Entwicklung und Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Art- und Stamm-Identifizierung pro- und eukaryotischer Organismen

Das Wachstum von Milchsäurebakterien-Arten der Gattungen Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc während der Weinfermentation kann durch die Bildung verschiedener Stoffwechselprodukte zu Weinfehlern führen. Um rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen zu können und einem Weinverderb vorzubeugen, bedarf es geeigneter Identifizierungsmethoden. Klassische mikrobiologische Methoden reichen oft nicht aus, um Mikroorganismen auf Art- und Stammniveau gezielt zu identifizieren. Wegen ihrer schnellen Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit sind molekularbiologische Identifizierungsmethoden zur Kontrolle der mikrobiellen Flora während der Lebensmittelfermentierung in der heutigen Zeit unabdingbar. In der vorliegenden Forschungsarbeit wurden die 23S rRNA-Gensequenzen von neun Pediococcus-Typstämmen sequenziert, analysiert und phylogenetische Analysen durchgeführt. Zur Art-Identifizierung der Pediokokken wurden PCR-Primer generiert und ein Multiplex PCR System entwickelt, mit dem alle typischen Arten simultan in einer Reaktion nachgewiesen werden konnten. Die Ergebnisse der Multiplex PCR-Identifizierung von 62 Pediococcus-Stämmen aus Kulturensammlungen und 47 neu isolierten Stämmen aus Wein zeigten, dass einige Stämme unter falschen Artnamen hinterlegt waren, und dass P. parvulus im Weinanbaugebiet Rheinhessen weit verbreitet war. Die Fähigkeit der Pediococcus-Stämme zur Exopolysaccharid-Synthese wurde durch den Nachweis zweier Gene überprüft. Auf Basis der 23S rDNA-Sequenzen wurden rRNA-Sekundärstrukturen mit der neu entwickelten Software Structure Star generiert, die zum Auffinden von Zielbereichen für fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden geeignet waren. Die Sequenzunterschiede zwischen den Pediococcus-Arten reichten aus, um zwei Gruppen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung differenzieren zu können. Die Verwendung unmarkierter Helfer-sonden verbesserte die Zugänglichkeit der Sonden an die rRNA, wodurch das Fluoreszenz-Signal verstärkt wurde. Um Milchsäurebakterien durch Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese differenzieren zu können, wurden Primer entwickelt, mit denen ein hochvariabler 23S rDNA-Bereich amplifiziert werden konnte. Die Nested Specifically Amplified Polymorphic DNA (nSAPD)-PCR wurde in der vorliegenden Arbeit zur Art- und Stamm-Differenzierung pro- und eukaryotischer Organismen angewandt. Es wurden vor allem weinrelevante Milchsäurebakterien der Gattungen Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc und Hefen der Gattungen Dekkera / Brettanomyces und Saccharomyces untersucht. Die Cluster-Analyse der Pediococcus-Typstämme führte zu einer unterschiedlichen Baum-Topologie im Vergleich zum phylogenetischen 23S rDNA-Stammbaum. Die Verwandtschaftsverhältnisse der untersuchten O. oeni-Stämme aus Starterkulturen konnten in Bezug auf eine frühere Cluster-Analyse reproduziert werden. Die Untersuchung von 40 B. bruxellensis-Stämmen aus rheinhessischen Weinproben zeigte eine Gruppierung der Stämme gemäß dem Ort der Probennahme. Beim Vergleich der Verwandtschaftsverhältnisse von Stämmen der Arten P. parvulus und B. bruxellensis, die aus denselben Weinproben isoliert wurden, konnte eine hohe Übereinstimmung der beiden Baum-Topologien beobachtet werden. Anhand der SAPD-PCR Untersuchung von Sekthefen aus Starterkulturen konnten alle Stämme der Art S. cerevisiae zugeordnet werden. Die nSAPD-PCR war darüber hinaus geeignet, um höhere Eukaryoten wie Weinreben zu differenzieren und es konnten die Verwandtschaftsverhältnisse von Mäusen und menschlichen Individuen durch Cluster-Analysen nachvollzogen werden. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik wurden (n)SAPD-Marker in SCAR-Marker konvertiert. Die neu generierten SCAR-Primer konnten zur simultanen Art-Identifizierung von sieben weinschädlichen Milchsäurebakterien in einer Multiplex PCR erfolgreich eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit entwickelten molekularbiologischen Identifizierungsmethoden können zum Beispiel in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle Anwendung finden.

