die rasche Proliferation einer gesteigerten aeroben Glykolyse. Unter Behandlung der Kokulturen mit catumaxomab konnte im Vergleich zu anderen immunstimulatorischen Agenzien die gr����te Steigerung der Laktatproduktion bzw. der Azidifizierungs- und Sauerstoffverbrauchsrate detektiert werden. Diese Effekte weisen auf eine metabolische Aktivierung der PBMC durch catumaxomab hin. Das von den Tumorzellen abgegebene Laktat kann die Immunzellen jedoch inhibieren. Daher w��re die Kombination mit Glykolyseinhibitoren ein m��glicher Ansatz, um die Therapieeffizienz weiter zu steigern. Dar��ber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Komedikation der trifunktionalen Antik��rper mit Chemotherapeutika zu einer gesteigerter Wirkung f��hrte. Insgesamt liegt die Zukunft der Immuntherapien wohl in der Kombination mit anderen Wirkstoffklassen, die anti-tumorale Effekte verst��rken oder immunsupprimierende Mechanismen inhibieren.

Entwicklung eines pharmakologischen Modells zur Pr��fung immuntherapeutischer Antik��rper mit dreidimensionalen Tumorzellkulturen in vitro

In den letzten Jahren hat die Tumorbehandlung mit immunologischen Pr��paraten an Bedeutung gewonnen. Der allgemeine Ablauf der Testung eines Arzneimittelkandidaten sieht vor, zun��chst in Zellkulturversuchen und Tierversuchen Wirkweise und Sicherheit, sowie voraussichtliche Abbauwege und m��gliche Gefahren so beurteilen zu k��nnen, dass sie f��r einen Einsatz im Menschen in Frage kommen. Zur pr��klinischen in vitro-Testung werden dabei in der Regel Monolayer-Zellkulturen oder Einzelzellsuspensionen eingesetzt. Der Einsatz von 3D-Zellkulturmodellen, welche den Aufbau von Mikrometastasen oder intervaskul��re Areale in Tumoren exakter widerspiegeln, f��hrt zu wesentlich besseren Voraussagen bez��glich der klinischen Wirksamkeit neuer Pr��parate. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung eines neuen 3D-Zellkulturbasierten Systems zur Testung trifunktionaler bispezifischer Antik��rper f��r die Tumorbehandlung, welches sich auch auf andere vergleichbare Pr��parate ��bertragen l��sst.rnIn meiner Arbeit konnte ich mehrere humane Tumorzelllinien definieren, mit denen es gelang, stabile Co-Kulturen von Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) mit Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturisierten Spinner-Flaschen zu etablieren. Spinner-Flaschen, in denen die im Kulturmedium befindlichen Immunzellen, MCTS und Therapeutika st��ndig frei zirkulieren, sind besonders f��r eine wirklichkeitsnahe Nachbildung der in vivo-Simulation mit disseminierten Tumorzellen oder mit malignem Aszites geeignet. Diese Art der Kultivierung erlaubte Beobachtungszeiten von ���20 Tagen f��r eine gro��e Bandbreite Analysemethoden. Zu den mit dem erstellten Protokoll standardm����ig durchf��hrbaren Analysemethoden z��hlen unter anderem immunhistochemische F��rbungen an Sph��roid-Gefrierschnitten, Vitalit��tstest, Untersuchung der Plattierungs-Effizienz, Bestimmung der Sph��roidvolumina, Zytokinbestimmungen aus dem Medien��berstand mit Cytokine Bead Arrays, PCR-Analysen immunzellspezifischer Antigene, sowie durchflusszytometrische Analysen. Diese Methodenkombination erlaubt einen sehr detaillierten Einblick in die Wirkweise und Effizienz neuer Immuntherapeutika aus verschiedensten Blickwinkeln und stellt ein reproduzierbares Testsystem zur pr��klinischen Testung von Immuntherapeutika dar, das zuk��nftig als Bindeglied zwischen Monolayer-Zellkulturen und klinischen Pr��fungen einen festen Platz einnehmen k��nnte.rnMit dem beschriebenen 3D-Zellkultur-System wurden in der vorliegenden Arbeit die trifunktionalen bispezifischen Antik��rper catumaxomab (unter dem Handelsnamen Removab�� f��r die Behandlung maligner Ascites zugelassen) und ertumaxomab (derzeit in klinischen Pr��fungen) hinsichtlich ihrer Wirkweise untersucht. Die Antik��rper besitzen im Gegensatz zu herk��mmlichen monoklonalen Antik��rpern zwei verschiedene Bindungsarme, einer gegen CD3 auf T-Zellen, der zweite gegen EpCAM respektive Her2/neu - beides weit verbreitete Tumorantigene - gerichtet. An ihrem Fc-Teil besitzen sie eine dritte Bindungskapazit��t, ��ber welche sie an Fc�� RI, -IIa und -III positive akzessorische Zellen binden. Diese Kombination erm��glicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T-Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Dies stellt eine wirkungsvolle Therapieoption unter Ausnutzung der k��rpereigenen, immunologischen Abwehr dar. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass beide Antik��rper eine Gr����enreduktion der Sph��roide mit den entsprechenden Tumorantigenen in gleichem Ma��e bewirkten und die Plattierungseffizienz durch ertumaxomab dosisabh��ngig reduziert wurde. Mit dem erstellten Testsystem konnte der Wirkmechanismus von catumaxomab auf Sph��roide der Zelllinie FaDu (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) detaillierter gezeigt werden: catumaxomab wirkte dosisabh��ngig auf die Reduktion der Sph��roidvolumina und die zunehmende Infiltration von CD45+ Zellen, die als T-, NK- und/oder dendritische Zellen identifiziert wurden. Des Weiteren rief die catumaxomab-Gabe eine verst��rkte Aussch��ttung der Zytokine IL-2, IFN-�� und TNF-�� hervor. Diese Ergebnisse sprechen daf��r, dass catumaxomab die zellul��re Immunantwort aktiviert.rnDie Standard-Tumorbehandlung beinhaltet die Gabe von Chemotherapeutika. Oft werden daf��r Zytostatika mit dem unerw��nschten Nebeneffekt auch gesunde proliferierende Zellen anzugreifen verwendet. Dies kann prinzipiell auch die Wirksamkeit der Antik��rper-Therapie beeinflussen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zus��tzlich vergleichende Kombinations-Versuche mit catumaxomab und einem g��ngigen Zytostatikum - Cisplatin - durchgef��hrt. Mit Untersuchungen der Sph��roidvolumina, Vitalit��tstests und Plattierungseffizienz konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von catumaxomab bei gleichzeitiger Anwendung beider Therapeutika aufrecht erhalten bleibt und diese sogar additiv verst��rkt wird. Eine Kombinationstherapie im Menschen ist daher denkbar.rnrn

