Crecimiento compensatorio en juveniles de la langosta de agua dulce pinzas rojas Cherax quadricarinatus (Decapoda, Parastacidae) y sus aplicaciones al cultivo

Un adecuado manejo alimenticio es determinante en el éxito en la acuicultura, dado que el consumo de alimentos influye directamente en el crecimiento y en la conversión alimenticia de los organismos. En una producción semi-intensiva e intensiva, los costos de alimentación representan hasta el 80 por ciento del total y por esta razón un manejo alimenticio alternativo al habitualmente empleado (alimentación diaria) puede ser una estrategia viable para reducir dichos costos. Explorar el crecimiento compensatorio en los organismos después de una reducción en la cantidad de alimento suministrado es una herramienta que puede ser utilizada para dicho fin. Los juveniles tempranos de la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus presentaron la capacidad de compensar tanto un moderado como prolongado periodo de restricción alimenticia (alimentación intermitente)y los mecanismos involucrados fueron la hiperfagia y la mayor conversión alimenticia. La recuperación del crecimiento fue total o parcial, dependiendo de la extensión del periodo de alimentación diaria post-restricción (periodo de recuperación). La aplicación de un período de recuperación fue imprescindible para inducir la capacidad compensatoria en esta especie. De los factores que modulan el crecimiento compensatorio, se observó que las dietas altamente proteicas no afectan dicha capacidad, así como las tres temperaturas ensayadas (inferior a la óptima, óptima y superior a la óptima, para el crecimiento de la especie). La talla tampoco afectó dicha capacidad, pero, influye en la severidad de la respuesta del periodo restricción y consecuentemente en el tiempo de recuperación. La restricción no causó severas alteraciones en la estructura, composición bioquímica y actividad de las enzimas digestivas de la glándula digestiva, lo que refleja que estos juveniles no presentarían deficiencias nutricionales. La alta supervivencia observada en los juveniles que compensan es otro indicador de que tanto la restricción alimenticia como la propia compensación no causan posteriores daños en el organismos.

Unidade de Estudos de Mastites em Pequenos Ruminantes - estudos em ovinos de regime extensivo

A “Unidade de Estudo de Mastites em Pequenos Ruminantes”, formalmente constituída no âmbito do Programa Nacional de Re-equipamento Científico, da Fundação para a Ciência e a Tecnologia, vem dar corpo ao trabalho de colaboração de diversas equipas de investigação que se têm debruçado sobre a problemática das infecções intramamárias em pequenos ruminantes, nos seus aspectos de saúde animal, saúde pública veterinária e qualidade e segurança alimentar. Tem como principal objectivo criar condições para o desenvolvimento de trabalhos de investigação e divulgação científica que contribuam para reduzir a prevalência de mastites em pequenos ruminantes e assim melhorar a produção e a qualidade do leite, favorecendo produtores de leite, produtores de queijo e consumidores. Entre os trabalhos já realizados, pela equipa científica, destaca-se o isolamento e identificação de agentes etiológicos de mastite em ovelhas e estudos epidemiológicos relativos a esta afecção, o estudo de factores de virulência nas bactérias mais relevantes, o estudo dos mecanismos de infecção e a resposta imunológica local e sistémica do hospedeiro. O estudo da etiologia e da fisiopatologia da mastite ovina, com o objectivo de compreender a modulação da resposta imunitária da glândula mamária, poderá contribuir para o desenvolvimento de métodos de controlo com base na estimulação da resposta imunitária, alternativos ao uso de antibióticos.

Mastites ovinas: Epidemiologia, factores de virulência e antigénios imunorrelevantes de agentes etiológicos