Mikrobiologie der Fermentation in NawaRo-Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung des Abbaus von Propionsäure

In NawaRo-Biogasanlagen (BGA) kann es durch das Angebot an leicht fermentierbaren Kohlenstoff¬quel¬len zu einer bakteriell bedingten Übersäuerung durch unerwünschte kurzkettige Fettsäuren kommen. Häufiger kommt es zur Akkumulation von Propionsäure. Methanogene Archaea können bei niedrigen pH-Werten nicht mehr wachsen. Somit kann der gesamte Prozess der mikrobiellen Bildung von Biogas zum Erliegen kom¬men, was für die Biogasbetreiber zu erheblichen finanziellen Verlusten führt. Das Ziel dieser Disserta¬tion war die Aufklärung der anaeroben bakteriellen Population, die in Biogasanlagen Propionsäure ab¬bauen kann. Aus Propionat entsteht dabei Acetat und Wasserstoff. Da dieser anaerobe Prozess endergon verläuft, kann Propionsäure anaerob nur abgebaut werden, wenn der Wasserstoffpartialdruck niedrig ge¬halten wird. Diese Aufgabe erfüllen in Biogasanalgen methanogene Archaea. Die sog. sekundären Gärer leben somit in synthropher Kultur mit methanogenen Archaea.rnIn dieser Arbeit wurden die Mikroorganismen von Propionsäure-abbauenden Anreicherungskulturen aus vier NawaRo-BGA‘s identifiziert und ihr Substrat- und Produktspektrum analysiert. Die Anreicherungskul¬turen wurden vom Prüf- und Forschungsinstitut e. V. in Pirmasens zur Verfügung gestellt. Durch Analyse der bakteriellen 16S rDNA-Sequenzen der erhaltenen stabilen Propionsäure-abbauenden Mischkulturen wurde gezeigt, dass sich unter den Bakterien hauptsächlich Verwandte von den Clostridiales, aber auch Bacteroides sp., δ-, ε- so¬wie γ-Proteobakterien, Spirochäten, Synergistales und ungewöhnlicher Weise auch Thermotogales befanden. Aus Propionsäure-abbauenden Mischkulturen und aus Fermentern mesophiler NawaRo-Biogasanlagen wurden anaerobe Bakterien und methanogene Archaea angereichert und isoliert. Es wurden aus den Propionsäure-abbauenden Mischkulturen Stämme in Reinkultur erhalten, die entsprechend der 16S rDNA-Analyse als Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 und Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 identifiziert wurden. Sowohl aus Fermentern und Nachgärern von drei NawaRo-BGA‘s als auch aus zwei Laborfermentern des Leibniz-Instituts für Agrartechnik in Potsdam-Bornim e.V. (ATB) wurden Reinkulturen von methanogenen Archaea erhalten. Diese konnten den Species Methanobacterium formicicum, Metha¬noculleus bourgensis, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanosarcina sp., Methanosaeta concilii und Methanomethylovorans sp. zugeordnet werden. Damit wurden in dieser Arbeit unter anderem die typischen bisher nur durch molekularbiologische Methoden identifizierten Species methanogener Ar¬chaea aus unterschiedlichen Fermentern in Reinkultur erhalten. Dabei wurde gezeigt, dass die specifically amplified polymorphic DNA-PCR (SAPD-PCR) eine geeignete Methode darstellt, Stämme der gleichen Art methanogener Archaea voneinander zu unterscheiden. Die Methanproduktion der kultivierten methanoge¬nen Archaea wurde gaschromatographisch analysiert. Es zeigte sich, dass die hydrogenotrophe Metha¬nogenese der effizientere und ergiebigere Weg zur Bildung von Methan ist. Mit der Bestimmung der Zellzahl des Isolates Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 bei gleichzeitiger Messung der Methanbildung wurde gezeigt, dass die Methanbildung nicht zwangsläufig mit dem Wachstum korreliert. Ne-ben Pflanzenfasern beinhalteten das hergestellte Reaktorfiltrat in den Kultivierungsansätzen Acetat, die essentielle Aminosäure Valin und den Zuckeralkohol Glycerol. Gezielte Misch¬kul¬turen von sekundären Gärern mit methanogenen Isolaten ergaben einen fördernden Einfluss auf diese Bak¬terien durch hydrogenotrophe Archaea. Diese Bakterien bauten Substrate ab oder bildeten Produkte, die sie unter den gegebenen Bedingungen ohne hydrogenotrophe Archaea nicht umsetzen konnten.

