Untersuchung des murinen, nukleären pSS- und SLE-Autoantigens La/SS-B unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen

Zusammenfassung der Dissertation von Christian Schörner 'Untersuchung des murinen, nukleären pSS- und SLE-Autoantigens La/SS-B unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen' am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Seren von Patienten mit Kollagenosen, wie SLE und pSS, enthalten Antikörper gegen das Autoantigen La/SS-B. Im murinen Tiermodell musste die Expression des La/SS-B verstanden werden. Das murine Strukturgen codierte für 13 Exons, das Start-AUG befand sich im Exon 2. Die alternativen mRNAs unterschieden sich nur in ihrer 5'-UTR. Das Exon 1b war im Vergleich zum Exon 1a am 3'-Ende um 27 Nukleotide verlängert. Die alternativen mRNAs entstanden durch einen Promotorwechsel in Kombination mit einem alternativen Spleißvorgang. Die Polyadenylierung erfolgte an zwei alternativen Polyadenylierungssequenzen. Die mRNAs waren vollständig gesplissen, zytoplasmatisch und funktionell. Die Exon 1a- und die Exon 1c-mRNA wurden ubiquitär exprimiert, die Exon 1b-mRNA dagegen nur in proliferierenden Zellen. Im C-Terminus fand sich eine Nager-spezifische Insertion sowie eine -deletion. Das Protein besaß mit 16 isoelektrischen Proteinformen eine hohe Ladungsheterogenität. NO steigerte die Proteinexpression um das 5fache und bewirkte eine Translokation des Proteins vom Zellkern in das Zytoplasma. Das humane La/SS-B-Neoepitop induzierte in Versuchstieren die Bildung von Antikörper gegen das Neoepitop und natives La/SS-B.

Die Hyperurikämie

Diese Studie bekräftigt die wichtige Rolle des Serums Harnsäure: es ist ein unabhängiger Risikofaktor für Sterblichkeit bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit. Bei KHK Patienten mit einer Harnsäureserumkonzentration unter 5,1 mg/dl - verglichen mit Patienten mit einer Harnsäureserumkonzentration über 7,1 mg/dl - steigert sich die Sterblichkeitsrate von 3.4 % auf 17.1 % (5,0-fache Zunahme). Adjustiert für das Alter, zeigten beide Geschlechter ein ansteigendes Mortalitätsrisiko bei höherer Serumharnsäurekonzentration: [weibliche Patienten : HR 1,30 [1,14-1,49], p ? 0,001; männliche Patienten: HR 1,39 [1,21-1,59], p = ? 0,001 ]. In der multivariaten Cox-Regression-Analyse konnte demonstriert werden, dass die Harnsäure eine unabhängige, signifikante positive Assoziation zur Gesamtmortalität bei Patienten mit KHK mit einem HR von 1,23 [1,11-1,36], p < 0,001 besitzt. In unserer prospektiven Beobachtungsstudie mit KHK Patienten identifizierten wir die Harnsäure als einen unabhängigen Risikofaktor, obwohl die Einnahme von Diuretika in unserer Cox Regression Analyse ebenfalls getestet wurde. Sogar bei Patienten mit niedrigem kardiovaskulärem Risiko (d.h. Patienten ohne Adipositas, Hypertonie, Hyperlipidemie, Diabetes mellitus oder metabolisches Syndrom) fanden wir, dass ansteigende Harnsäurewerte einen Prädiktor für die Kardiovaskuläre- und die Gesamtmortalität darstellt. Diese Assoziation sogar in Niedrigrisikogruppen – hier ist es unwahrscheinlich, dass sie sekundär durch andere Risikofaktoren verursacht werden - unterstützt die Rolle der Harnsäure als einen unabhängigen Risikofaktor der KHK.