O presente trabalho teve como objectivo o estudo da prevalência de mastites ovinas em explorações do Alentejo e a identificação dos agentes etiológicos, seus factores de virulência e epitopos imunorrelevantes. A prevalência de mastite clínica e subclínica foi 1,7% e 32,2%, respectivamente. O agente etiológico mais prevalente foi Staphylococcus epidermidis (N=115), tendo sido também identificados Staphylococcus aureus (N=27) e Streptococcus agalactiae (N=17). A pesquisa de factores de virulência permitiu identificar os padrões de susceptibilidade (N=404) e as Concentrações Inibitórias Mínimas de princípios activos (N=130). De 109 isolados de Staphylococcus epidermidis; oito revelaram capacidade para produzir biofilme in vitro. Os isolados estudados aderiam e eram internalizados por células epiteliais mamárias (N=12). A pesquisa de cinco superantigénios resultou negativa (N=27). Foram estudados os perfis proteicos de Staphylococcus epidermidis, tendo sido identificados os epitopos imunorrelevantes, reconhecidos por imunoglobulinas séricas e mamárias. Verificou-se uma resposta imunológica local específica nos animais infectados./SUMMARY - OVINE MASTITIS: EPIDEMIOLOGY, VIRULENCE FACTORS AND IMMUNORELEVANT ANTIGENES OF AETIOLOGICAL MICRORGANISMS The present work aimed at investigating the prevaleance of ovine mastitis in farms from Aletenjo and the identification of causative microrganisms, their virulence factors and immunorelevant epitopes. The preva lence of clinical and subclinical mastitis was 1.7% and 32.2%,respect ively. The most preva lent aet iologica l agent was Staphylococcus epidermidis (N=115); Staphylococcus aureus (N=27) and Streptococcus agalactiae (N=17) were also identified. The investigation of virulence factors allowed the identification of susceptibility patterns (N=404) and drug Minimal Inhibitory Concentrations (N=130). From 109 Staphylococcus epidermidis isolates; eight showed the ability to produce biofilm in vitro. The isolates studied adhered and were internalised by mammary epithelial cells (N=12). None of the five superantigens studied was detected (N=27). The protein profile of Staphylococcus epidermidis was determined, and the immunorelevant epitopes, recognised by blood and milk immunoglobulins, were identified. It was possible to detect a specific local immune response in infected animals.