Isolierung, Charakterisierung und Nachweis methanogener Archaea aus laufenden Praxis-NawaRo-Biogasanlagen unter besonderer Beruecksichtigung der Gattung Methanobacterium

Im Verlauf der Forschungsarbeit wurden Proben aus fünf, mit nachwachsenden Rohstoffen (NawaRo) beschickten, landwirtschaftlichen Biogasanlagen (BGA) auf die Biozönose methanogener Archaea hin molekularbiologisch untersucht. Über „amplified rDNA restriction analysis“-Screening (ARDRA) von Bibliotheken auf Basis von 16S rRNA-Genfragmenten konnte anhand zweier beispielhafter BGA das Vorkommen von Vertretern der Gattungen Methanoculleus (Mcu.), Methanobacterium (Mb.), Methanosarcina (Msc.) und Methanosaeta (Mst.) nachgewiesen werden. Mittels denaturierender Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) wurde das Vorkommen dieser Mikroorganismen auch in den übrigen Anlagen gezeigt. Ergänzend dazu wurde in drei Anlagen Methanospirillum hungatei nachgewiesen. Nach Ausarbeitung gattungsspezifischer Isolierungsstrategien konnten insgesamt zehn Vertreter der Gattung Methanobacterium (Isolate Mb1 bis Mb10) und jeweils ein Vertreter der Gattungen Methanoculleus (Isolat Mcu(1)), Methanosarcina (Isolat NieKK) und Methanosaeta (Isolat Mst1.3) aus den BGA-Proben isoliert werden. Durch in silico-Abgleich der partiellen 16S rRNA-Gensequenzen wurden diese als Verwandte von Mb. formicicum MFT, Mcu. bourgensis MS2T, Msc. mazei S-6T und Mst. concilii FE mit einer Sequenzidentität > 97% identifiziert. Im Laufe weiterer molekularbiologischer Untersuchungen mittels DGGE und ARDRA-Analyse konnten die Isolate den Referenzstämmen zugeordnet werden. In Bezug auf die Gattung Methanobacterium ergaben sich jedoch leichte Abweichungen. Diese bestätigten sich in vergleichenden Analysen des genomischen Fingerabdrucks in der „specifically amplified polymorphic DNA“-PCR (SAPD-PCR), welche im Rahmen dieser Arbeit erstmalig erfolgreich auf archaeelle Organismen angewandt wurde. Hier zeigten die Isolate zwei von den Fingerabdrücken der untersuchten Referenzstämme verschiedene Hauptamplifikationsmuster. Aufgrund der Vielzahl der Isolate sowie dem signifikanten Vorkommen in qPCR-Analysen und Klonbibliotheken fokussierten sich die weiteren Arbeiten zur genauen Untersuchung dieser Abweichungen auf phylogenetische Analysen der Gattung Methanobacterium und die Entwicklung von Nachweissystemen. Die Aufklärung eines Großteils der 23S rRNA-Gensequenzen der Isolate und von ausgewählten Typstämmen ermöglichte ergänzende phylogenetische Untersuchungen zu durchgeführten 16S rRNA-Analysen. Dabei wurden die Isolate jeweils in einem eigenen Cluster abseits der meisten Referenzstämme aus der Gattung Methanobacterium positioniert. Analog zur Musterbildung im Rahmen der SAPD-Analyse zeigte sich eine Differenzierung in zwei Äste und ergab in Übereinstimmung mit den in silico-Sequenzabgleichen den höchsten Verwandtschaftsgrad mit Mb. formicicum MFT. Die Eignung der SAPD-PCR zur Ableitung spezifischer Primerpaare konnte erstmals auch für methanogene Archaea gezeigt werden. Die Ableitung zweier Primerpaare mit Spezifität für die Methanobacterium-Isolate Mb1 bis Mb10 sowie für den Typstamm Mb. formicicum MFT gelang und konnte im Rahmen eines Direkt-PCR-Nachweises erfolgreich auf Reinkulturen und Fermenterproben angewandt werden. Unter Einbezug der sequenzierten 23S rRNA-Genfragmente gelang die Erstellung von Oligonukleotid-Sonden für den Einsatz in Fluoreszenz in situ-Hybridisierungsexperimenten. Im Praxistest ergab sich für diese Sonden eine Spezifität für alle getesteten Vertreter der Gattung Methanobacterium sowie für Methanosphaera stadtmanae MCB-3T und Methanobrevibacter smithii PST.rnSomit konnten im Laufe der Arbeit die dominanten methanogenen Archaea in NawaRo-BGA in mehrphasigen Experimenten nachgewiesen, quantifiziert und auf nur wenige Gattungen eingegrenzt werden. Vertreter der vier dominanten Gattungen wurden isoliert und Nachweissysteme für Arten der Gattung Methanobacterium erstellt.rn

