A molecular and cellular analysis of the circadian system of the cockroach Rhyparobia (Leucophaea) maderae

Circadiane Schrittmacher koordinieren die täglichen Rhythmen in Physiologie und Verhalten in lebenden Organismen. Die Madeira Schabe Rhyparobia maderae (Synonym: Leucophaea maderae) ist ein gut etabliertes Modell, um die neuronalen Mechanismen der circadianen Rhythmen bei Insekten zu studieren. Die akzessorische Medulla (AME) in den optischen Loben des Gehirns wurde als das circadiane Schrittmacherzentrum der Madeira Schabe identifiziert, das circadiane Rhythmen in der Laufaktivität steuert. Über die Neurotransmitter der Eingangswege in das circadiane System der Madeira Schabe ist noch nicht viel bekannt. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, mögliche Eingangssignale in die innere Uhr der Madeira Schabe zu bestimmen. An primären Zellkulturen von AME-Neuronen wurden Calcium-Imaging Experimente durchgeführt, um die Neurotransmitter-abhängigen Veränderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration zu messen. Darüber hinaus wurde die Signalkaskade des Neuropeptids Pigment Dispersing Factor (PDF), dem wichtigsten Kopplungsfaktor in circadianen Schrittmachern von Insekten, in Calcium-Imaging und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Experimenten untersucht. Acetylcholin (ACh) erhöht die intrazelluläre Calcium-Konzentration in der Mehrzahl der circadianen Schrittmacherneurone der Madeiraschabe. Applikation von GABA, Serotonin und Octopamin erhöhten oder reduzierten die intrazelluläre Calcium-Konzentration in den AME-Neuronen, während Histamin und Glutamat die intrazelluläre Calcium-Konzentration ausschließlich reduzierten. Pharmakologische Experimente zeigten, dass die AME-Neurone ACh über ionotrope nikotinische ACh-Rezeptoren detektierten, während GABA über ionotrope GABAA-Rezeptoren und metabotrope GABAB-Rezeptoren detektiert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die circadiane Aktivität der Schabe durch verschiedene Eingänge, einschließlich ACh, GABA, Glutamat, Histamin, Octopamin und Serotonin, moduliert wird. Bei den FRET Studien wurde ein Proteinkinase A (PKA)-basierter FRET Sensor zur Detektion von cyclischem AMP (cAMP) verwendet. Es wurde gezeigt, dass PDF über Adenylylcyclase-abhängige und -unabhängige Signalwege wirken kann. Zusätzlich wurden Laufrad-Assays durchgeführt, um Phasenverschiebungen im Rhythmus der circadianen Laufaktivität zu detektieren, nachdem der Neurotransmitter Histamin zu verschiedenen circadianen Zeiten injiziert wurde. Histamin-Injektionen durch die Komplexaugen der Schabe ergaben eine biphasische Phasenantwortkurve (phase response curve) mit Phasenverzögerungen in der Laufaktivität am späten subjektiven Tag und am Beginn der subjektiven Nacht und Phasenbeschleunigungen in der späten subjektiven Nacht. Schließlich wurde eine extrazelluläre Ableittechnik an lebenden Schaben etabliert, die gleichzeitige Langzeit-Ableitungen von der AME, des Komplexauges (Elektroretinogramm = ERG), und der Beinmuskulatur (Elektromyogramm = EMG) für mehrere Tage ermöglichte. Diese Methode bietet einen Ausgangspunkt für weitere elektrophysiologische Untersuchungen des circadianen Systems der Schabe, in denen Substanzen (z.B. Neurotransmitter und Neuropeptide) analysiert werden können, die einen Einfluss auf den circadianen Rhythmus in der Laufaktivität haben