Molekulare Untersuchung des Wolf-Hirschhorn-Syndroms

Das Wolf-Hirschhorn-Syndrom (WHS) ist ein komplexes und variables Fehlbildungs- Retardierungssyndrom, das durch Deletion in der distalen Chromosomenregion 4p16.3 hervorgerufen wird und dessen Ätiologie und Pathogenese bisher weitgehend unverstanden sind. Die Zielsetzung in der vorliegenden Arbeit bestand in der Identifizierung und vorläufigen Charakterisierung neuer Gene, die an der Entstehung des Syndroms beteiligt sein könnten. Die Wolf-Hirschhorn-Syndrom-kritische Region (WHSCR) konnte zu Beginn der vorliegenden Arbeit auf einen ca. 2 Mb großen Bereich zwischen den Markern D4S43 und D4S142 eingegrenzt werden. Für die Identifizierung neuer Gene wurden zunächst drei größere genomische Cosmid-/PAC-Contigs (I-III) im Bereich der Marker D4S114 bis D4S142 erstellt und mittels Exonamplifikation auf transkribierte Bereiche (Exons) untersucht. Es konnten insgesamt 67 putative 'Exons' isoliert werden, von denen einige bereits bekannten Genen (ZNF141, PDEB, MYL5, GAK, DAGK4 und FGFR3) entsprechen. Zwei dieser Gene konnten im Rahmen dieser Arbeit erstmals (DAGK4) bzw. genauer (GAK) in die distale Region 4p16.3 kartiert werden. Die restlichen Exons können aufgrund von Homologievergleichen und/oder EST-cDNA-Homologien vermutlich neuen Genen oder auch Pseudogenen (z. B. YWEE1hu) zugeordnet werden. Durch die im Verlaufe der vorliegenden Arbeit publizierte weitere Eingrenzung der WHSCR auf einen 165 Kb-großen Bereich proximal des FGFR3-Gens konzentrierten sich weitere Untersuchungen auf die detaillierte Analyse der WHSCR zwischen dem Marker D4S43 und FGFR3. Mit Hilfe von Exonamplifikation bzw. computergestützter Auswertung vorliegender Sequenzdaten aus diesem Bereich ('GRAIL', 'GENSCAN' und Homologievergleiche in den EST-Datenbanken des NCBI) konnten mehrere neue Gene identifiziert werden. In distaler-proximaler Reihenfolge handelt es sich dabei um die Gene LETM1, 51, 43, 45, 57 und POL4P. LETM1 kodiert für ein putatives Transmembran-Protein mit einem Leucin-Zipper- und zwei EF-Hand-Motiven und könnte aufgrund seiner möglichen Beteiligung an der Ca2+-Homeostase und/oder der Signal-transduktion zu Merkmalen des WHS (Krampfanfällen, mentale Retardierung und muskuläre Hypotonie) beitragen. Das Gen 51 entspricht einem in etwa zeitgleich durch Stec et al. (1998) und Chesi et al. (1998) als WHSC1 bzw. MMSET bezeichnetem Gen und wurde daher nicht weiter charakterisiert. Es wird genauso wie das Gen 43, das zeitgleich von Wright et al. (1999b) als WHSC2 beschrieben werden konnte und eine mögliche Rolle bei der Transkriptionselongation spielt, ubiquitär exprimiert. Das in der vorliegenden Arbeit identifizierte Gen 45 zeigt demgegenüber ein ausgesprochen spezifisches Expressionsmuster (in Nervenzellen des Gehirns sowie in Spermatiden). Dies stellt zusammen mit der strukturellen Ähnlichkeit des putativen Genprodukts zu Signalmolekülen einen interessanten Zusammenhang zu Merkmalen des WHS (beispielsweise Kryptorchismus, Uterusfehlbildungen oder auch neurologische Defekte) her. Demgegenüber handelt es sich bei dem Gen 57 möglicherweise um ein trunkiertes Pseudogen des eRFS-Gens auf Chromosom 6q24 (Wallrapp et al., 1998). Das POL4P-Gen schließlich stellt allein aufgrund seiner genomischen Lokalisation sowie seiner möglichen Funktion (als DNA-Polymerase-ähnliches Gen) kein gutes Kandidatengen für spezifische Merkmale des Syndroms dar und wurde daher nicht im Detail charakterisiert. Um die Beteiligung der Gene an der Ätiologie und Pathogenese des Syndroms zu verstehen, ist die Entwicklung eines Mausmodells (über das Einfügen gezielter Deletionen in das Mausgenom) geplant. Um dies zu ermöglichen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Charakterisierung der orthologen Region bei der Maus vorgenommen. Zunächst wurden die orthologen Gene der Maus (Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p) identifiziert. Durch die Erstellung sowie die genaue Kartierung eines murinen genomischen P1/PAC-Klon-Contigs konnte gezeigt werden, daß die murinen Gene Fgfr3, Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p sowie einige weitere der überprüften EST-cDNA-Klone der Maus in einem durchgehenden Syntänieblock zwischen Mensch (POL4P bis FGFR3) und Maus (Mmu 5.20) enthalten sind, der in seiner genomischen Ausdehnung in etwa den Verhältnissen beim Menschen (zwischen POL4P und FGFR3) entspricht.

Untersuchungen zur Reparatur und Mutagenität oxidativer DNA-Schäden in vivo und deren Bedeutung für die Kanzerogenese

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung, welche Rolle endogen gebildete oxidative DNA-Modifikationen bei der Kanzerogenese spielen. Dazu wurden Cockayne Syndrom B-knockout-Mäuse (Csb-/-), 8-Hydroxyguanin-DNA-Glykosylase-knockout-Mäuse (Ogg1-/-) und Csb-/-/Ogg1-/- Mäuse generiert, die das bakterielle lacI-Gen (Big Blue®) tragen und somit für in vivo Mutationstests eingesetzt werden können. Die Ergebnisse zeigen, dass es in den Lebern der Ogg1-/- Mäuse zu einem 2,1-fachen und in Csb-/-/Ogg1-/- Mäusen zu einem statistisch signifikanten 3,3-fachen Anstieg der Mutationsfrequenz kommt. Die gefundene Erhöhung der Mutationsfrequenz war vor allem auf eine Erhöhung der G:C zu T:A Transversionen zurückzuführen, die typischerweise aus nicht repariertem 8 Hydroxyguanin (8-oxoG) entstehen. Aus mechanistischer Sicht verdeutlichen die Ergebnisse, dass OGG1 das primäre Abwehrsystem gegen oxidative DNA-Modifikationen darstellt und dass das CSB-Protein einen Ausfall von OGG1, selbst in nicht transkribierter DNA, teilweise kompensieren kann. Aus der Korrelation der gefundenen oxidativen DNA-Schäden - bestimmt mittels Alkalischer Elution und der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (Fpg-Protein) - mit der Mutationsfrequenz konnte abgeleitet werden, dass bereits weniger als 0,2 Fpg-sensitive DNA-Modifikationen pro 1 Million Basenpaare ausreichen, die spontane Mutationsfrequenz in vivo zu verdoppeln. Zur Untersuchung, welche Rolle die erhöhte Mutationsfrequenz bei der Krebsentstehung spielt, wurden Csb-/-/Ogg1-/- und Wildtyp-Mäuse mit dem Peroxisomenproliferator und spezifischem Leberpromotor WY-14,643 behandelt um spontan initiierte Hepatozyten zur Proliferation anzuregen. Als Endpunkt einer malignen Entartung wurde das Auftreten von Glucose-6-Phosphatase positiven und negativen Läsionen beobachtet. Es zeigte sich, dass Csb-/-/Ogg1-/- Mäuse signifikant mehr enzymveränderte Läsionen in ihren Lebern aufwiesen, als die Wildtyp-Kontrollen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass endogen gebildete oxidative DNA-Modifikationen und daraus resultierende Mutationen grundsätzlich einen erheblichen Anteil zur hohen spontanen Krebsinzidenz in der Bevölkerung leisten könnten.