Entwicklung und Evaluierung von Methoden zur zeitnahen Identifizierung weinrelevanter Mikroorganismen

Hefen der Gattung Saccharomyces und Milchsäurebakterien sind bei der Weinbereitung von besonderer Bedeutung. Neben der alkoholischen Gärung sind Hefen an der Ausbildung von Aromastoffen beteiligt. Milchsäurebakterien spielen eine Rolle beim biologischen Säureabbau (malolaktische Fermentation), können jedoch aufgrund ihrer Stoffwechseleigenschaft weitere Aromamodifikationen bewirken. Die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora zu verschiedenen Zeitpunkten der Weinbereitung hat einen direkten Einfluss auf die Qualität der Weine, welche sich sowohl positiv als auch negativ verändern kann. Daher ist die zuverlässige Identifizierung und Differenzierung verschiedener Mikroorganismen auf Art- aber auch Stamm-Ebene während der Vinifikation von Bedeutung.rnDer erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Differenzierung von Hefearten der Gattung Saccharomyces, welche mit Hilfe konventioneller Methoden nicht eindeutig identifiziert werden können. Unter Verwendung des DNA-Fingerprintverfahrens Specifically Amplified Polymorphic DNA (SAPD)-PCR sowie der Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization-Time-Of-Flight-Mass-Spectrometry (MALDI-TOF-MS) war eine Differenzierung dieser taxonomisch sehr nah verwandten Arten möglich. Weiterhin konnten interspezifische Hybridstämme detektiert werden. In diesem Zusammenhang wurde der Hybridcharakter des Stammes NCYC 3739 (S. cerevisiae x kudriavzevii) entdeckt. Um die Elternspezies eines Hybridstamms zuverlässig zu bestimmen, sind weiterführende Genanalysen notwendig. Hierzu konnte eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse verschiedener genetischer Marker erfolgreich herangezogen werden.rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde weiterhin ein Schnellidentifizierungssystem zum Nachweis weinrelevanter Milchsäurebakterien entwickelt. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik konnten artspezifische Primer generiert werden, welche auf der Grundlage charakteristischer Fragmente der SAPD-PCR abgeleitet wurden. Durch die Anwendung dieser Primer in einer Multiplex-PCR-Reaktion war die Detektion verschiedener, einerseits häufig in Wein vorkommender und andererseits potentiell an der Ausbildung von Weinfehlern beteiligter Milchsäurebakterien-Arten möglich. Die ermittelte Nachweisgrenze dieser Methode lag mit 10^4 - 10^5 Zellen/ml im Bereich der Zelltiter, die in Most und Wein anzutreffen sind. Anhand der Untersuchung verschiedener Weinproben von Winzern in Rheinhessen wurde die Praxistauglichkeit dieser Methode demonstriert. rnUm die gesamten Milchsäurebakterien-Population im Verlauf der Weinbereitung zu kontrollieren, kann die Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese herangezogen werden. Hierzu wurden in dieser Arbeit Primer zur Amplifikation eines Teilbereichs des rpoB-Gens abgeleitet, da dieses Gen eine Alternative zur 16S rDNA darstellt. Die DNA-Region erwies sich als geeignet, um zahlreiche weinrelevante Milchsäurebakterien-Arten zu differenzieren. In einigen ersten Versuchen konnte gezeigt werden, dass diese Methode für eine praktische Anwendung in Frage kommt.rnOenococcus oeni ist das wichtigste Milchsäurebakterien während der malolaktischen Fermentation und wird häufig in Form kommerzieller Starterkulturen eingesetzt. Da