Evaluation eines humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentz��ndung

Aus der zunehmenden Pr��valenz allergischer Erkrankungen vor allem in den Industrienationen ergibt sich ein erh��hter Bedarf an Grundlagenforschung im Bereich von Allergie und Asthma sowie der Entwicklung innovativer Therapiestrategien. In der vorliegenden Dissertation wurden die immundefizienten Mausst��mme NOD-Scid und NOD-Scid gc als vielversprechender translationaler Schritt zwischen dem reinen Tiermodell und der Erprobung neuer Therapieans��tze an Probanden in klinischen Studien beleuchtet. Im experimentellen Verlauf der Arbeit wurde ein humanisiertes Mausmodell der allergischen Atemwegsentz��ndung zun��chst in immundefizienten NOD-Scid und darauffolgend in NOD-Scid gc M��usen etabliert. Diese Mausst��mme zeichnen sich durch das Nichtvorhandensein von B- und T-Zellen aus. Im NOD-Scid gc Stamm resultiert aus einer zus��tzlichen Mutation des Gens f��r die gamma-Kette des IL-2 Rezeptors der Verlust von nat��rlichen Killerzellen (NK-Zellen), was die Immunit��t in diesem Stamm weiter herabsetzt und eine Humanisierung erleichtert. Die Humanisierung der M��use erfolgte durch die intraperitoneale Injektion von mononukle��ren Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die unter Anwendung der Ficoll-Dichtezentrifugation aus dem Blut von Probanden isoliert wurden. F��r die Gewinnung der PBMCs wurden zum einen Asthma-Patienten mit einer hochgradigen Sensibilisierung gegen Birkenpollen herangezogen. Zum anderen wurden in Kontrollexperimenten PBMCs nicht-allergischer Probanden verwendet. W��hrend sich f��r den NOD-Scid Stamm 80 Millionen PBMCs als angemessene Transferzahl erwiesen, reichten f��r die Rekonstitution des NOD-Scid gc Stammes 5 Millionen PBMCs aus. Eine Analyse der Tiere erfolgte 24 Tage nach Injektion der humanen Zellen. Der Transfer der PBMCs allergischer Asthmatiker f��hrte besonders nach additiver Applikation des Birkenallergens sowie des humanen rekombinanten Zytokins IL-4 und darauffolgender nasaler allergener Provokation zu einer starken pulmonalen Entz��ndung in den M��usen. Die nasale Allergenprovokation an den Tagen 20-22 nach PBMC-Transfer erwies sich f��r das Aufkommen der Inflammation als unbedingt erforderlich. Die nasale Provokation mit Phosphat-gepufferter Salzl��sung (PBS) m��ndete in einer herabgesetzten Inflammation ohne Auspr��gung einer Atemwegs��berempfindlichkeit (AHR), reduzierten Zellzahlen in der bronchoalveol��ren Lavage (BAL) sowie verminderten Frequenzen humaner Zellen in den Lungen von Versuchstieren, die mit atopischen PBMCs supplementiert mit Birkenallergen und IL-4 rekonstituiert wurden. Die Allergenabh��ngigkeit des etablierten Modells wurde anhand von Experimenten untermauert, die verdeutlichten, dass ein Transfer von PBMCs nicht-allergischer Probanden trotz Zugabe des Allergens und humanem IL-4 keine Atemwegsinflammation ausl��ste. Bei den humanen Zellen, die an Tag 24 nach Rekonstitution in den M��usen detektiert werden konnten, handelte es sich haupts��chlich um T-Zellen. Innerhalb dieser CD3+ T-Zellen konnten CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert werden. Depletionsexperimente, in denen nach Gewinnung der PBMCs aus dem Blut der Probanden verschiedene T-Zellsubpopulationen (CD3+, CD4+, CD8+) eliminiert wurden, f��hrten zu dem Befund, dass die allergische Atemwegsentz��ndung in dem System von humanen CD4+ T-Zellen abh��ngig war. Nach der Etablierung des humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentz��ndung wurde das System zur Analyse des suppressionsf��rdernden Potentials des HIV-1 - H��llproteins gp120 genutzt. Die Applikation von gp120 f��hrte zu einer Reduktion der Atemwegsinflammation. Dies ��u��erte sich in einer Aufhebung der AHR, verminderten Zellzahlen in der BAL sowie dem reduzierten Einstrom humaner T-Zellen in die Lungen der rekonstituierten Tiere. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die anti-inflammatorische Wirkung des gp120 strikt von der Anwesenheit regulatorischer T-Zellen (Tregs) innerhalb der f��r die Humanisierung genutzten PBMCs abh��ngig war. Eine Depletion der Tregs vor Transfer in die M��use f��hrte zum Verlust der anti-inflammatorischen Effekte des gp120. Diese Ergebnisse sprechen f��r die Modulation regulatorischer T-Zellen als hoffnungsvolle Ma��nahme in der Behandlung allergischer Erkrankungen. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse er��ffnen innovative Ans��tze zur Analyse neuer Therapiestrategien in einem Testsystem, dass die Erforschung humaner Zellinteraktionen sowie die Wirkung potentieller Arzneistoffe auf humane Zellen unter in vivo Bedingungen erlaubt.

Untersuchungen zum Engraftment prim��rer humaner akuter myeloischer Leuk��mieblasten in einem immundefizienten Mausmodel