Determinant factors for the use of imposex in TBT pollution monitoring

Os compostos de tributilestanho (TBT) foram utilizados como biocidas em tintas antivegetativas (AV) e amplamente aplicados, durante décadas, de forma a evitar a bioincrustação em superfícies submersas, principalmente em cascos de embarcações. Os seus efeitos deletérios em organismos não-alvo tornaram-se evidentes após o aparecimento de gastrópodes prosobrâquios com imposex – sobreposição de caracteres sexuais masculinos sobre o tracto reprodutivo das fêmeas. Desde então, a expressão do imposex em prosobrânquios tem sido amplamente utilizada como biomarcador da poluição por TBT. Um dos objectivos da presente tese é avaliar se as mais recentes restrições legais na utilização das tintas AV com compostos organoestânicos (OTs) resultaram numa redução da poluição pelos mesmos na costa continental Portuguesa. Para tal, foi levada a cabo a análise da variação temporal do imposex como biomarcador dos níveis ambientais de TBT e a validação de procedimentos, de modo a seguir de forma precisa a evolução da intensidade deste fenómeno ao longo do tempo. O trabalho de investigação teve início no momento em que a ineficácia da legislação anterior (Directiva 89/677/CEE) na redução da poluição por TBT no litoral Português era reportada na literatura e quando estavam já agendados instrumentos decisivos para a diminuição definitiva deste tipo de poluição: o Regulamento (CE) N.º 782/2003 do Parlamento e do Conselho da União Europeia (UE) que bania as tintas AV baseadas em TBT na sua frota a partir de 1 de Julho de 2003; a "Convenção Internacional sobre o Controlo de Sistemas Antivegetativos Nocivos em Navios” (Convenção AFS), adoptada em 2001 pela Organização Marítima Internacional (OMI), que procurava erradicar os OTs da frota mundial até 2008. Os níveis de imposex e as concentrações de OTs nos tecidos de fêmeas de Nucella lapillus foram medidos em 17 locais de amostragem ao longo da costa Portuguesa em 2003, a fim de se avaliarem os impactos do TBT nas populações desta espécie e de se criar uma base de dados para seguir a sua evolução futura. O índice da sequência do vaso deferente (VDSI), o índice do tamanho relativo do pénis (RPSI) e a percentagem de fêmeas afectadas por imposex (%I) foram utilizados na medição da intensidade deste fenómeno em cada local de amostragem e os seus valores variaram entre 0,20-4,04, 0,0- 42,2% e 16,7-100,0%, respectivamente. Foram encontradas fêmeas estéreis em 3 locais de amostragem, com percentagens a variar entre 4,0 e 6,2%. As concentrações de TBT e dibutilestanho (DBT) nas fêmeas variaram respectivamente entre 23-138 e <10-62 ng Sn.g-1 de peso seco, e o conteúdo em TBT nos tecidos revelou-se significativamente correlacionado com o imposex (nomeadamente com o RPSI e o VDSI). Os níveis de expressão do fenómeno e o conteúdo em OTs nos tecidos, foram superiores na proximidade de portos, confirmando as conclusões obtidas anteriormente por outros autores de que os navios e a actividade dos estaleiros são as principais fontes destes compostos no litoral Português. As infra-estruturas associadas ás principais fontes de OTs – portos, estaleiros e marinas – estão geralmente localizadas no interior de estuários, motivo pelo qual estas áreas têm vindo a ser descritas como as mais afectadas por estes poluentes. Por esta razão, foi levado a cabo o estudo pormenorizado da poluição por TBT na Ria de Aveiro, como caso de estudo representativo da poluição por estes compostos num sistema estuarino em Portugal continental. N. lapillus foi usada como bioindicador para avaliar a tendência temporal da poluição por TBT nesta área entre 1997 e 2007. Foi registada uma diminuição da intensidade do imposex após 2003, embora as melhorias mais evidentes tenham sido observadas entre 2005 e 2007, provavelmente devido à implementação do Regulamento (CE) N.º 782/2003 que proibiu a aplicação de tintas AV com TBT em navios com a bandeira da UE. Apesar desses progressos, as análises ao conteúdo em OTs nos tecidos de fêmeas de N. lapillus e em amostras de água colhidas em 2006 indicaram contaminação recente por TBT na área de estudo, evidenciando assim a permanência de fontes de poluição. A utilização de N. lapillus como bioindicador da poluição por TBT na Ria de Aveiro apresenta algumas limitações uma vez que a espécie não ocorre nas áreas mais interiores da Ria e não vive em contacto com sedimentos. Assim, a informação obtida a partir da sua utilização como bioindicador é fundamentalmente relativa aos níveis de TBT na coluna de água. Foi então necessário recorrer a um bioindicador complementar – Hydrobia ulvae – para melhor avaliar a evolução temporal da poluição por TBT no interior deste sistema estuarino e estudar a persistência de TBT nos sedimentos. Não foi registada uma diminuição dos níveis de imposex em H. ulvae na Ria de Aveiro entre 1998 e 2007, apesar da aplicação do Regulamento (CE) N.º 782/2003. Pelo contrário, houve um aumento global significativo da percentagem de fêmeas afectadas por imposex e um ligeiro aumento do VDSI, contrastando com o que tem sido descrito para outros bioindicadores na Ria de Aveiro no mesmo período. Estes resultados mostram que a diferente biologia/ecologia das espécies indicadoras determina vias distintas de acumulação de TBT, apontando a importância da escolha do bioindicador dependendo do compartimento a ser monitorizado (sedimento versus água). A ingestão de sedimento como hábito alimentar em H. ulvae foi discutida como sendo a razão para a escolha da espécie como indicadora da contaminação dos sedimentos por TBT. Foram também estudados os métodos mais fiáveis para reduzir a influência de variáveis críticas na medição dos níveis de imposex em H. ulvae. As comparações de parâmetros do imposex baseados em medições do pénis devem ser sempre realizadas sob condições de narcotização bem standardizadas uma vez que este procedimento provoca um aumento significativo do comprimento do pénis (PL) em ambos os sexos. O VDSI, a % e o PL em ambos os sexos revelaram ser fortemente influenciados pelo tamanho dos espécimes: a utilização de fêmeas mais pequenas conduz à subestimação do VDSI, da %I e do PL, enquanto que diferenças no tamanho dos machos provocam variações no índice do comprimento relativo do pénis (RPLI), independentemente dos níveis de poluição por TBT. Existe, portanto, a necessidade de controlar algumas variáveis envolvidas na análise do imposex que mostraram afectar a fiabilidade dos resultados. Uma vez que N. lapillus é o principal bioindicador dos efeitos biológicos específicos do TBT para a área da OSPAR, foi também estudada a influência de algumas variáveis na avaliação dos níveis de imposex nesta espécie, especificamente as relacionadas com o ciclo reprodutor e o tamanho dos espécimes. O estudo do ciclo reprodutor e a variação sazonal/espacial do comprimento do pénis do macho (MPL) incidiu num único local no litoral Português (Areão – região de Aveiro) de forma a avaliar se o RPSI varia sazonal e espacialmente na mesma estação de amostragem e se tais variações influenciam os resultados obtidos em programas de monitorização do imposex. Nos meses de Dezembro de 2005 a Junho de 2007, foram encontrados espécimes de N. lapillus sexualmente maturos e potencialmente aptos para a reprodução. Contudo, foi também evidente um padrão sazonal do ciclo reprodutor – o estado de desenvolvimento da gametogénese nas fêmeas variou sazonalmente e ocorreu uma diminuição do volume da glândula da cápsula e do factor de condição no final do Verão / início do Outono. Contrariamente, a gametogénese nos machos não apresentou variação sazonal significativa, embora os valores mais baixos do factor de condição, do comprimento do pénis e dos volumes de esperma e da próstata tenham também sido registados no final do Verão / início do Outono. Além disso, o MPL mostrou variar, no mesmo local de amostragem, inversamente com a distância aos ninhos de cápsulas ovígeras; um aumento dos valores do MPL foi também observado em espécimes de maior tamanho. Todas estas variações no MPL introduzem desvios nos resultados da avaliação do imposex quando é usado o RPSI. A magnitude do erro envolvido foi quantificada e revelou-se superior em locais com níveis mais elevados de poluição por TBT. Apesar do RPSI ser um índice que fornece informação importante sobre os níveis de poluição por TBT, a sua interpretação deve ser cuidadosa e realizada complementarmente com os outros índices, destacando-se o VDSI como índice mais fiável e com significado biológico mais expressivo. Novas campanhas de monitorização do imposex em N. lapillus foram realizadas ao longo da costa Portuguesa em 2006 e 2008, e os resultados subsequentemente comparados com a base de dados criada em 2003,de forma a avaliar a evolução da poluição por TBT no litoral Português naquele período. Nestes estudos foram aplicados novos procedimentos na monitorização e tratamento dos dados, de forma a minimizar a variação nos índices de avaliação do imposex induzida pelos factores acima descritos, para seguir com maior consistência a tendência da poluição por TBT entre 2003 e 2008. Foi observado um declínio global significativo na intensidade de imposex na área de estudo durante o referido período e a qualidade ecológica da costa Portuguesa, segundo os termos definidos pela Comissão OSPAR, revelou melhorias notáveis após 2003 confirmando a eficácia do Regulamento (CE) N.º 782/2003. Não obstante, as populações de N. lapillus revelaram-se ainda amplamente afectadas por imposex, tendo sido detectadas emissões de TBT na água do mar ao longo da costa em 2006, apesar da restrição anteriormente referida. Estes inputs foram atribuídos principalmente aos navios que à data ainda circulavam com tintas AV com TBT aplicadas antes de 2003, uma vez que a sua utilização nas embarcações foi apenas proibida em 2008. Considerando que o Regulamento (CE) N.º 782/2003 constitui uma antecipação da proibição global da OMI que entrou em vigor em Setembro de 2008, prevê-se, por analogia, que haja uma rápida diminuição da poluição por TBT à escala mundial num futuro próximo. Na sequência desta previsão, é apresentada uma discussão teórica preliminar relativamente ás possíveis estratégias usadas por N. lapillus na recolonização de locais onde, no passado, as populações terão aparentemente sido extintas devido a níveis extremamente elevados de TBT. Estes locais são tipicamente zonas abrigadas junto de infra-estruturas portuárias, cuja recolonização por esta espécie será provavelmente muito lenta dada a mobilidade reduzida dos adultos e o ciclo de vida não apresentar fase larvar pelágica. Foram então equacionadas duas hipotéticas vias de recolonização de zonas abrigadas por espécimes provenientes de populações de costa aberta/exposta: a migração de adultos e/ou a dispersão de juvenis. No entanto, em ambos os casos, estaria implicada a transposição de um problema amplamente descrito na bibliografia: as populações de N. lapillus de costa aberta podem apresentar um fenótipo muito diferente das de zonas abrigadas, podendo inclusivamente variar no número de cromossomas. A recolonização pode portanto não ter sucesso pelo simples facto dos novos recrutas não estarem bem adaptados aos locais a recolonizar. Para analisar este problema, foram estudados tanto a forma da concha de espécimes de N. lapillus ao longo da costa Portuguesa como o respectivo número de cromossomas. Embora a forma da concha tenha revelado diferenças, de acordo com o grau de hidrodinamismo entre as populações de N. lapillus avaliadas, o cariótipo 2n = 26, típico de zonas expostas, foi registado em todos os locais amostrados. Por outro lado, foi também testada em laboratório a possível mortalidade de juvenis em dispersão no interior menos salino dos estuários. Foi então verificada a ocorrência de mortalidade elevada de juvenis expostos a salinidades baixas (=100% após 1 hora a salinidades ≤9 psu), o que também pode comprometer a recolonização de zonas estuarinas menos salinas por esta via. Mesmo assim, os juvenis mostraram um comportamento de flutuação à superfície da água em condições laboratoriais, que pode ser considerado um benefício específico na colonização de áreas mais internas dos estuários, se tal facto vier a ser confirmado em estudos de campo. As conclusões deste estudo contribuem certamente para a descrição do final da “história do TBT” dado que, uma vez controlados alguns factores determinantes no uso do imposex como biomarcador, a avaliação do declínio da poluição por estes compostos, agora esperado à escala global, se torna mais rigorosa.