verschiedene Stämme unterschiedliche Eigenschaften aufweisen können, ist es von Bedeutung, die Identität eines bestimmten Stammes zweifelsfrei feststellen zu können. Anhand der Analyse verschiedener O. oeni-Stämme aus unterschiedlichen Weinbaugebieten konnte gezeigt werden, dass sowohl die nested SAPD-PCR als auch die MALDI-TOF-MS genügend Sensitivität aufweisen, um eine Unterscheidung auf Stamm-Ebene zu ermöglichen, wobei die mittels nSAPD-PCR ermittelten Distanzen der Stämme zueinander mit deren geographischer Herkunft korrelierte.rnDie in der vorliegenden Arbeit entwickelten Methoden können dazu beitragen, den Prozess der Weinherstellung besser zu kontrollieren und so eine hohe Qualität des Endproduktes zu gewährleisten.rn

Entwicklung eines biologischen Verfahrens zur Reduktion des Methanschlupfes von Gasaufbereitungsanlagen mittels Einsatz methanotropher Mikroorganismen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein biologisches Verfahren zur Reduzierung des Methanschlupfes in Gasaufbereitungsanlagen entwickelt. Der Methanschlupf entsteht, wenn das in Biogasanlagen produzierte Biogas auf normierte Erdgasqualität aufgereinigt wird, welches notwendig ist, um es in das bestehende Erdgasnetz einleiten zu können. Bei dieser Aufreinigung wird aus dem Biogas auch ein Teil des Methans mit ausgewaschen und gelangt mit dem Abgas der Gasaufbereitungsanlage in die Umwelt. Bisher wird dieses methanhaltige Abgas verbrannt, da eine Freisetzung des starken Treibhausgases Methan durch das Erneuerbare-Energien-Gesetz untersagt ist. Dies reduziert die ökologische Bilanz und setzt die Wirtschaftlichkeit der gesamten Biogasanlage herab. rnUm das Methan mit Hilfe eines biologischen Verfahrens zu entfernen, wurden zunächst methanoxidierende Bakterien (MOB) aus verschiedenen Habitaten isoliert, darunter auch erstmalig aus Termiten. Der Nachweis erfolgte durch (quantitative) Polymerase-Kettenreaktion und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung anhand spezifischer Primer bzw. Sonden für das Gen der partikulären Methanmonoxygenase, ein MOB kennzeichnendes Enzym. Ihr Titer wurde durch qPCR auf 10^2 - 10^3 MOB pro Termitendarm durch qPCR bestimmt. Mit Hilfe einer 16S rDNA Sequenzierung, der (n)SAPD-PCR, der Bestimmung der zellulären Fettsäurezusammensetzung sowie MALDI-TOF-MS-Analysen konnten die Termitenisolate der Gattung Methylocystis zugeordnet werden. Die fehlende Artzuweisung spricht jedoch für die Isolierung einer neuen Art. rnFür den Einsatz der Isolate in Gasaufbereitungsanlagen wurde in Zusammenarbeit mit dem Prüf- und Forschungsinstitut in Pirmasens ein Reaktor im Technikumsmaßstab entwickelt und konstruiert. Der Reaktor wurde mit synthetischen Aufwuchskörper befüllt, diese mit einem neu gewonnenen potenten Termitenisolat besiedelt und der methanhaltige Abgasstrom der Gasaufbereitungsanlage darüber geleitet. Es wurde eine Reduktion des Methans um 68 % innerhalb von 30 Stunden erzielt. Medienoptimierungen wiesen das Potential auf, diesen Verbrauch um das bis zu 4-fache weiter zu steigern. Da durch die Oxidation des Methans im Abgasstrom der Gasaufbereitungsanlage Zellmasse und Polyhydroxybuttersäure (PHB) aufgebaut wurde, können diese als Substrat zurück in die Biogasanlagen geleitet werden und die Wirtschaftlichkeit weiter verbessern. Die Wirksamkeit des in diesem Projekt entwickelten Verfahrens wurde somit eindeutig demonstriert.