Die akute myeloische Leuk��mie (AML) stellt ein ��u��erst heterogenes h��matologisches Krankheitsbild dar, welches durch die unkontrollierte Proliferation unausdifferenzierter und gleichzeitig nicht-funktioneller h��matopoetischer Zellen gekennzeichnet ist. Sowohl die unterschiedliche Zellherkunft, als auch zytogenetische Aberrationen und molekulargenetische Mutationen sorgen f��r eine gro��e Diversit��t der Erkrankung. In der Therapie kommen Chemotherapeutika zum Einsatz, welche die Leuk��mie in eine komplette Remission bringen sollen. Der einzige kurative Ansatz besteht aus der allogenen h��matopoetischen Stammzelltransplantation. Abgesehen von den gew��nschten kurativen Effekten, induzieren die im Transplantat befindlichen Spender-T-Lymphozyten ebenfalls die Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung ��� eine Hauptursache von Mortalit��t und Morbidit��t nach erfolgter allogener h��matopoetischer Stammzelltransplantation. Da bei vielen Patienten aufgrund ihres Alters und ihrer Begleiterkrankungen eine Transplantation nicht tolerieren und da viele akuten myeloischen Leuk��mien trotz Chemotherapie progredient sind, schl��gt die Therapie fehl und es gibt keine Chance auf Heilung. rnZur Erforschung der pathologischen Prozesse der akuten myeloischen Leuk��mie sowie f��r die Entwicklung neuer Therapiekonzepte bedarf es stabiler Tiermodelle, die die maligne Erkrankung des Menschen darstellen k��nnen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Engraftments humaner prim��rer akuter myeloischer Leuk��mien in immuninkompetenten NSG-M��usen. Die Untersuchungen zeigten, dass lediglich 61,5% der getesteten Leuk��mien in den Versuchstieren nach der Xenotransplantation nachgewiesen werden konnten. Die Gr��nde hierf��r sind noch nicht ausreichend gekl��rt, beinhalten jedoch vermutlich Elemente des Homings, des ��berlebens der Zelle in der fremden murinen Knochenmarknische, der Abwesenheit spezifischer humaner Wachstumsfaktoren, sowie intrinsische Unterschiede unter den verschiedenen Leuk��mieproben. Leuk��mien, die mit einer schlechten Prognose beim Patienten verbunden sind, wachsen in den Tieren st��rker an. In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass Leuk��mien mit einer L��ngenmutation des FLT3-Rezeptors eher h��ufiger in den NSG-M��usen anwachsen, als wenn diese Mutation fehlt. Die Analyse der erstellten Wachstumskinetiken zweier Leuk��mien ergab, dass die H��he des Engraftments in den einzelnen Organen sowohl von der transplantierten Zellmenge, als auch von der H��he der angesetzten Versuchszeit abh��ngt. Zudem wurde ein Wachstum humaner T-Lymphozyten in den xenotransplantierten M��usen beobachtet, welches sowohl mit einem h��heren Engraftment der Leuk��mie in der Maus verbunden war, als auch mit einer h��heren Tiersterblichkeit vergesellschaftet war.rnZum Verhindern dieses Wachstums wurden zwei unterschiedliche Methoden angewendet und miteinander verglichen. Dabei erzielten sowohl die medikament��se Behandlung der Tiere mit dem Calcineurininhibitor Cyclosporin A, als auch die CD3-Depletion der Leuk��mie vor der Transplantation ein T-Zell-freies Wachstum in den M��usen, letzteres erwies sich jedoch als das schonendere Verfahren. In den T-Zell-freien Tieren konnte bei dem Gro��teil der Tiere kein Engraftment im Knochenmark festgestellt werden, was auf einen positiven Einfluss der humanen T-Lymphozyten beim Vorgang des Engraftments schlie��en l��sst.rn

Funktionelle Analyse der Polarit��ts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing und konditionalem Gen-Knockout