Il "Progetto Bagnacavallo": prevalenza dell'ipertransaminasemia e NAFLD nella popolazione generale

Nel corso degli ultimi due decenni in particolare si è andata evidenziando a livello epatologico una entità definita oggi Non-alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) che si è andata ad affiancare alle cause in precedenza conosciute, fino a risultare, attraverso il succedersi di riscontri scientifici, la causa prevalente di epatopatia, in particolare nei paesi occidentali e industrializzati. Negli stessi anni un'altra problematica clinica complessa che va sotto il nome di Sindrome Metabolica si è andata via via delineando attraverso le sue molteplici correlazioni con quelle che sono le cause di morbidità e mortalità prevalenti nella nostra realtà, dal diabete alla patologia cardiovascolare e non ultima alla NAFLD stessa. Scopo dello Studio in oggetto a questa tesi era proprio di rivalutare nel territorio italiano la prevalenza di epatopatia in particolare correlabile alla NAFLD e la sua associazione con la Sindrome Metabolica.

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus Der Wilms-Tumor (WT, Nephroblastom) ist ein embryonaler Nierentumor, der durch die maligne Transformation von undifferenziertem Nierengewebe, sog. nephrogenen Resten, entsteht. WT treten mit einer Inzidenz von 1 in 10.000 Lebendgeburten auf. Das Hauptmanifestationsalter, der normalerweise einseitig und sporadisch auftretenden Tumore, liegt zwischen dem 3. und 4. Lebensjahr. Etwa 10 % der Patienten entwickeln jedoch bilaterale Tumore. In diesen Fällen ist eine Assoziation mit komplexen genetischen Krankheitsbildern (u. a. WAGR-, Denys-Drash-, Frasier- und Beckwith-Wiedemann-Syndrom) festzustellen. In 15 % der sporadischen WT sind Mutationen im WT1 (Wilms-Tumor 1)-Gen beschrieben. WT1 besteht aus zehn Exons und weist typische Merkmale von Transkriptionsfaktoren (z. B. vier Zinkfinger) auf. Zwei alternative Spleißereignisse betreffen Exon 5 (+/−Exon 5) und Exon 9 (Transkripte mit bzw. ohne die codierenden Sequenzen für die AS Lysin-Threonin-Serin; +/−KTS). Die Lage der drei alternativ vorhandenen AS zwischen den Zinkfingern 3 und 4 bestimmt die verschiedenen Funktionen der WT1-Proteine (4 Isoformen) als Transkriptionsfaktor (−KTS) bzw. als RNA-bindendes Protein (+KTS). Das zunächst im Zusammenhang mit WT als Tumorsuppressorgen identifizierte WT1 ist ein Entwicklungsgen mit einem sehr komplexen Expressionsmuster in der Embryonalentwicklung. Dabei ist v. a. die Bedeutung in der Urogenitalentwicklung entscheidend. Konstitutive, homozygote Wt1−/− k.o.-Mäuse sind embryonal (~ E12,5 dpc) letal und bilden u. a. keine Gonaden und keine Nieren. Aus diesem Grund existiert bisher kein Wilms-Tumormodell. Die Herstellung eines konditionalen murinen Tiermodells auf Basis des Tet on/off-Systems zur Untersuchung der Nierenentwicklung bzw. zur Analyse der Wilms-Tumorpathogenese war Ziel dieser Arbeit. Hierfür wurden drei Mauslinien generiert: Zwei transgene sog. Responder-Linien, die eine chimäre spleißbare Wt1-cDNA der Variante musWt1+Exon 5;+/−KTS unter der Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors im Genom tragen. Dieses tTA/Dox-abhängig regulierbare Wt1-Transgen (tgWt1) sollte (exogen regulierbar) die Expression des endogenen Wt1-Lokus ausreichend nachahmen, um die kritischen Phasen der Embryogenese zu überwinden und lebensfähige Tiere zu erhalten. Parallel dazu wurde die Wt1-Effektor-Mauslinie (WE2) generiert. Diese trägt einen tetrazyklinabhängigen Transaktivator (tTA) zur Steuerung Tet-regulierbarer Transgene unter der Kontrolle des endogenen Wt1-Promotors. Die durch homologe Rekombination in ES-Zellen erreichte Integration des tTA direkt am Translationsstartpunkt des Wt1-Lokus hat in den Tieren einen heterozygoten Wt1 knock out/tTA knock in zur Folge. Die bisher vorgenommenen Verpaarungen doppelt transgener Wt1-tTA+/−/Resp-Mäuse ergaben keinen Rescue des letalen Wt1 k.o. und es konnten bislang keine Wilms-Tumore induziert werden. Alle im Verlauf der Arbeit generierten Mauslinien wurden umfassend charakterisiert. So konnte für die Tiere der Responder-Linien Wt1-Resp1 (mit zusätzlichen Isolator-Sequenzen zum Schutz des Transgens vor Positionseffekten) und Wt1-Resp2 (ohne Isolatoren) konnte die Tet-induzierbare Expression und die Spleißbarkeit des tgWt1 in MEF-Assays und mittels Effektor-Mäusen auf RNA-Ebene nachgewiesen werden. Die genomische Charakterisierung der WE2-Linie ergab eine ungeklärte etwa 120 kb große Inversion am Wt1-Lokus, die alle 5'-regulatorischen Sequenzen mitsamt des tTA vom Rest von Wt1 trennt. Tiere dieser Linie weisen aber dennoch einen funktionalen Wt1 k.o. auf: Unter den Nachkommen aus Intercross-Verpaarungen von Wt1-tTA+/−-Mäusen lassen sich auf Grund der Letalität keine Wt1−/−-Genotypen nachweisen. Die Charakterisierung der Effektor-Linie auf RNA-Ebene und mittels Reporter-Mäusen liefert ein Wt1-analoges tTA-Expressionsmuster: So findet man eine deutliche tTA-Expression u. a. in Niere (Glomeruli), Uterus, Ovar und Testis. Die hier vorgestellten Experimente ergeben darüber hinaus eindeutige Hinweise einer Beteiligung von Wt1 in der Entstehung der glatten Muskulatur bzw. in der Vaskulogenese.