Molecular requirements for L-type Ca2+ channel blockade by testosterone

Despite being generally perceived as detrimental to the cardiovascular system, testosterone has marked beneficial vascular effects; most notably it acutely and directly causes vasodilatation. Indeed, men with hypotestosteronaemia can present with myocardial ischemia and angina which can be rapidly alleviated by infusion of testosterone. To date, however, in vitro studies have failed to provide a convincing mechanism to account for this clinically important effect. Here, using whole-cell patch-clamp recordings to measure current flow through recombinant human L-type Ca2+ channel alpha(1C) subunits (Ca(v)1.2), we demonstrate that testosterone inhibits such currents in a concentration-dependent manner. Importantly, this occurs over the physiological range of testosterone concentrations (IC50 34 nM), and is not mimicked by the metabolite 5alpha-androstan-17beta-ol-3-one (DHT), nor by progesterone or estradiol, even at high (10 microM) concentration. L-type Ca2+ channels in the vasculature are also important clinical targets for vasodilatory dihydropyridines. A single point mutation (T1007Y) almost completely abolishes nifedipine sensitivity in our recombinant expression system. Crucially, the same mutation renders the channels insensitive to testosterone. Our data strongly suggest, for the first time, the molecular requirements for testosterone binding to L-type Ca2+ channels, thereby supporting its beneficial role as an endogenous Ca2+ channel antagonist in the treatment of cardiovascular disease.

Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background

This paper describes a simple technique for the patterning of glia and neurons. The integration of neuronal patterning to Multi-Electrode Arrays (MEAs), planar patch clamp and silicon based ‘lab on a chip’ technologies necessitates the development of a microfabrication-compatible method, which will be reliable and easy to implement. In this study a highly consistent, straightforward and cost effective cell patterning scheme has been developed. It is based on two common ingredients: the polymer parylene-C and horse serum. Parylene-C is deposited and photo-lithographically patterned on silicon oxide (SiO2) surfaces. Subsequently, the patterns are activated via immersion in horse serum. Compared to non-activated controls, cells on the treated samples exhibited a significantly higher conformity to underlying parylene stripes. The immersion time of the patterns was reduced from 24 to 3 h without compromising the technique. X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis of parylene and SiO2 surfaces before and after immersion in horse serum and gel based eluant analysis suggests that the quantity and conformation of proteins on the parylene and SiO2 substrates might be responsible for inducing glial and neuronal patterning.

Revisiting cangitoxin, a sea anemone peptide: Purification and characterization of cangitoxins II and III from the venom of Bunodosoma cangicum

Sodium channel toxins from sea anemones are employed as tools for dissecting the biophysical properties of inactivation in voltage-gated sodium channels. Cangitoxin (CGTX) is a peptide containing 48 amino acid residues and was formerly purified from Bunodosoma cangicum. Nevertheless, previous works reporting, the isolation procedures for such peptide from B. cangicum secretions are controversial and may lead to incorrect information. In this paper, we report a simple and rapid procedure, consisting of two chromatographic steps, in order to obtain a CGTX analog directly from sea anemone venom. We also report a substitution of N16D in this peptide sample and the co-elution of an inseparable minor isoform presenting the R14H substitution. Peptides are named as CGTX-II and CGTX-III, and their effects over Nav1.1 channels in patch clamp experiments are demonstrated. (c) 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Potassium Current in Mature Bovine Spermatozoa

Ion channels have been assigned a pivotal importance in various sperm functions and are therefore promising targets for contraceptive development. The lack of data on channel functionality and pharmacology has hampered this goal. This is a consequence of technical problems of applying electrophysiological techniques to spermatozoa due to their small size and form. By using a laminin coating to increase adherence of spermatozoa and nystatin in the patch pipette for pore formation, we have adapted the whole-cell recording technique to study currents in mature uncapacitated bovine spermatozoa. Employing these conditions, in the head region, patched spermatozoa could be transferred into the whole-cell configuration. For the first time we document an outward rectifying current in mature bovine spermatozoa was blocked by tetraethyl ammonium (TEA) chloride. The observation of a shift in the reversal potential as a response to changes in the extracellular concentration of K+ ions allowed us to identify this current as K+ selective. This result shows that K+ channels in the head region of mature uncapacitated bovine spermatozoa can be suitably investigated using the whole-cell recording patch-clamp technique.