Das menschliche Gen human giant larvae (hugl) ist ein Homolog des hochkonservierten Drosophila Gens lethal giant larvae (lgl), welches in Epithelzellen die Funktion eines neoplastischen Tumorsuppressors und Polarit��tsregulators einnimmt. Ein Verlust oder eine verminderte Expression beider Homologe des Gens, hugl-1 und hugl-2, geht einher mit dem Auftreten und der Progression verschiedener epithelialer Tumorerkrankungen wie malignen Melanomen und Brust-, Kolon- oder Lungentumoren. Die exakte Funktion der Homologe Hugl-1 und Hugl-2 bez��glich der Regulation und Aufrechterhaltung der epithelialen Zellpolarit��t sowie ihre Rolle in der Genese humaner Tumore ist jedoch weitgehend unbekannt. G��nzlich unbekannt ist auch die Bedeutung von Hugl-1 und Hugl-2 als Polarit��tsregulatoren f��r die Ausbildung und den Erhalt der T-Zellmorphologie und -funktion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Polarit��ts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 in funktionellen Analysen mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing in Epithelzellen und T-Lymphozyten zu charakterisieren. Dar��ber hinaus wurden die Funktionen und Eigenschaften von mgl-2, dem murinen Homologen von hugl-2, im Cre/loxP-vermittelten konditionalen Knockout Mausmodell in vivo analysiert.rnrnZur Charakterisierung der biologischen Effekte von Hugl-1 und Hugl-2 auf das Wachstumsverhalten, Migration und Invasion von Epithelzellen wurden in dieser Arbeit erfolgreich unterschiedliche shRNA-Expressionskonstrukte generiert sowie Hugl-supprimierte Zelllinien etabliert. In vitro Studien sowie in vivo Tumorigenizit��tsanalysen lieferten ��bereinstimmend Hinweise darauf, dass verminderte Hugl-1- und Hugl-2-Expressionsspiegel eine signifikante Rolle in der Vermittlung invasiver und tumorigener Eigenschaften von Epithelzellen spielen. Dabei rief der Verlust beider Homologe deutlich st��rkere Reaktionen hervor als die Suppression eines einzelnen Homologen. Zudem wiesen die ��berexpression des Zellzyklusregulators Cyclin D1 sowie die Hyperproliferation von Hugl-1- und/oder Hugl-2-depletierten Epithelzellen auf eine wichtige Rolle der beiden Homologe in der Zellzyklusprogression und Zellproliferation hin. Ein geringer Expressionsstatus von Hugl-1 und -2 schien dar��ber hinaus mit einer verst��rkten Resistenzbildung gegen��ber Chemotherapeutika zu korrelieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die untersuchten T-Lymphozyten nur Hugl-1 exprimieren und dass letzteres notwendig f��r den F-Aktin-vermittelten Erhalt der T-Zellpolarit��t und -morphologie ist. Hugl-1-supprimierte, ��ber voneinander unabh��ngige Signalwege (TCR- oder Chemokinrezeptor) stimulierte T-Lymphozyten wiesen eine bedeutende St��rung der Lamellipodien- und Uropodausbildung auf und lie��en eine Interaktion von Hugl-1 auf Ebene des F Aktins vermuten. Des Weiteren zeigte sich, dass der Polarit��tsregulator Hugl-1 die CD3/TCR-induzierte Zelladh��sion positiv beeinflusst. Die Analyse der T-Zellmigration und -motilit��t offenbarte in ��bereinstimmung dazu die Wichtigkeit von Hugl-1 f��r die Polarisierung und Migration der T-Zellen sowohl im Chemokingradienten als auch auf mDCs. rnrnF��r die Aufkl��rung der funktionellen Rolle von mgl-2 in vivo wurde in dieser Arbeit eine Tamoxifen-induzierbare, Cre/loxP-vermittelte konditionale Mauslinie generiert und analysiert. Die mgl-2-deletierten Tiere wiesen weder signifikante ph��notypische Unterschiede noch Abweichungen in der Organanatomie auf und lie��en daher auf eine Kompensation durch das im Darmepithel koexprimierte und m��glicherweise funktionell redundante mgl-1 Gen schlie��en.rn