Ornithophily in the genus Salvia L. (Lamiaceae)

This dissertation presents for the first time a survey of bird pollinated (ornithophilous) Salvia species. Within the approximately 1000 species of the worldwide distributed genus roughly 20% (186 spp.) are bird pollinated. Excepting four species in the Old World (South Africa and Madagascar), ornithophilous species are restricted to the New World where they represent about one third of the species. They occur mainly in higher altitudes (1500-3000m) and usually grow as shrubs or perennial herbs (97%). The bilabiate to tubular flowers are often red (at least 49%), averaging 35mm (7-130mm) in length and produce a large to medium volume of nectar with rather low sugar concentration. Pollination by sunbirds and white-eyes is documented in a South African species, and that by hummingbirds in 16 species of the New World (USA, Mexico, Guatemala and Bolivia). Beside pollinator observations, the functionality of the staminal levers, the process of pollen transfer and the fitting between flowers and birds are tested by inserting museum skins and metal rods into fresh flowers. The most surprising result is the finding of two different main pollen transfer mechanisms. In at least 54% of the species an active staminal lever mechanism enables pollen deposition on the birds body. This is illustrated in detail in the South African S. lanceolata at which birds were observed to release the lever mechanism and became dusted with pollen. In contrast, the lever mechanism in about 35% of the New World species is reduced in different ways. Pollen transfer by inactive ‘levers’ is demonstrated in detail in S. haenkei in Bolivia, at which four pollinating hummingbird species could be observed. The tubular corolla forced the birds in a specific position, thereby causing pollen transfer from the exserted pollen-sacs to the birds body. With respect to the floral diversity and systematic affiliation of the species, parallel evolution of ornithophily and lever reduction is likely. Considering that bird pollinated species might have derived from bee pollinated species and that the staminal levers have become secondarily inactive, it is concluded that the shift in pollinators induced phenotypic changes even disabling such a sophisticated structure as the staminal lever mechanism.

Strategies to identify and further characterize novel and known genes involved in regulation of skeletogenesis

372 osteochondrodysplasias and genetically determined dysostoses were reported in 2007 [Superti-Furga and Unger, 2007]. For 215 of these conditions, an association with one or more genes can be stated, while the molecular changes for the remaining syndromes remain illusive to date. Thus, the present dissertation aims at the identification of novel genes involved in processes regarding cartilage/ bone formation, growth, differentiation and homeostasis, which may serve as candidate genes for the above mentioned conditions. Two different approaches were undertaken. Firstly, a high throughput EST sequencing project from a human fetal cartilage library was performed to identify novel genes in early skeletal development (20th week of gestation until 2nd year of life) that could be investigated as potential candidate genes. 5000 EST sequences were generated and analyzed representing 1573 individual transcripts, corresponding to known (1400) and to novel, yet uncharacterized genes (173). About 7% of the proteins were already described in cartilage/ bone development or homeostasis, showing that the generated library is tissue specific. The remaining profile of this library was compared to previously published libraries from different time points (8th–12th, 18th–20th week and adult human cartilage) that also showed a similar distribution, reflecting the quality of the presented library analyzed. Furthermore, three potential candidate genes (LRRC59, CRELD2, ZNF577) were further investigated and their potential involvement in skeletogenesis was discussed. Secondly, a disease-orientated approach was undertaken to identify downstream targets of LMX1B, the gene causing Nail-Patella syndrome (NPS), and to investigate similar conditions. Like NPS, Genitopatellar syndrome (GPS) is characterized by aplasia or hypoplasia of the patella and renal anomalies. Therefore, six GPS patients were enrolled in a study to investigate the molecular changes responsible for this relatively rare disease. A 3.07 Mb deletion including LMX1B and NR5A1 (SF1) was found in one female patient that showed features of both NPS and GPS and investigations revealed a 46,XY karyotype and ovotestes indicating true hermaphroditism. The microdeletion was not seen in any of the five other patients with GPS features only, but a potential regulatory element between the two genes cannot be ruled out yet. Since Lmx1b is expressed in the dorsal limb bud and in podocytes, proteomic approaches and expression profiling were performed with murine material of the limbs and the kidneys to identify its downstream targets. After 2D-gel electrophoresis with protein extracts from E13.5 fore limb buds and newborn kidneys of Lmx1b wild type and knock-out mice and mass spectrometry analysis, only two proteins, agrin and carbonic anhydrase 2, remained of interest, but further analysis of the two genes did not show a transcriptional down regulation by Lmx1b. The focus was switched to expression profiles and RNA from newborn Lmx1b wild type and knock-out kidneys was compared by microarray analysis. Potential Lmx1b targets were almost impossible to study, because of the early death of Lmx1b deficient mice, when the glomeruli, containing podocytes, are still immature. Because Lmx1b is also expressed during limb development, RNA from wild type and knock-out Lmx1b E11.5 fore limb buds was investigated by microarray, revealing four potential Lmx1b downstream targets: neuropilin 2, single-stranded DNA binding protein 2, peroxisome proliferative activated receptor, gamma, co-activator 1 alpha, and short stature homeobox 2. Whole mount in situ hybridization strengthened a potential down regulation of neuropilin 2 by Lmx1b, but further investigations including in situ hybridization and protein-protein interaction studies will be needed.