Anatomical and biochemical characterization of the calcium effect on eucalyptus urophylla callus morphogenesis in vitro

Calcium chloride concentrations from 0.0 to 12.12 mM were added to the culture medium and calcium content in calluses were determined directly by X-ray fluorescence spectrometry, a non-destructive method, allowing the processing of the same tissue for histological analysis. A multivariate statistical analysis (PCA - Principal Components Analysis) grouped the treatments into 5 blocks and indicated the most responsive group. Lack of calcium supply caused a complete absence of a morphogenic process and tissue collapse. An increase in calcium concentration gave higher total protein and sugar contents, an increase in peroxidase specific activity and changes in the histological characteristics. It was possible to verify that calcium stimulated globular somatic embryo formation at concentration of 6.62 mM.

Relationships between dendritic morphology, spatial distribution and firing patterns in rat layer 1 neurons

The cortical layer 1 contains mainly small interneurons, which have traditionally been classified according to their axonal morphology. The dendritic morphology of these cells, however, has received little attention and remains ill defined. Very little is known about how the dendritic morphology and spatial distribution of these cells may relate to functional neuronal properties. We used biocytin labeling and whole cell patch clamp recordings, associated with digital reconstruction and quantitative morphological analysis, to assess correlations between dendritic morphology, spatial distribution and membrane properties of rat layer 1 neurons. A total of 106 cells were recorded, labeled and subjected to morphological analysis. Based on the quantitative patterns of their dendritic arbor, cells were divided into four major morphotypes: horizontal, radial, ascendant, and descendant cells. Descendant cells exhibited a highly distinct spatial distribution in relation to other morphotypes, suggesting that they may have a distinct function in these cortical circuits. A significant difference was also found in the distribution of firing patterns between each morphotype and between the neuronal populations of each sublayer. Passive membrane properties were, however, statistically homogeneous among all subgroups. We speculate that the differences observed in active membrane properties might be related to differences in the synaptic input of specific types of afferent fibers and to differences in the computational roles of each morphotype in layer 1 circuits. Our findings provide new insights into dendritic morphology and neuronal spatial distribution in layer 1 circuits, indicating that variations in these properties may be correlated with distinct physiological functions.

Enhanced Expression of Heme Oxygenase-1 and Carbon Monoxide Excitatory Effects in Oxytocin and Vasopressin Neurones During Water Deprivation

A growing body of evidence indiates that carbon monoxide (CO) acts as a gas neurotransmitter within the central nervous system. Although CO has been shown to affect neurohypophyseal hormone release in response to osmotic stimuli, the precise sources, targets and mechanisms underlying the actions of CO within the magnocellular neurosecretory system remain largely unknown. In the present study, we combined immunohistochemistry and patch-clamp electrophysiology to study the cellular distribution of the CO-synthase enzyme heme oxygenase type 1 (HO-1), as well as the actions of CO on oxytocin (OT) and vasopressin (VP) magnocellular neurosecretory cells (MNCs), in euhydrated (EU) and 48-h water-deprived rats (48WD). Our results show the expression of HO-1 immunoreactivity both in OT and VP neurones, as well as in a small proportion of astrocytes, both in supraoptic (SON) and paraventricular (PVN) nuclei. HO-1 expression, and its colocalisation with OT and VP neurones within the SON and PVN, was significantly enhanced in 48WD rats. Inhibition of HO activity with chromium mesoporphyrin IX chloride (CrMP; 20 mu m) resulted in a slight membrane hyperpolarisation in SON neurones from EU rats, without significantly affecting their firing activity. In 48WD rats, on the other hand, CrMP resulted in a more robust membrane hyperpolarisation, significantly decreasing neuronal firing discharge. Taken together, our results indicate that magnocellular SON and PVN neurones express HO-1, and that CO acts as an excitatory gas neurotransmitter in this system. Moreover, we found that the expression and actions of CO were enhanced in water-deprived rats, suggesting that the state-dependent up-regulation of the HO-1/CO signalling pathway contributes to enhance MNCs firing activity during an osmotic challenge.