In-vitro-Studien zur Generierung bi-spezifischer T-Zellen durch T-Zell-Antigenrezeptor-Gentransfer

In der Dissertation konnte gezeigt werden, dass von einem pp65(495-503)-spezifischen Doppelketten-TZR (2-Plasmide-retrovirales Vektorsystem) ein Potential der Fremdinteraktion mit spezifit��tsfremden humanen gp100(280-288)- und AML(14-22)- sowie murinen MDM2(81-88)- und p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen TZRa und -b Ketten besteht. Folglich zeichneten sich essentielle Optimierungsverfahren ab. F��r die Generierung von bi-spezifischen T-Zellenrnwurden zwei Strategien etabliert. Das erste Verfahren hatte zur Voraussetzung, dass der Donor und Rezipient einen HCMV-seropositiven Status aufweisen w��rden. Es lie��en sich pp65(495-503)-spezifische T-Zellen aus HCMV-seropositiven Blutproben expandieren, die eine effiziente pp65(495-503)-Spezifit��t charakterisierte. In der zweiten Strategie wurde die Situation behandelt, dass der Donor HCMV-seronegativ und der Rezipient HCMV-seropositiv w��ren.rnHierbei wurde das Verfahren der simultanen Kotransfektion mit einem pp65(495-503)- und p53(264-272)-spezifischen TZR etabliert. Bei der Verwendung beider Strategien konnten effizient p53(264-272)-Tumorantigen und pp65(495-503)-bi-spezifische T-Zellen generiert werden.rnHinzukommend konnte der Einfluss einer m��glichen Kompetition um CD3 undrnFehlinteraktion mit den endogenen TZRa und -b Ketten dargelegt werden. Des Weiteren erfolgten Interaktionsanalysen mit einem p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR. Die Analysen erfolgten sowohl unter nicht-kompetitiven Bedingungen in der humanen Jurkat-76 Zelllinie, welche den genomischen Verlust von endogenen TZRa und -b Ketten kennzeichnete, als auch unter kompetitiven Bedingungen in den humanen T-Zellen, die endogene TZRa und -b Ketten besitzen. In dem 2-Plasmide-retroviralen Vektorsystem konnte gezeigt werden, dass unter nicht-kompetitiven Bedingungen der p53(264-272)- Tumorantigen-spezifische Einzelketten-TZR in erh��htem Ma��e mit der murinen MDM2(81-88)-sowie homologen p53(264-272)- als auch mit den humanen TZRa Ketten der Spezifit��ten AML(14-22), gp100(280-288) und pp65(495-503) (Vb3-Analyse) interagieren konnte. Interessanterweise zeigte sich im 1-Plasmid-retroviralen Vektorsystem ein geringeres Interaktionsverhalten mit murinen und vor allem humanen TZRa Ketten. Das Interaktionspotential schien TZR Subfamilien-abh��ngig zu sein. Essentiell war es, dass der p53(264-272)-Tumorantigenspezifische Einzelketten-TZR eines 1-Plasmid-retroviralen Vektorsystems, trotz minimaler Beeinflussungen, stets an der Zelloberfl��che exprimiert werden konnte und sich kein vollst��ndiger Verlust der p53(264-272)-Spezifit��t verzeichnen lie��. Aufgrund der Verdr��ngung der Va-Dom��ne des p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR durch eine Volll��ngen-TZRa-Kette, erfolgte die Optimierung der Va/Vb-Interaktion des Einzelketten-TZR (1-Plasmid-retrovirales Vektorsystem). Es konnte ein neuartiger p53(264-272)-Tumorantigenspezifischer Einzelketten-TZR mit einer zus��tzlichen k��nstlichen Disulfidbr��cke zwischen Va(Q51C) und dem C-terminalen Ende des SL7-Linkers (G16C) generiert werden. Dieser Einzelketten-TZR zeigte im Vergleich zum Ausgangskonstrukt eine st��rkere Va/Vb-Bindung, ausgelesen an einer effizienten Reduktion der residuellen Kettenfehlinteraktion, sowie eine effiziente TZR-Expression und Funktionalit��t, als auch eine vergleichbare TZR-MHC:Peptid-Affinit��t. Zusammenfassend konnten pp65(465-503)- und p53(264-272)-Tumorantigen-bi-spezifische T-Zellen generiert werden, die eine effiziente duale Spezifit��t aufwiesen. Auch konnte detailliert das Interaktionsverhalten eines p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR mit spezifit��tsfremden TZRa Ketten dargelegt sowie eine Optimierung eines p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR (1-Plasmid-retrovirales Vektorsystem) erzielt werden.