SANS (USH1G) in USH-Proteinnetzwerken von Photorezeptorzellen der Vertebratenretina

Das Usher Syndrom (USH) führt beim Menschen zur häufigsten Form erblicher Taub-Blindheit und wird aufgrund klinischer Merkmale in drei Typen unterteilt (USH1-3). Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Expression und subzellulären Lokalisation des USH1G-Proteins SANS („Scaffold protein containing Ankyrin repeats and SAM domain“) in der Retina. Ein weiterer Fokus lag auf der Identifikation neuer Interaktionspartner zur funktionellen Charakterisierung von SANS. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein USH-Proteinnetzwerk identifiziert werden, das im Verbindungscilium und benachbarter Struktur, dem apikalen Innensegment von Photorezeptorzellen lokalisiert ist. Als Netzwerkkomponenten konnten die USH-Proteine SANS, USH2A Isoform b (USH2A), VLGR1b („Very Large G-protein coupled Receptor 1b“, USH2C) sowie Whirlin (USH2D) ermittelt werden. Innerhalb dieses Netzwerkes interagieren die Gerüstproteine SANS und Whirlin direkt miteinander. Die Transmembranproteine USH2A Isoform b und VLGR1b sind durch die direkte Interaktion mit Whirlin in ciliären-periciliären Membranen verankert und projizieren mit ihren langen Ektodomänen in den extrazellulären Spalt zwischen Verbindungscilium und apikalem Innensegment. Darüber hinaus konnte die Partizipation von SANS an Mikrotubuli-assoziiertem Vesikeltransport durch Identifikation neuer Interaktionspartner, wie dem MAGUK-Protein MAGI-2 („Membrane-Associated Guanylate Kinase Inverted-2“) sowie Dynaktin-1 (p150Glued) eruiert werden. Die Funktion des ciliären-periciliären USH-Proteinnetzwerkes könnte demnach in der Aufrechterhaltung benachbarter Membranstrukturen sowie der Beteiligung der Positionierung und Fusion von Transportvesikeln liegen.

Synthetische Glycopeptide mit Sulfatyl-Lewis X-Struktur als potenzielle Inhibitoren der Zelladhäsion

Zelladhäsionsprozesse sind von großer Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie etwa die Immunantwort, die Wundheilung und die Embryogenese. Außerdem spielen sie eine entscheidende Rolle im Verlauf inflammatorischer Prozesse. An der Zelladhäsion sind verschiedene Klassen von Adhäsionsmolekülen beteiligt. Die erste leichte „rollende“ Adhäsion von Leukozyten am Ort einer Entzündung wird durch die Selektine vermittelt. Diese binden über die Kohlenhydrat-Strukturen Sialyl-Lewisx und Sialyl-Lewisa über eine calciumabhängige Kohlenhydrat-Protein-Bindung an ihre spezifischen Liganden und vermitteln so den ersten Zellkontakt, bevor andere Adhäsionsmoleküle (Cadherine, Integrine) die feste Adhäsion und den Durchtritt durch das Endothel bewirken. Bei einer pathogenen Überexpression der Selektine kommt es jedoch zu zahlreichen chronischen Erkrankungen wie z. B. rheumatoider Arthritis, Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder dem Reperfusions-syndrom. Außerdem wird eine Beteiligung der durch die Selektine vermittelten Zellkontakte bei der Metastasierung von Karzinomzellen angenommen. Ein Ansatzpunkt für die Behandlung der oben genannten Erkrankungen ist die Gabe löslicher kompetitiver Inhibitoren für die Selektine. Ziel der Arbeit war die Modifikation des Sialyl-Lewisx-Leitmotivs zur Steigerung der metabolischen Stabilität und dessen Einbau in die Peptidsequenz aus der für die Bindung verantwortlichen Domäne des endogenen Selektin-Liganden PSGL-1. Dazu wurden mit einer modifizierten Lewisx-Struktur glycosylierte Aminosäurebausteine dargestellt (Abb.1). Die Verwendung von Arabinose und des Sulfatrestes anstelle von Fusose und Sialinsäure sollte außerdem zu einer gesteigerten metabolischen Stabilität des synthetischen Liganden beitragen. Die so erhaltenen Glycosylaminosäuren sollten nun in die Festphasenpeptidsynthese eingesetzt werden. Aufgrund der großen säurelabilität konnte hier nicht auf das Standartverfahren (Wang-Harz, Abspaltung mit TFA) zurückgegriffen werden. Deshalb kam ein neuartiges UV-labiles Ankersystem zum Einsatz. Dazu wurde ein Protokoll für die Synthese und Abspaltung von Peptiden an diesem neuen System entwickelt. Daran gelang die Synthese des nichtglycosylierten Peptidrückgrats sowie eines mit der dem sulfatierten Lewisx-Motiv versehenen Glycopeptids. Ein vierfach sulfatiertes Glycopeptid, welches durch den Einsatz von im Vorfeld chemisch sulfatierer Tyrosin-Bausteinen dargestellt werden sollte, konnte massenspektrometrisch nachgewiesen werden.