Characterization of selectivity and pharmacophores of type 1 sea anemone toxins by screening seven Na-v sodium channel isoforms

During their evolution, animals have developed a set of cysteine-rich peptides capable of binding various extracellular sites of voltage-gated sodium channels (VGSC). Sea anemone toxins that target VGSCs delay their inactivation process, but little is known about their selectivities. Here we report the investigation of three native type 1 toxins (CGTX-II, delta-AITX-Bcg1a and delta-AITX-Bcg1b) purified from the venom of Bunodosoma cangicum. Both delta-AITX-Bcg1a and delta-AITX-Bcg1b toxins were fully sequenced. The three peptides were evaluated by patch-clamp technique among Nav1.1-1.7 isoforms expressed in mammalian cell lines, and their preferential targets are Na(v)1.5 > 1.6 > 1.1. We also evaluated the role of some supposedly critical residues in the toxins which would interact with the channels, and observed that some substitutions are not critical as expected. In addition, CGTX-II and delta-AITX-Bcg1a evoke different shifts in activation/inactivation Boltzmann curves in Nav1.1 and 1.6. Moreover, our results suggest that the interaction region between toxins and VGSCs is not restricted to the supposed site 3 (S3-54 linker of domain IV), and this may be a consequence of distinct surface of contact of each peptide vs. targeted channel. Our data suggest that the contact surfaces of each peptide may be related to their surface charges, as CGTX-II is more positive than delta-AITX-Bcg1a and delta-AITX-Bcg1b. (C) 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.

Experimentelle Untersuchungen zur embryonalen Entwicklung identifizierter Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster

Zusammenfassung Das ventrale Nervensystem (vNS) von Drosophila melanogaster entsteht aus zwei verschiedenen Populationen von Vorläufern, den mesektodermalen oder Mittellinien (ML)-Vorläufern und den neuroektodermalen Vorläufern oder Neuroblasten (NBs). Beide Populationen unterscheiden sich in vielen Aspekten, wie z.B. Genexpression, Teilungsverhalten und Zellstammbaum. Die ca. 30 NBs pro Hemisegment delaminieren als Einzelzellen aus dem Neuroektoderm und bilden ein invariantes subepidermales Muster in der neu entstandenen neuralen Zellschicht aus. Sie sind dort aufgrund ihrer Lage und der Expression spezifischer molekularer Marker individuell identifizierbar. Um die Mechanismen zu verstehen, die zur Determination und Differenzierung von ZNS Zellen führen, ist es eine Grundvoraussetzung, die Zellstammbäume aller Vorläufer zu kennen. Unter Verwendung des lipophilen in vivo Fluoreszenzfarbstoffs DiI wurden in früheren Arbeiten die Zellstammbäume der ML-Vorläufer und von 17 NBs, die aus der ventralen Hälfte des Neuroektoderms stammten, beschrieben. In der hier vorgelegten Arbeit wurden die Zellstammbäume von 13 NBs, die aus dem dorsalen Teil des Neuroektoderms delaminierten, beschrieben und 12 davon identifizierten Vorläufern zugeordnet. Darüber hinaus wurde ein bisher nicht beschriebener NB (NB 1-3) identifiziert und anhand morphologischer und molekularer Kriterien charakterisiert. Insgesamt produzierten die NBs ca. 120 Neurone und 22 bis 27 Gliazellen pro Hemineuromer, die in eine systematische Terminologie eingefügt wurden. Insgesamt besteht damit ein Neuromer des embryonalen vNS von Drosophila aus ca. 700 Neuronen (350 pro Hemineuromer) und 60 Gliazellen (30 pro Hemineuromer), die von NBs abstammen. Hinzu kommen ca. 12 ML-Neurone und 2 bis 4 ML-Glia pro Neuromer. Damit stammten die meisten Gliazellen im embryonalen vNS von Drosophila von NBs ab, die aus dem dorsalen Neuroektoderm hervorgingen. Zwei dieser NBs hatten ausschließlich gliale Nachkommen (NB 6-4A, GP) und fünf generierten sowohl Glia als auch Neurone (NBs 1-3, 2-5, 5-6, 6-4T, 7-4). Die übrigen sieben Zellstammbäume (NBs 2-4, 3-3, 3-5, 4-3, 4-4, 5-4, Klon y) waren rein neuronal. Es war ferner möglich, das bereits bekannte laterale Cluster von even-skipped exprimierenden Zellen (EL) dem Stammbaum von NB 3-3 zuzuordnen. Zusammen mit den zuvor beschriebenen Klonen sind damit mehr als 90% der thorakalen und abdominalen Zellstammbäume im embryonalen vNS von Drosophila bekannt. Darüber hinaus sind zuvor identifizierte Neurone und die meisten Gliazellen einem bestimmten Stammbaum zugeordnet und damit mit einer ontogenetischen Geschichte versehen. Dieser komplette Datensatz liefert eine Grundlage für die Interpretation mutanter Phänotypen und für zukünftige Untersuchungen über die Festlegung von Zellschicksalen und die Differenzierung von Zellen. Dies könnte dazu beitragen, das Verhältnis zwischen Herkunft der Zelle, Genexpression und Zellfunktion besser zu verstehen. Die wesentliche Funktion neuronaler Zellen ist die Integration und Weiterleitung von elektrischen Signalen. Mithin ist die Ausbildung elektrischer Eigenschaften (Elektrogenese) ein wesentlicher Aspekt der neuronalen Entwicklung. Um dabei zelltypspezifische Unterschiede zu finden, ist die Arbeit an definierten Zellpopulationen eine zwingende Voraussetzung. Es wurde daher hier ein in vitro System verwendet, das die selektive Kultivierung identifizierter embryonaler Vorläufer unter verschiedenen Bedingungen erlaubt. Da die Zellstammbäume der ML-Vorläufer besonders einfach sind und die ML-Zellen zudem in vielen Aspekten von den neuroektodermalen Zellen verschieden sind (s.o.), wurden die ML-Neurone als erstes Modellsystem ausgewählt. Unter Verwendung der Patch-clamp Technik wurden die in dieser definierten Zellpopulation auftretenden Ionenströme detailliert beschrieben. ML-Neurone exprimierten zumindest zwei verschiedene Typen von spannungsgesteuerten K+-Strömen (IA und IK), einen spannungsabhängigen Na+-Strom und zwei spannungsgesteuerte Ca(Ba)2+-Ströme. Darüber hinaus reagierten sie auf die Neurotransmitter ACh und GABA. Die meisten Ionenströme in den ML-Neuronen waren, trotz ihrer ontogenetischen Besonderheit, annähernd identisch mit denen, die in anderen Drosophila-Neuronen gefunden wurden. Ihnen fehlte allerdings eine anhaltende Komponente des Na+-Stroms, und sie waren homogen in ihrer Aktivität. Selbst bei anhaltender elektrischer Stimulation generierten sie immer nur ein Aktionspotential. Sie sind daher möglicherweise spezifisch hinsichtlich ihrer Signalleitungseigenschaften. Interessanterweise zeigte sich durch Verwendung verschiedener Kulturbedingungen, daß die Expression der spannungsgesteuerten K+-Kanäle weitgehend zellautonom erfolgte, während die Expression der anderen Ströme stark durch das Vohandensein von Neuritenkontakten beeinflußt wurde. Vorläufige Untersuchungen lassen darauf schließen, daß der involvierte molekulare Mechanismus unabhängig von synaptischer Transmission ist. In einer Art 'Ausblick' wurde schließlich die Validität von in vitro Ableitungen durch Analyse spannungsgesteuerter K+-Ströme in einer neuen in situ Präparation geprüft, die verschiedene Bereiche des Drosophila-ZNS für elektrophysiologische Untersuchungen zugänglich macht. Damit ist ein experimentelles System etabliert, daß den direkten Vergleich von in vitro und in situ Daten an definierten Zellpopulationen ermöglichen sollte.