Spatial isolation and genetic differentiation in naturally fragmented plant populations of the Swiss Alps

Aims The effect Of anthropogenic landscape fragmentation on the genetic diversity and adaptive potential of plant populations is a major issue in conservation biology. However, little is known about the partitioning of genetic diversity in alpine species, which occur in naturally fragmented habitats. Here, we, investigate molecular patterns of three alpine plants (Epilobium fleischeri, Geum reptans and Campanula thyrsoides) across Switzerland and ask whether Spatial isolation has led to high levels of populations differentiation, increasing over distance, and a decrease of within-population variability. We further hypothesize that file contrasting potential for long-distance dispersal (LDD) of Seed in these Species will considerably influence and explain diversity partitioning. Methods For each study species, we Sampled 20-23 individuals from each of 20-32 populations across entire Switzerland. We applied Random Amplified Polymorphic Dimorphism markers to assess genetic diversity within (Nei's expected heterozygosity, H-e; percentage of polymorphic hands, P-P) and among (analysis of molecular variance, Phi(st)) populations and correlated population size and altitude with within-populalion diversity. Spatial patterns of genetic relatedness were investigated using Mantel tests and standardized major axis regression as well as unweighted pair group method with arithmetic mean cluster analyses and Monmonier's algorithm. To avoid known biases, We standardized the numbers of populations, individuals and markers using multiple random reductions. We modelled LDD with a high alpine wind data set using the terminal velocity and height of seed release as key parameters. Additionally, we assessed a number of important life-history traits and factors that potentially influence genetic diversity partitioning (e.g. breeding system, longevity and population size). Important findings For all three species, We found a significant isolation-by-distance relationship but only a moderately high differentiation among populations (Phi(st): 22.7, 48 and 16.8%, for E. fleischeri, G. reptans and C. thyrsoides, respectively). Within-population diversity (H-c: 0.19-0.21, P-p: 62-75%) was not reduced in comparison to known results from lowland species and even small populations with < 50 reproductive individuals contained high levels of genetic diversity. We further found no indication that a high long-distance seed dispersal potential enhances genetic connectivity among populations. Gene flow seems to have a strong stochastic component causing large dissimilarity between population pairs irrespective of the spatial distance. Our results suggest that other life-history traits, especially the breeding System, may play an important role in genetic diversity partitioning. We conclude that spatial isolation in the alpine environment has a strong influence on population relatedness but that a number of factors can considerably influence the strength of this relationship.

