Entwicklung und Evaluierung von Methoden zur zeitnahen Identifizierung weinrelevanter Mikroorganismen

Hefen der Gattung Saccharomyces und Milchsäurebakterien sind bei der Weinbereitung von besonderer Bedeutung. Neben der alkoholischen Gärung sind Hefen an der Ausbildung von Aromastoffen beteiligt. Milchsäurebakterien spielen eine Rolle beim biologischen Säureabbau (malolaktische Fermentation), können jedoch aufgrund ihrer Stoffwechseleigenschaft weitere Aromamodifikationen bewirken. Die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora zu verschiedenen Zeitpunkten der Weinbereitung hat einen direkten Einfluss auf die Qualität der Weine, welche sich sowohl positiv als auch negativ verändern kann. Daher ist die zuverlässige Identifizierung und Differenzierung verschiedener Mikroorganismen auf Art- aber auch Stamm-Ebene während der Vinifikation von Bedeutung.rnDer erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Differenzierung von Hefearten der Gattung Saccharomyces, welche mit Hilfe konventioneller Methoden nicht eindeutig identifiziert werden können. Unter Verwendung des DNA-Fingerprintverfahrens Specifically Amplified Polymorphic DNA (SAPD)-PCR sowie der Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization-Time-Of-Flight-Mass-Spectrometry (MALDI-TOF-MS) war eine Differenzierung dieser taxonomisch sehr nah verwandten Arten möglich. Weiterhin konnten interspezifische Hybridstämme detektiert werden. In diesem Zusammenhang wurde der Hybridcharakter des Stammes NCYC 3739 (S. cerevisiae x kudriavzevii) entdeckt. Um die Elternspezies eines Hybridstamms zuverlässig zu bestimmen, sind weiterführende Genanalysen notwendig. Hierzu konnte eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse verschiedener genetischer Marker erfolgreich herangezogen werden.rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde weiterhin ein Schnellidentifizierungssystem zum Nachweis weinrelevanter Milchsäurebakterien entwickelt. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik konnten artspezifische Primer generiert werden, welche auf der Grundlage charakteristischer Fragmente der SAPD-PCR abgeleitet wurden. Durch die Anwendung dieser Primer in einer Multiplex-PCR-Reaktion war die Detektion verschiedener, einerseits häufig in Wein vorkommender und andererseits potentiell an der Ausbildung von Weinfehlern beteiligter Milchsäurebakterien-Arten möglich. Die ermittelte Nachweisgrenze dieser Methode lag mit 10^4 - 10^5 Zellen/ml im Bereich der Zelltiter, die in Most und Wein anzutreffen sind. Anhand der Untersuchung verschiedener Weinproben von Winzern in Rheinhessen wurde die Praxistauglichkeit dieser Methode demonstriert. rnUm die gesamten Milchsäurebakterien-Population im Verlauf der Weinbereitung zu kontrollieren, kann die Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese herangezogen werden. Hierzu wurden in dieser Arbeit Primer zur Amplifikation eines Teilbereichs des rpoB-Gens abgeleitet, da dieses Gen eine Alternative zur 16S rDNA darstellt. Die DNA-Region erwies sich als geeignet, um zahlreiche weinrelevante Milchsäurebakterien-Arten zu differenzieren. In einigen ersten Versuchen konnte gezeigt werden, dass diese Methode für eine praktische Anwendung in Frage kommt.rnOenococcus oeni ist das wichtigste Milchsäurebakterien während der malolaktischen Fermentation und wird häufig in Form kommerzieller Starterkulturen eingesetzt. Da verschiedene Stämme unterschiedliche Eigenschaften aufweisen können, ist es von Bedeutung, die Identität eines bestimmten Stammes zweifelsfrei feststellen zu können. Anhand der Analyse verschiedener O. oeni-Stämme aus unterschiedlichen Weinbaugebieten konnte gezeigt werden, dass sowohl die nested SAPD-PCR als auch die MALDI-TOF-MS genügend Sensitivität aufweisen, um eine Unterscheidung auf Stamm-Ebene zu ermöglichen, wobei die mittels nSAPD-PCR ermittelten Distanzen der Stämme zueinander mit deren geographischer Herkunft korrelierte.rnDie in der vorliegenden Arbeit entwickelten Methoden können dazu beitragen, den Prozess der Weinherstellung besser zu kontrollieren und so eine hohe Qualität des Endproduktes zu gewährleisten.rn

Yeasts belonging to the genus Saccharomyces and lactic acid bacteria are of importance during the process of winemaking. Besides the alcoholic fermentation yeasts are involved in the formation of flavouring compounds. Lactic acid bacteria are relevant for the malolactic fermentation that leads to a biological deacidifacation but also to other flavour modifications. The microbial flora during different stages of vinification can influence the quality of the wine. Therefore, reliable identification and differentiation of microorganisms on species and strain level is of interest. rnThe aim of the first part of this work was the differentiation of members of the genus Saccharomyces. Using the DNA-fingerprint method Specifically Amplified Polymorphic DNA (SAPD)-PCR as well as Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization-Time-Of-Flight-Mass-Spectrometry (MALDI-TOF-MS) allowed a differentiation of these closely related species. Furthermore, it was possible to detect interspecific hybrids. In this content, the strain NCYC 3739 could be identified as a hybrid between S. cerevisiae and S. kudriavzevii. For a reliable determination of the parental species of hybrid strains further genetic analysis are required. For this, a restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of different genetic markers could be successfully applied.rnIn this study, a method for rapid identification of wine related lactic acid bacteria was developed. Species-specific primers were generated using the Sequence Characterized Amplified Region (SCAR) technique based on the sequences of specific bands resulting from (nested) SAPD-PCR. Primers were designed in a way that permitted their application in a multiplex PCR. This allowed a fast and simultaneous detection of different lactic acid bacteria species, frequently occurring in must or wine and potentially responsible for the formation of wine spoilage. The determined detection limit of this method was about 10^4 - 10^5 cells/ml. The analysis of different wine samples demonstrated that this multiplex PCR system is appropriate for practical use.rnThe Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) allows the monitoring of the entire population of lactic acid bacteria during vinification. In this work, primers for the amplification of a part of the rpoB gene were generated. This fragment turned out to be suitable for the differentiation of numerous wine related lactic acid bacteria after separation by DGGE.rnOenococcus oeni is the most important lactic acid bacterium for malolactic fermentation and frequently used as commercial starter culture. Since different strains can exhibit high physiological heterogeneity, the discrimination of individual strains is of interest. This study showed that MALDI-TOF-MS and nested SAPD-PCR represent reliable tools for differentiation of O. oeni at the strain level. In contrast to MALDI-TOF-MS, the usage of nSAPD-PCR allowed a correlation between genetic similarities and the geographical origin of the strains analysed.rnThe methods developed in the present work permit an easy microbial monitoring of the vinification process.rn