Identifizierung einer Mutation im Exon 2 des C1q-B-Ketten-Gens als Ursache eines hereditären C1q-Defekts mit Ausbildung einer SLE-ähnlichen Symptomatik

Komplementdefizienzen gehen mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit gegenüber bestimmten Krankheitserregern in den ersten Lebensjahren (MBL-Defizienz) und darüber hinaus (C1q- und anderen Komplementdefizienten) einher. Dies unterstreicht die Rolle des Komplementsystems als effektiver Abwehrmechanismus in der Übergangsphase zwischen Verlust des „mütterlichen Nestschutzes“ und Ausreifung der eigenen „erworbenen“ Immunität. Das Auftreten von Autoimmunerkrankungen wie dem SLE-ähnlichen Syndrom bei Defizienzen des Klassischen Weges beleuchten zusätzliche Funktionen des Komplementsystems während der Ausreifung der erworbenen Immunität und als wesentlicher Effektor in der Erkennung apoptotischer Zellen und deren Eliminierung aus dem System.rnHereditäre C1q-Defizienzen gehen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit mit einem SLE-ähnlichen Syndrom einher. Sie stellen unter den Defizienzen des Komplementsystems eines Seltenheit dar, ihr klinisches „Gesicht“ ist umso eindrucksvoller. Sie sind von der funktionellen C1q-Defizienz im Rahmen eines erhöhten „turnover“ und in der Folge einer C1q-Autoantokörperbildung abzugrenzen. Ursächlich ist ihnen eine Mutation in einem der drei C1q-Gene, die auf dem Chromosom 1 lokalisiert sind. Homozygote Mutationsträger können den Defekt nicht ausgleichen und zeigen eine C1q-Defizienz mit Verlust der gesamthämolytischen Aktivität CH50. Häufungen treten bei Nachkommen von Geschwister- und Verwandtschaftsehen auf.rnrnIn dieser Arbeit wird der Fall einer Patientin mit einem schweren, frühkindlich einsetzenden, SLE-ähnlichen Syndrom aufgearbeitet. Als Ursache für eine Erkrankung konnte ein hereditärer C1q-Defekt, ohne immunologischem Nachweis eines C1q oer LMQ-C1q, identifiziert werden. Da sich keine der vorab beschriebenen Mutatonsmuster bei der Patientin detektieren ließ, erfolgte die Sequenzierung aller drei C1q-Gene. Dadurch ließ sich ein neues Mutationsmuster darstellen.rnrnDie in dieser Arbeit vorgestellte Mutation unterscheidet sich von den bislang beschriebenen Mutationen dadurch, dass es sich nicht um eine Punktmutation, sonder um eine Deletion von 29 Basen (c283_311) im Exon 2 des C1q-B-Ketten-Gens mit einhergehendem Rasterschub und vorzeitigem Stop-Codon (pMet95TrpfsX8) handelt. Durch die Analyse der Eltern und Geschwister der betroffenen Patientin konnte der Vererbungsweg dargestellt werden. Zudem gelang es die Mutation im Rahmen einer Pränataldiagnostik bei einem „ungeborenen“ Geschwisterkind auszuschließen.rn

Optimierung einer partikulären Cytomegalovirus-Vakzine

Pränatale Infektionen mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) sind die häufigste Ursache frühkindlicher Schädigung, noch vor dem Down-Syndrom oder dem fetalen Alkoholsyndrom. Reaktivierung dieses Herpesvirus ist darüber hinaus als lebensbedrohliche Komplikation in der Transplantationsmedizin gefürchtet. Von Experten wurde daher die Entwicklung einer Vakzine vielfach angemahnt. Trotz unterschiedlicher Ansätze zu ihrer Entwicklung ist bisher jedoch kein Impfstoff verfügbar. Die Verwendung von subviralen Dense Bodies (DB) des Virus als Vakzinegrundlage stellt eine vielversprechende Strategie zur HCMV-Impfstoffentwicklung dar. DB enthalten bereits in ihrer natürlichen Form wichtige Zielantigene der humoralen und zellulären Immunantwort gegen HCMV. Durch gezielte Mutation des 230.000 Basenpaare umfassenden Genoms des HCMV konnte in Vorarbeiten der Beweis erbracht werden, dass DB hinsichtlich ihres antigenen Repertoires optimierbar sind. Allerdings waren Immunogenität und erzielte Ausbeuten noch unbefriedigend. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Ansatz der Verwendung modifizierter DB als Impfstoff-Grundlage weiter zu entwickeln und Erkenntnisse über die für die Partikelbildung entscheidenden molekularen Mechanismen zu erarbeiten. In einem ersten Abschnitt wurde der Ansatz der Modifikation von DB durch Insertion heterologer Peptidantigene in das virale Tegumentprotein pp65 verfeinert. Das pp65 ist die mengenmäßig dominante Komponente von DB. Durch Herstellung und Austestung definierter HCMV Mutanten konnte die Position 175 des pp65 als geeignete Insertionsstelle für virale wie für nicht-virale Antigene identifiziert werden. In einem zweiten Schritt der Arbeit wurde die Rolle des pp65 im Verlauf der viralen Vermehrung und Morphogenese näher untersucht. Grundlage für diese Analysen war eine Virusmutante, die eine dominant-negative Variante des pp65 exprimierte. Vergleichende massenspektrometrische Untersuchungen unter Einbeziehung von pp65-kompetenten und pp65-negativen Virusmutanten zeigten, dass pp65 in der spät-infizierten Zelle mit dem viralen RNA-Exportfaktor pUL69 und der virale Kinase pUL97 komplexiert vorkommt. Das pp65 wurde als Substrat von pUL97 identifiziert. Daneben wurden essentielle Proteine des viralen Replikationsapparates, sowie zelluläre Proteine des RNA-Metabolismus und Transports und virale DNA in diesen Komplexen gefunden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass pp65 zu späten Zeitpunkten der viralen Infektion zu Stellen viraler DNA rekrutiert wird und dort regulatorisch in posttranskriptionelle Vorgänge von RNA Prozessierung oder RNA Transport eingreift. Die Hypothese, dass pp65 einen regulatorischen Einfluss auf die RNA-Exportfunktion von pUL69 nimmt, liegt nahe und ist nun in weiteren Analysen prüfbar.