Endosperm balance number manipulation for direct in vivo germplasm introgression to potato from a sexually isolated relative (Solanum commersonii Dun.)

Diploid (2n = 2x = 24) Solanum species with endosperm balance number (EBN) = 1 are sexually isolated from diploid 2EBN species and both tetraploid (2n = 4x = 48, 4EBN) and haploid (2n = 2x = 24, 2EBN) S. tuberosum Group Tuberosum. To sexually overcome these crossing barriers in the diploid species S. commersonii (1EBN), the manipulation of the EBN was accomplished by scaling up and down ploidy levels. Triploid F1 hybrids between an in vitro-doubled clone of S. commersonii (2n = 4x = 48, 2EBN) and diploid 2EBN clones were successfully used in 3x × 4x crosses with S. tuberosum Group Tuberosum, resulting in pentaploid/near pentaploid BC1 progenies. This provided evidence of 2n (3x) egg formation in the triploid female parents. Two selected BC1 pentaploid hybrids were successfully backcrossed both as male and as female parents with S. tuberosum Group Tuberosum. The somatic chromosome number varied greatly among the resulting BC2 progenies, which included hyperaneuploids, but also a number (4.8%) of 48-chromosome plants. The introgression of S. commersonii genomes was confirmed by the presence of S. commersonii-specific randomly amplified polymorphic DNA markers in the BC2 population analyzed. The results clearly demonstrate the feasibility of germplasm introgression from sexually isolated diploid 1EBN species into the 4x (4EBN) gene pool of the cultivated potato using sexual hybridization. Based on the amount and type of genetic variation generated, cumbersomeness, general applicability, costs, and other factors, it would be interesting to compare the approach reported here with other in vitro or in vivo, direct or indirect, approaches previously reported.

Minisatellite marker analysis of Trypanosoma brucei: Reconciliation of clonal, panmictic, and epidemic population genetic structures

The African trypanosome, Trypanosoma brucei, has been shown to undergo genetic exchange in the laboratory, but controversy exists as to the role of genetic exchange in natural populations. Much of the analysis to date has been derived from isoenzyme or randomly amplified polymorphic DNA data with parasite material from a range of hosts and geographical locations. These markers fail to distinguish between the human infective (T. b. rhodesiense) and nonhuman infective (T. b. brucei) “subspecies” so that parasites derived from hosts other than humans potentially contain both subspecies. To overcome some of the inherent problems with the use of such markers and diverse populations, we have analyzed a well-defined population from a discrete geographical location (Busoga, Uganda) using three recently described minisatellite markers. The parasites were primarily isolated from humans and cattle with the latter isolates further characterized by their ability to resist lysis by human serum (equivalent to human infectivity). The minisatellite markers show high levels of polymorphism, and from the data obtained we conclude that T. b. rhodesiense is genetically isolated from T. b. brucei and can be unambiguously identified by its multilocus genotype. Analysis of the genotype frequencies in the separated T. b. brucei and T. b. rhodesiense populations shows the former has an epidemic population structure whereas the latter is clonal. This finding suggests that the strong linkage disequilibrium observed in previous analyses, where human and nonhuman infective trypanosomes were not distinguished, results from the treatment of two genetically isolated populations as a single population.

Novel polymorphic microsatellite markers in section Caulorrhizae (Arachis, Fabaceae)

This work reports the characterization of 11 polymorphic microsatellite loci in section Caulorrhizae. The primer pairs were designed from Arachis pintoi and showed full transferability to Arachis repens species. These new markers were used to evaluate the genetic diversity in germplasm (accessions and cultivars) of section Caulorrhizae. This new set of markers detected greater gene diversity than morphological and molecular markers such as AFLP (amplified fragment length polymorphism) and RAPD (rapid analysis of polymorphic DNA) previously used in this germplasm.