CD137-selektierte leuk��miereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leuk��miepatienten = CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients

Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leuk��mie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollst��ndige Leuk��mieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen k��nnte die Infusion von leuk��miereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leuk��mie gerichtete Immunantwort und Immunit��t vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leuk��miereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivit��t gegen akute myeloische Leuk��mie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf m��gliche GVHD Zielstrukturen zeigen. F��r die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufw��ndig, wobei vor allem eine erhebliche Verk��rzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verk��rzung der in vitro Kulturzeit k��nnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder fr��hen effector memory Ph��notyp f��rdern, f��r die eine bessere in vivo Effektorfunktion und l��ngere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass daf��r das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien k��nnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leuk��miespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifit��t des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leuk��mie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und w��chentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation ��ber den Marker CD137 positiv isoliert und anschlie��end separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zus��tzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste w��hrend der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalf��rbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen k��nnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen f��r peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind m��gliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein k��nnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antik��rper-beschichteten magnetischen beads untersucht. F��r Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren f��r eine Stimulation w��hrend der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zus��tzliches CD137-Signal f��r die l��nger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung n��tzlich sein k��nnte. Die bead-Expansion ver��nderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine m����ige Verschlechterung der Zytotoxizit��t im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabh��ngigen zellsch��digenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads f��hrte. Unerw��nschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalit��t durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Ver��ffentlichungen, die eine fundierte Erkl��rung f��r den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten k��nnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolek��l f��r die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein k��nnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass f��r diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist.

Development of a highly potent bispecific antibody format targeting the novel tumor-specific antigen CLDN18.2