Signaltransduktion von IgG-Antiphospholipid-Antikörpern in plasmazytoiden Dendriten und Monomac1 Zellen

Das Antiphospholipid-Syndrom (APS) ist eine Autoimmunerkrankung die sich durch venöse und arterielle Thrombosen und/oder Spontanaborte bei gleichzeitigem Nachweis von persistierenden, erhöhten Antiphospholipid-Antikörper (aPL)-Titern charakterisieren lässt. Die zugrunde liegenden Mechanismen, über die aPL Pathogenität vermitteln, sind bislang wenig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass drei humane monoklonale IgG aPL sowie IgG Fraktionen von APS Patienten eine Überexpression von TLR7 und TLR8 in plasmazytoiden dendritischen Zellen bzw. monozytären Zellen induzieren. Gleichzeitig erfolgt die Induktion der TLR7/8 Translokation vom endoplasmatischen Retikulum (ER) ins Endosom. Diese Effekte werden durch die Internalisierung der aPL und die nachfolgende Aktivierung einer NADPH Oxidase sowie durch endosomale Superoxid Produktion vermittelt. Als Folge dessen werden die Zellen extrem für TLR7/8 Liganden sensibilisiert. Diese Beobachtungen beschreiben einen neuen Signalmechanismus der innaten Immunität, der seinen Ursprung im Endosom nimmt. Da die Überexpression von TLR7 auch in pDCs von APS Patienten detektiert werden konnte, bieten unsere Ergebnisse eine Erklärung für die proinflammatorischen und prokoagulanten Effekte von aPL. rnWeiterhin führte die kombinierte Stimulation mit aPL und TLR7 Liganden in pDCs zu einem signifikant verstärkten Potential zur CD4+ Th2 Zell Aktivierung bzw. zur Regulation der B-Zell Differenzierung und Immunglobulin Produktion. Die Anwesenheit der pDCs erhöhte dabei synergistisch die CD40/86 Expression, die Proliferation sowie die Plasmazell-Differenzierung von isolierten peripheren B-Zellen, die mit aPL und TLR Liganden stimuliert wurden. Dieser Stimulationsansatz war außerdem ausreichend um naive B-Zellen zur IgM/IgG Produktion anzuregen und die Synthese neuer IgG aPL durch Gedächtnis-B-Zellen einzuleiten. Die Beteiligung der pDCs an diesem Prozess erfolgte durch Zytokin Sekretion sowie direktem Zell-Zell-Kontakt. Die Anwesenheit von Th2-Helferzellen war dabei nicht obligatorisch, konnte jedoch die B-Zell Aktivierung zusätzlich fördern. Eine Hochregulierung von TLR7 oder TLR9 innerhalb der B-Zell Population war nicht involviert. rnrnDiese Ergebnisse zeigen erstmalig die Relevanz einer pDC Aktivierung im Hinblick auf die Aufrechterhaltung der pathogenen Aktivität im Rahmen des APS. Da eine Dysregulierung von TLR7 bereits als ursächlich für die Ausbildung einer systemischen Autoimmunität erachtet wird, sollten unsere Ergebnisse für das generelle Verständnis von Autoimmunität von großer Relevanz sein.rn

Progettazione e implementazione di una applicazione per dispositivi mobili basata su piattaforma android (linguaggio java) a supporto di soggetti affetti da disturbi dello spettro autistico