Genetic characterization of clinical isolates of Clostridium difficile using an optimized RAPD protocol and PCR ribotyping reveals strain diversity between two tertiary referral Trusts in the West Midlands, UK

Epidemiological investigations of Clostridium difficile often focus on differences between separate geographical areas. In this investigation, two populations of C. difficile recovered from separate tertiary referral Trusts within the West Midlands, UK, were characterized using both PCR ribotyping and an optimized RAPD (random amplification of polymorphic DNA) protocol. The PCR ribotyping and RAPD methodologies identified differences between the two C. difficile populations, in both the prevalence and the diversity of types identified. The use of PCR ribotyping in conjunction with RAPD further categorized different types within defined PCR ribotypes, identifying different types within the same PCR ribotype and therefore providing a greater discriminatory power than either of the methods when used alone. The differences observed in this study between the two Trusts in the distribution of both RAPD 'type' and PCR ribotype demonstrate the diversity that is present amongst isolates of C. difficile within a relatively small geographical area and warrants a need for further investigation into the local epidemiology of C. difficile.

应用RAPD技术初步分析无裂栉江珧四种类型的基因组DNA

利用 3个随机引物 (S4 5 3,S4 5 4 ,S4 6 3)对无裂栉江珧 (Atrina pectinata L inaeus)的 4种类型 :青口、黄口、沙螺、棘螺基因组 DNA进行 RAPD分析 ,并对 RAPD的实验条件行了优化研究。10～ 2 0 ng的高纯度 DNA用作模板 ,退火温度为 39℃时 ,RAPD扩增的效率较高 ,扩增的带纹清晰可辨。3个引物中 ,引物 S4 5 3和 S4 6 3获得了清晰的 RAPD扩增结果 ,引物 S4 5 4未获得有效扩增 ,共扩增出 8条清晰的 DNA

~(12)C~(6+)重离子辐照胡麻种子初步研究

本文研究了6×108cm-2、1.8×109cm-2和3.6×109cm-2的12C6+重离子束辐照对胡麻种子M1代生物学性状和DNA分子多态性等方面的影响。6×108cm-2辐照处理可引起胡麻发芽率提高,促进植株株高,增强花粉活力。同时辐照处理使胡麻种子千粒重和含油量有不同程度提高,辐射剂量越高,两者数值越大,3.6×109cm-2辐射剂量的胡麻种子千粒重和含油量与对照组的相比分别高出了16.5%和19.9%,此外在此剂量处发现了花粉发生了形态变化。辐照处理对胡麻DNA分子也产生了影响,筛选出的14个随机引物可以扩增出清晰、稳定、重复性好的DNA片段,有52个是多态性DNA片段,比率为52.5%。

Search for methylation-sensitive amplification polymorphisms in mutant figs

Fig (Ficus carica) breeding programs that use conventional approaches to develop new cultivars are rare, owing to limited genetic variability and the difficulty in obtaining plants via gamete fusion. Cytosine methylation in plants leads to gene repression, thereby affecting transcription without changing the DNA sequence. Previous studies using random amplification of polymorphic DNA and amplified fragment length polymorphism markers revealed no polymorphisms among select fig mutants that originated from gamma-irradiated buds. Therefore, we conducted methylation-sensitive amplified polymorphism analysis to verify the existence of variability due to epigenetic DNA methylation among these mutant selections compared to the main cultivar 'Roxo-de-Valinhos'. Samples of genomic DNA were double-digested with either HpaII (methylation sensitive) or MspI (methylation insensitive) and with EcoRI. Fourteen primer combinations were tested, and on an average, non-methylated CCGG, symmetrically methylated CmCGG, and hemimethylated hmCCGG sites accounted for 87.9, 10.1, and 2.0%, respectively. MSAP analysis was effective in detecting differentially methylated sites in the genomic DNA of fig mutants, and methylation may be responsible for the phenotypic variation between treatments. Further analyses such as polymorphic DNA sequencing are necessary to validate these differences, standardize the regions of methylation, and analyze reads using bioinformatic tools. © FUNPEC-RP.

Tipagem molecular, perfis de sensibilidade e caracterização de transcritos diferencialmente expressos durante a infecção de Cryptococcus neoformans

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)