Due to multiple immune evasion mechanisms of cancer cells, novel therapy approaches are required to overcome the limitations of existing immunotherapies. Bispecific antibodies are potent anti-cancer drugs, which redirect effector T cells for specific tumor cell lysis, thus enabling the patient���s immune system to fight cancer cells. The antibody format used in this proof of concept study���bispecific ideal monoclonal antibodies termed BiMAB���is a tailor-made recombinant protein, which consists of two fused scFv antibodies recognizing different antigens. Both are arranged in tandem on a single peptide chain and the individual variable binding domains are separated by special non-immunogenic linkers. The format is comprised of a scFv targeting CLDN18.2���a gastric cancer tumor associated antigen (TAA) ���while the second specificity binds the CD3 epsilon (CD3��) subunit of the T cell receptor (TCR) on T cells. For the first time, we compared in our IMAB362-based BiMAB setting, four different anti-CD3-scFvs, respectively derived from the mAbs TR66, CLB-T3, as well as the humanized and the murine variant of UCHT1. In addition, we investigated the impact of an N- versus a C-terminal location of the IMAB362-derived scFv and the anti-CD3-scFvs. Thus, nine CLDN18.2 specific BiMAB proteins were generated, of which all showed a remarkably high cytotoxicity towards CLDN18.2-positive tumor cells. Because of its promising effectiveness, 1BiMAB emerged as the BiMAB prototype. The selectivity of 1BiMAB for its TAA and CD3��, with affinities in the nanomolar range, has been confirmed by in vitro assays. Its dual binding depends on the design of an N-terminally positioned IMAB362 scFv and the consecutive C-terminally positioned TR66 scFv. 1BiMAB provoked a concentration and target cell dependent T cell activation, proliferation, and upregulation of the cytolytic protein Granzyme B, as well as the consequent elimination of target cells. Our results demonstrate that 1BiMAB is able to activate T cells independent of elements that are usually involved in the T cell recognition program, like antigen presentation, MHC restriction, and co-stimulatory effector molecules. In the first in vivo studies using a subcutaneous xenogeneic tumor mouse model in immune incompetent NSG mice, we could prove a significant therapeutic effect of 1BiMAB with partial or complete tumor elimination. The initial in vitro RIBOMAB experiments correspondingly showed encouraging results. The electroporation of 1BiMAB IVT-RNA into target or effector cells was feasible, while the functionality of translated 1BiMAB was proven by induced T cell activation and target cell lysis. Accordingly, we could show that the in vitro RIBOMAB approach was applicable for all nine BiMABs, which proves the RIBOMAB concept. Thus, the CLDN18.2-BiMAB strategy offers great potential for the treatment of cancer. In the future, administered either as protein or as IVT-RNA, the BiMAB format will contribute towards finding solutions to raise and sustain tumor-specific cellular responses elicited by engaged and activated endogenous T cells. This will potentially enable us to overcome immune evasion mechanisms of tumor cells, consequently supporting current solid gastric cancer therapies.

The interaction of Leishmania major parasites with human myeloid cells and its consequence for adaptive immunity

In der vorliegenden Arbeit fokussierten wir uns auf drei verschiedene Aspekte der Leishmanien-Infektion. Wir charakterisierten den Prozess des Zelltods ���Apoptose��� bei Parasiten (1), untersuchten die Eignung von Makrophagen und dendritischen Zellen als Wirtszelle f��r die Entwicklung der Parasiten (2) und analysierten die Konsequenzen der Infektion f��r die Entstehung einer adaptiven Immunantwort im humanen System. Von zentraler Bedeutung f��r dieses Projekt war die Hypothese, dass apoptotische Leishmanien den Autophagie-Mechanismus ihrer Wirtszellen ausnutzen, um eine T-Zell-vermittelte Abt��tung der Parasiten zu vermindern.rnWir definierten eine apoptotische Leishmanien-Population, welche durch eine rundliche Morphologie und die Expression von Phosphatidylserin auf der Parasitenoberfl��che charakterisiert war. Die apoptotischen Parasiten befanden sich zudem in der SubG1-Phase und wiesen weniger und fragmentierte DNA auf, welche durch TUNEL-Assay nachgewiesen werden konnte. Bei der Interaktion der Parasiten mit humanen Makrophagen und dendritischen Zellen zeigte sich, dass die anti-inflammatorischen Makrophagen anf��lliger f��r Infektionen waren als die pro-inflammatorischen Makrophagen oder die dendritischen Zellen. Interessanterweise wurde in den dendritischen Zellen jedoch die effektivste Umwandlung zur krankheitsausl��senden, amastigoten Lebensform beobachtet. Da sowohl Makrophagen als auch dendritische Zellen zu den antigenpr��sentierenden Zellen geh��ren, k��nnte dies zur Aktivierung der T-Zellen des adaptiven Immunsystems f��hren. Tats��chlich konnte w��hrend der Leishmanien-Infektion die Proliferation von T-Zellen beobachtet werden. Dabei stellten wir fest, dass es sich bei den proliferierenden T-Zellen um CD3+CD4+ T-Zellen handelte, welche sich ��berraschenderweise als Leishmanien-spezifische CD45RO+ T-Ged��chtniszellen herausstellten. Dies war unerwartet, da ein vorheriger Kontakt der Spender mit Leishmanien als unwahrscheinlich gilt. In Gegenwart von apoptotischen Parasiten konnte eine signifikant schw��chere T-Zell-Proliferation in Makrophagen, jedoch nicht in dendritischen Zellen beobachtet werden. Da sich die T-Zell-Proliferation negativ auf das ��berleben der Parasiten auswirkt, konnten die niedrigsten ��berlebensraten in dendritischen Zellen vorgefunden werden. Innerhalb der Zellen befanden sich die Parasiten in beiden Zelltypen im Phagosom, welches allerdings nur in Makrophagen den Autophagie-Marker LC3 aufwies. Chemische Induktion von Autophagie f��hrte, ebenso wie die Anwesenheit von apoptotischen Parasiten, zu einer stark reduzierten T-Zell-Proliferation und dementsprechend zu einem h��heren ��berleben der Parasiten.rnZusammenfassend l��sst sich aus unseren Daten schlie��en, dass Apoptose in Einzellern vorkommt. W��hrend der Infektion k��nnen sowohl Makrophagen, als auch dendritische Zellen mit Leishmanien infiziert und das adaptive Immunsystem aktivert werden. Die eingeleitete T-Zell-Proliferation nach Infektion von Makrophagen ist in Gegenwart von apoptotischen Parasiten reduziert, weshalb sie im Vergleich zu dendritischen Zellen die geeigneteren Wirtszellen f��r Leishmanien darstellen. Daf��r missbrauchen die Parasiten den Autophagie-Mechanismus der Makrophagen als Fluchtstrategie um das adaptive Immunsystem zu umgehen und somit das ��berleben der Gesamtpopulation zu sichern. Diese Ergebnisse erkl��ren den Vorteil von Apoptose in Einzellern und verdeutlichen, dass der Autophagie-Mechanismus als potentielles therapeutisches Ziel f��r die Behandlung von Leishmaniose dienen kann.rn