Physiologische Untersuchungen an der Stäbchenbahn der Nagerretina

AII Amakrinzellen sind Interneurone in der Retina und ein wichtiges Element der Stäbchenbahn von Säugetieren. Bei ihren Antworten auf Lichtreize generieren sie Aktionspotentiale, obwohl die ihnen vor- und nachgeschalteten Bipolarzellen graduierte Membranpotentiale aufweisen. Um die Verarbeitung der Lichtsignale in der Stäbchenbahn der Säuger besser zu verstehen wurden in der vorliegenden Arbeit Membranströme von AII Amakrinzellen und Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration mittels Indikatorfarbstoffe bei Mäusen simultan gemessen.Die spannungsabhängigen Kalziumkanäle waren durch eine negative Aktivierungsschwelle und eine sehr langsame Inaktivierung gekennzeichnet¸ ausserdem wurden sie von Dihydropyridinen (Agonisten und Antagonisten) moduliert. Sie fanden sich vor allem auf den keulenförmigen Fortsätzen von AII Amakrinzellen. Lokale Applikationen von Glutamat, AMPA oder Kainat lösten einwärtsgerichtete Ströme aus. Diese Ströme gingen einher mit einer Erhöhung der Fluoreszenz und zwar vor allem in den distalen Dendriten. NMDA löste keine Veränderung der Kalziumkonzentration aus und nur in wenigen Fällen Ströme (7 von 23).Diese Befunde deuten darauf hin, dass es sich bei den ionotropen Glutamat-Rezeptoren auf AII Amakrinzellen um solche vom AMPA Typ handelt. Diese befinden sich, sofern sie kalziumpermeabel sind (oder durch andere Mechanismen zu einer Erhöhung der [Ca2+]i führen) auf den distalen Dendriten nahe der Ganglienzellschicht.

Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen der Ratte

Die freien Endigungen von Spinalganglienneuronen sind für die Detektion schmerzhafter Reize verantwortlich. Dabei rufen thermische, chemische oder mechanische Reize Ionenströme über die Membran und dadurch Membranpotentialänderungen hervor. Diese noxisch induzierten Ströme sind in großem Ausmaß durch chemische Substanzen und andere Reize modulierbar. Der Ionenkanal TRPV1 ist für die Detektion zahlreicher chemischer Reize und zumindest eines Teils der noxischen Hitzereize verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige der Mechanismen geklärt, die zur schnellen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme führen. Hierfür wurden akut dissoziierte Spinalganglienneurone der Ratte als Modell ihrer peripheren Endigung verwendet und mittels Ganzzellableitung in der patch-clamp-Technik untersucht. Die Verwendung von Trypsin während der Präparation von Spinalganglienneuronen hat keinen funktionellen Einfluss auf hitze- oder capsaicininduzierte Ströme, verbessert aber die Untersuchungsbedingungen für das patch-clamp-Verfahren. Bei 144 akut dissoziierten Spinalganglienneuronen wurden die Stromantworten auf drei im Abstand von 40 s durch Überspülen mit 45,3 bis 46,3°C heißer Extrazellularlösung applizierte einsekündige Hitzereize gemessen. Dabei ließen sich repetitiv reproduzierbare hitzeinduzierte Einwärtsströme von etwa 160 pA erzielen; es konnte keine Tachyphylaxie und nahezu keine Inaktivierung beobachtet werden. Direkt vor dem zweiten Hitzereiz wurden die Neurone für zwei Sekunden mit Extrazellularlösung überspült, die Kontrolllösung, 0,5 μM Capsaicin, 10 μM Natriumnitroprussid oder 10 μM YC-1 enthielt. Es fand sich kein Hinweis, dass Stickstoffmonoxid oder die Guanylatzyklase einen signifikanten Beitrag zur Sensibilisierung von hitzeinduzierten Strömen in Spinalganglienneuronen leisten, wobei ein durch den Versuchsaufbau bedingtes Auswaschen zytosolischer Faktoren, die für den Signalweg notwendig sind, nicht ausgeschlossen werden kann. Bei einer Konzentration von 0,5 μM löst Capsaicin für zwei Sekunden einen sehr kleinen Einwärtsstrom von etwa 33 pA aus und führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung von hitzeinduzierten Einwärtsströmen in Spinalganglienneuronen (p<0,01). Das Ausmaß der Sensibilisierung ist proportional zur Größe des capsaicininduzierten Stromes (r=−0,7, p<0,001). Konstant halten der intrazellulären Calciumkonzentration mittels des Calciumchelators BAPTA verhindert die capsaicininduzierte Sensibilisierung hitzeinduzierter Ströme an Spinalganglienneuronen. Demzufolge beruht die capsaicininduzierte Sensibilisierung trotz der schnellen Kinetik nicht auf einer synergistischen Wirkung der beiden Agonisten Capsaicin und Hitze auf ihren gemeinsamen Rezeptor; vielmehr ist sie von einer Erhöhung der intrazellulären freien Calciumkonzentration abhängig. Funktionelle Änderungen der zellulären Funktion werden häufig durch Proteinkinasen vermittelt. Die zur Gruppe der MAP-Kinasen gehörende ERK (extracellular signal related kinase) wird bei Membrandepolarisation und Calciumeinstrom in die Zelle durch MEK (MAPK/extracellular signal related kinase kinase) aktiviert. Blockade der MEK/ERK-Kaskade durch den spezifischen MEK-Hemmstoff U0126 führt ebenfalls zu einer Aufhebung der Sensibilisierung der Hitzeantworten durch Capsaicin. Applikation von Capsaicin führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen. Diese Sensibilisierung wird durch einen Calciumeinstrom in die Zelle und die dadurch eintretende Aktivierung von Proteinkinasen hervorgerufen. Die MEK/ERK-Kaskade ist ein sehr schnell (deutlich unter 2 s) aktivierbares intrazelluläres Signalsystem, welches bei der Regulation der Empfindlichkeit nozizeptiver Spinalganglienneurone eine entscheidende Rolle spielt; die schnelle Kinetik ist dabei nur durch eine membranständige oder zumindest membrannahe Lokalisation dieser Proteinkinasen erklärbar. Durch Applikation zehnsekündiger Hitzereize lässt sich ebenfalls eine Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme auslösen, die ebenso ausgeprägt ist, wie die Sensibilisierung durch 0,5 μM Capsaicin (p<0,005). Durch das immer größere Verständnis der Funktionsweise des nozizeptiven Systems ergeben sich ständig neue Ansätze für die Entwicklung neuer Analgetika. So könnte durch Modulation spezifischer intrazellulärer Proteinkinasen der Phosphorylierungszustand und damit die Aktivierbarkeit von Ionenkanälen, die der Transduktion noxischer Reize dienen, positiv beeinflusst werden. Neuere, noch spezifischere Inhibitoren der MEK können der Forschung und später auch der Therapie neue Möglichkeiten eröffnen.