Nella maggior parte dei casi, i soggetti affetti da Disturbo dello Spettro Autistico hanno un deficit di comunicazione, sia esso verbale o non verbale. Nonostante, ad oggi, non esista una cura per questo disturbo, una diagnosi precoce entro il terzo anno di vita del soggetto e un programma educativo coerente con le necessità del paziente, permettono al bambino con autismo di raggiungere quantomeno le abilità comunicative di base. Recenti studi hanno dimostrato che l’utilizzo di Information and Communication Technology (ICT) nel trattamento di soggetti affetti da Disturbo dello Spettro Autistico può portare molti benefici, dato che, da un lato, computer, tablet e smartphone sono strumenti strutturati e prevedibili e, dall’altro, i sintetizzatori vocali, se presenti, sono privi di inflessioni verbali. A questo proposito, durante il mio tirocinio di tesi magistrale presso l’azienda “CSP – Innovazioni nelle ICT” di Torino, ho sviluppato un’applicazione per tablet Android che permette a psicologi, educatori, logopedisti, insegnanti e genitori di creare tabelle comunicative circostanziate alle esigenze del soggetto e che consente a quest’ultimo di utilizzare questo strumento come efficace mediatore sociale. Questo software si va a inserire in un progetto più ampio, denominato “tools4Autism”, nato dalla collaborazione tra il centro di ricerca di cui sopra, la “Fondazione ASPHI Onlus – ICT per migliorare la qualità di vita delle persone con disabilità” e il “Centro Autismo e Sindrome di Asperger” di Mondovì (CN). L’applicazione prevede principalmente due metodi di utilizzo: il primo, definito “modalità operatore”, è un editor che permette di creare tabelle composte da un numero variabile di immagini che possono essere pittogrammi, fotografie personali, disegni del bambino e possono essere accompagnate o meno da un testo. Una volta create le tabelle, l’operatore ha la possibilità di modificarle, eliminarle, variarne l’ordine, esportarle su altri dispositivi o importare tabelle precedentemente create. Il secondo metodo di utilizzo, definito “modalità utente”, permette al soggetto affetto da Disturbo Autistico di comunicare con altre persone sfruttando le tabelle create dall’operatore coerentemente con le sue necessità. Al tocco dell’immagine da parte del bambino, essa viene evidenziata tramite un contorno rosso e, se abilitato, il sintetizzatore vocale riproduce il testo associato a tale immagine. I principali fattori di innovazione dell’applicazione sono la gratuità, la semplicità di utilizzo, la rapidità nella creazione e nell’aggiornamento delle tabelle comunicative, la portabilità dello strumento e l’utilizzo della sintesi vocale. Il software sarà sperimentato presso il “Centro Autismo e Sindrome di Asperger”, centro di neuropsichiatria infantile specializzato nello studio del Disturbo Autistico. Tale sperimentazione si pone come obiettivo quello di verificare gli effettivi miglioramenti nella velocità e nella qualità di apprendimento delle fondamentali abilità comunicative.

Die Interaktion von VHL und PTEN bei der Tumorinitiation und Progression

Das VHL-Syndrom umfasst Erkrankungen, die mit einem Funktionsverlust von VHL einhergehen. Das Tumorspektrum umfasst retinale und zerebrale Hämangioblastome, Nierenzysten und klarzellige Nierenkarzinome, Zysten und Tumore des Pankreas, Phäochromocytome, Adenome der Hoden und Tumore des Mittelohrs. Obwohl aufgrund klinischer Studien bekannt ist, welche VHL-Mutation mit welchen Neoplasien assoziiert werden können, konnte bisher kein VHL-Mausmodell das Krankheitsbild des VHL-Syndroms widerspiegeln. Daher ist vermutlich eine zusätzliche Fehlregulation weiterer Gene nötig ist, um die Tumorgenese in den verschiedenen Geweben zu induzieren. In mehreren klarzelligen Nierenkarzinomen konnte bereits eine PTEN-Defizienz nachgewiesen werden, der Verlust von PTEN wird außerdem auch mit der Tumorgenese von Phäochromocytomen assoziiert. Möglicherweise wirken VHL und PTEN also in der Tumorsuppression in der Niere und der Nebenniere zusammen.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals eine VHL-vermittelte Stabilisierung der PTEN-Konzentration sowohl in embryonalen als auch in Tumor-Zellen der Niere nachgewiesen werden. Die Analyse des Regulationsmechanismus ergab erstens eine Hypoxie-abhängige Abnahme der Transkription von PTEN. Des Weiteren konnte eine VHL-vermittelte Ubiquitinylierung von NEDD4-1, welches als E3-Ligase von PTEN dessen Degradation und Kerntransport reguliert, ermittelt werden. rnIn Nierenkarzinom-Zellen wurde weiterhin eine VHL- bzw. PTEN-Restitution induziert, um die Auswirkungen der beiden Tumorsuppressoren auf das Zellverhalten in vitro und in vivo zu untersuchen. Sowohl VHL als auch PTEN hatten dieselben Effekte lediglich in unterschiedlicher Intensität auf das Verhalten der Zellen. So konnte VHL- und PTEN-abhängig eine Verstärkung der Adhäsion, eine Inhibierung der Migration und eine Verminderung der Überlebens- und Metastasierungsfähigkeit nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Mausmodelle mit einem ubiquitären, heterozygoten Pten-Verlust generiert, die teilweise eine zusätzliche Haploinsuffizienz von Vhl bzw. eine heterozygote VHL Typ II-Mutation (V2B oder V2C) trugen. Sporadisch entwickelten diese Mäuse Vhl-abhängig Lebertumore und Pten-abhängig Lymphome und Ovarialkarzinome. Einige Mäuse mit einer kombinierten Vhl- und Pten-Defizienz bildeten zusätzlich Nierenzysten aus, die teilweise das gesamte Volumen der Niere einnahmen. Besonders häufig entstanden in Pten-haploinsuffizienten Mäusen Phäochromocytome, die durch eine zusätzliche V2B- oder V2C-Mutation in gleichaltrigen Mäusen deutlich weiterentwickelt waren. Demnach induziert erst der gemeinsame Verlust von Vhl und Pten die Bildung von Nierenzysten und Phäochromocytomen, welche dem Krankheitsbild des VHL-Syndroms zugeordnet werden.rnDie Untersuchungen innerhalb dieser Arbeit zeigen erstmalig die Interaktion und Kooperation von VHL und PTEN in der Tumorsuppression. Die Resultate bieten außerdem die Grundlage für weitere Analysen der Auswirkung der VHL-vermittelten PTEN-Stabilisierung und für detailliertere Untersuchungen der durch die kombinierte Vhl- und Pten-Defizienz induzierten Neoplasien der Niere und der Nebennieren-Tumore in in vivo Mausmodellen.rn