In vitro detection of cytotoxic T and NK cells in peripheral blood of patients with various drug-induced skin diseases

BACKGROUND: Cytotoxic cells are involved in most forms of drug-induced skin diseases. Till now, no in vitro test addressed this aspect of drug-allergic responses. Our report evaluates whether drug-induced cytotoxic cells can be detected in peripheral blood of nonacute patients with different forms of drug hypersensitivity, and also whether in vitro detection of these cells could be helpful in drug-allergy diagnosis. METHODS: GranzymeB enzyme-linked immunosorbent spot-forming (ELISPOT) and cell surface expression of the degranulation marker CD107a were evaluated on peripheral blood mononuclear cells from 12 drug-allergic patients in remission state and 16 drug-exposed healthy controls. RESULTS: In 10/12 allergic patients culprit but not irrelevant drug elicited granzymeB release after 48-72 h stimulation. It was clearly positive in patients with high proliferative response to the drug, measured in lymphocyte transformation tests. In patients, who showed moderate or low proliferation and low drug-response in granzymeB ELISPOT, overnight preincubation with interleukin (IL)-7/IL-15 enhanced drug-specific granzymeB release and allowed to clearly identify the offending agent. CD107a staining was positive on CD4+/CD3+, CD8+/CD3+ T cells as well as CD56+/CD3- natural killer cells. None of the drug-exposed healthy donors reacted to the tested drugs and allergic patients reacted only to the offending, but not to tolerated drugs. CONCLUSION: GranzymeB ELISPOT is a highly specific in vitro method to detect drug-reacting cytotoxic cells in peripheral blood of drug-allergic patients even several years after disease manifestation. Together with IL-7/IL-15 preincubation, it may be helpful in indentifying the offending drug even in some patients with weak proliferative drug-response.

Anti-inflammatory and immunosuppressive effects of the enaminone E121

Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways. The treatment of asthma is far from optimal and hence the need for novel therapeutic agents exists. The purpose of this study was to assess the anti-asthma effects of an enaminone, E121, and also its effects on human peripheral blood mononuclear cell proliferation and cytokine release. The effects of E121 were assessed in an ovalbumin-induced model of airway inflammation and airway hyperresponsiveness. In addition, the effects of E121 on phytohemagglutinin (PHA), anti-CD3 monoclonal antibody and lipopolysaccharide (LPS)-induced human peripheral blood mononuclear cell proliferation and cytokine release, respectively, were assessed. Treatment of mice with E121 significantly decreased the ovalbumin-induced increase in airway total cell influx and eosinophil infiltration and this was associated with an inhibition of ovalbumin-induced airway hyperresponsiveness. Moreover, E121 reduced PHA and anti-CD3-induced human peripheral blood mononuclear cell proliferation in vitro. E121 also inhibited PHA, anti-CD3 monoclonal antibody and LPS-induced cytokine release from human peripheral blood mononuclear cell cultures. These findings indicate that E121 exhibits anti-inflammatory and immunosuppressive activities.