Aktivitätsabhängige Kontrolle der Apoptose in neonatalen kortikalen Neuronen und Etablierung eines Biosensors zur Echtzeitanalyse der Caspase-3-Aktivierung

Die Apoptose spielt eine entscheidende Rolle während der normalen Entwicklung des zentralen Nervensystems. Elektrische Aktivität und die Versorgung mit trophischen Faktoren sind ausschlaggebend für das Überleben von Neuronen. Um zu untersuchen, welche zellulären Prozesse die aktivitätsabhängige Apoptose in organotypischen Schnittkulturen des neugeborenen Neokortex beeinflussen, wurde in der vorliegenden Arbeit immunzytochemisch das Auftreten aktivierter Caspase-3, nach pharmakologischer Beeinflussung von Ionenkanälen und membranständigen Rezeptoren analysiert. Die Unterdrückung neuronaler Aktivität durch den Natriumionenkanalblocker TTX führte zu einem signifikanten Verlust kortikaler Neuronen. Ein ähnlicher Anstieg der Zahl apoptotischer Neurone konnte durch Applikation von Antagonisten ionotroper Glutamatrezeptoren, GABAA-Rezeptoren oder neuronaler Gap Junctions induziert werden. Jedoch konnte bei einigen Antagonisten die apoptosefördernde Wirkung erst nach längerer Einwirkung beobachtet werden. Im Weiteren wurde eine Methode etabliert, mit deren Hilfe eine Echtzeitanalyse der Apoptose kortikaler Neurone unter dem Entzug trophischer Faktoren in Gegenwart unterschiedlicher extrazellulärer Kaliumkonzentrationen ermöglicht wurde. Dazu wurden dissoziierte kortikale Kulturen mit dem pCaspase3-sensor Vektor transfiziert. Das durch dieses Plasmid codierte fluoreszente Protein wird Caspase-3 abhängig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Caspase3-sensor spezifisch für die Aktivierung der Caspase-3 ist, und dass die Überlebensfähigkeit der transfizierten Neurone durch das Transfektionsprotokoll nicht beeinflusst wird.

Elektrophysiologische, molekularbiologische und verhaltensbiologische Untersuchungen zur Funktion von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren bei Gehirnentwicklung und Lernvorgängen

Im Zentralnervensystem der Säuger steuern N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren viele neuronale Prozesse, insbesondere während der Ontogenese sowie bei Lern- und Gedächtnisvorgängen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung dieser Rezeptoren während der Kortexentwicklung und bei Lernvorgängen mittels elektrophysiologischer, molekularbiologischer, pharmakologischer, histologischer, genetischer und verhaltensbiologischer Methoden an der Maus untersucht. Oszillatorische Netzwerkaktivität ist für die gesunde Entwicklung des Kortex essentiell. Mittels gepaarter patch-clamp Experimente an neonatalen Subplattenzellen wurde festgestellt, dass diese Neurone elektrisch gekoppelt sind. Damit könnten sie einen wichtigen Beitrag zur Entstehung bzw. Verstärkung von Netzwerkoszillationen leisten. Subplattenzellen erhalten afferenten Eingang aus dem Thalamus sowie von benachbarten Subplattenzellen. Die funktionellen und molekularen Eigenschaften dieser Synapsen differierten in eingangsspezifischer Weise. Subplatteninterne Verbindungen besaßen Integrations- und Summationsfähigkeiten, wenig synaptische Ermüdung, Paarpulsfazilitierung und einen erhöhten NR2D-Anteil in ihren NMDA-Rezeptoren. CA1-Pyramidenzellen des adulten Hippocampus zeigten eine den Subplattenzellen vergleichbare eingangsspezifische Verteilung der NMDA-Rezeptor-Untereinheiten. Synapsen von Schaffer-Kollateralen besaßen einen höheren NR2B-Anteil als temporo-ammonische Verbindungen. Die Aktivierung von Dopamin-Rezeptoren potenzierte NR2B-vermittelte synaptische Ströme in CA1-Neuronen. Bei komplexen Lernvorgängen, wie der Extinktion einer traumatischen Erinnerung, spielten NMDA-Rezeptoren von hippocampalen CA1-Zellen eine entscheidende Rolle. CA1-NMDA-Rezeptor-ko-Mäuse zeigten erhebliche Extinktionsdefizite nach Angstkonditionierung. Zudem entwickelten diese Mäuse erhöhte Ängstlichkeit und Hyperaktivität. Das sind beim Menschen Symptome für psychiatrische Angststörungen. Daher könnten CA1-NMDA-Rezeptor-ko-Mäuse als neues Tiermodell für solche Störungen dienen, die durch ein traumatisches Erlebnis ausgelöst werden, wie beim Posttraumatischen Stresssyndrom (PTSD).

Neural network activity in the neonatal acute slice, slice culture and cell culture

Information processing and storage in the brain may be presented by the oscillations and cell assemblies. Here we address the question of how individual neurons associate together to assemble neural networks and present spontaneous electrical activity. Therefore, we dissected the neonatal brain at three different levels: acute 1-mm thick brain slice, cultured organotypic 350-µm thick brain slice and dissociated neuronal cultures. The spatio-temporal properties of neural activity were investigated by using a 60-channel Micro-electrode arrays (MEA), and the cell assemblies were studied by using a template-matching method. We find local on-propagating as well as large- scale propagating spontaneous oscillatory activity in acute slices, spontaneous network activity characterized by synchronized burst discharges in organotypic cultured slices, and autonomous bursting behaviour in dissociated neuronal cultures. Furthermore, repetitive spike patterns emerge after one week of dissociated neuronal culture and dramatically increase their numbers as well as their complexity and occurrence in the second week. Our data indicate that neurons can self-organize themselves, assembly to a neural network, present spontaneous oscillations, and emerge spatio-temporal activation patterns. The spontaneous oscillations and repetitive spike patterns may serve fundamental functions for information processing and storage in the brain.