Novos métodos de síntese de 4-quinolonas e benzo[b]acridonas

As 4-quinolonas e as acridonas são duas importantes famílias de compostos heterocíclicos azotados naturais que apresentam uma variedade de importantes aplicações biológicas. As 4-quinolonas têm sido objecto de extensos estudos devido às suas potenciais aplicações como fortes agentes citotóxicos, antimitóticos e anti-plaquetários e como protectores cardiovasculares, mas o seu uso é principalmente como antibióticos de largo espectro. As acridonas são conhecidas por apresentarem importante actividade antiviral, antiparasitária, contra a leishmania e a malária, e anticancerígena. A variedade de importantes aplicações biológicas das 4-quinolonas e das acridonas e a contínua procura pela comunidade científica de novas substâncias com actividades biológicas atractivas destaca estes compostos como alvos interessantes para a preparação de novos derivados e/ou para o desenvolvimento de novos métodos de síntese destas duas famílias de compostos. No primeiro capítulo desta dissertação descreve-se a síntese dos compostos de partida que tiveram de ser previamente preparados para o desenvolvimento das novas rotas de síntese apresentadas nos capítulos seguintes. A 4-cloro-3- formilquinolina foi obtida através da reacção de Vilsmeier-Haack da 2’-aminoacetofenona enquanto que a 3-formilquinolin-4(1H)-ona foi facilmente preparada por hidrólise ácida da anterior. Foi necessário proteger o grupo amina da quinolin-4(1H)-ona para evitar reacções secundárias e foram descritas as reacções de protecção com o grupo metilo, etoxicarbonilo e ptoluenossulfonilo. Os 2,2-dióxidos de 1,3-di-hidrobenzo[c]tiofeno, necessários para o estudo das reacções de Diels-Alder, não se encontram disponíveis comercialmente e a sua síntese é também descrita. No segundo capítulo reporta-se uma nova e eficiente rota de síntese de (Z)- e (E)-3-estirilquinolin-4(1H)-onas a partir da reacção de Wittig da 4-cloro-3- formilquinolina e de 3-formilquinolin-4(1H)-onas com benzilidenotrifenilfosforanos. As (Z)-3-estirilquinolin-4(1H)-onas foram obtidas com elevada diastereoselectividade a partir da reacção das 3-formilquinolin- 4(1H)-onas N-protegidas enquanto que as (E)-3-estirilquinolin-4(1H)-onas foram preparadas através da reacção de Wittig da 4-cloro-3-formilquinolina seguida da hidrólise ácida das respectivas (Z)- e (E)-4-cloro-3-estirilquinolinas obtidas. Ambas as rotas sintéticas são eficientes, independentemente dos substituintes dos benzilidenotrifenilfosforanos. No terceiro capítulo, descreve-se um novo método de síntese de novas benzo[b]acridonas a partir da reacção de Diels-Alder de 3-formilquinolin-4(1H)- onas N-protegidas, que actuam como dienófilos, com dienos altamente reactivos, os orto-benzoquinodimetanos, preparados in situ através da extrusão térmica do dióxido de enxofre dos respectivos 2,2-dióxidos de 1,3-dihidrobenzo[ c]tiofeno. A reacção de cicloadição das 3-formilquinolin-4(1H)-onas N-protegidas com orto-benzoquinodimetanos origina as benzo[b]-1,6,6a,12atetra- hidroacridin-12(7H)-onas esperadas, que são o resultado da referida cicloadição seguida de desformilação in situ, e mostrou ser eficiente apenas quando o grupo amina está derivatizado com um grupo sacador de electrões. A desidrogenação destas benzo[b]-1,6,6a,12a-tetra-hidroacridin-12(7H)-onas em dimetilsulfóxido utilizando uma quantidade catalítica de iodo foi também descrita e originou como produto principal as benzo[b]acridin-12(7H)-onas N-desprotegidas. Todos os compostos novos sintetizados foram caracterizados por diversas técnicas analíticas, especialmente por estudos espectroscópicos de ressonância magnética nuclear (RMN), incluindo espectros de 1H e 13C, bidimensionais de correlação espectroscópica homonuclear e heteronuclear e de efeito nuclear de Overhauser (NOESY). Foram também efectuados, sempre que possível, espectros de massa (EM) e análises elementares ou espectros de massa de alta resolução (EMAR) para todos os compostos novos sintetizados. O tautomerismo da 3-formil- e 3-estirilquinolin-4(1H)-onas e as isomerizações (E) (Z) e rotacional das 3-estirilquinolin-4(1H)-onas e das 4-cloro-3-estirilquinolinas foram estudados através de ressonância magnética nuclear experimental (RMN 1H e 13C) e teórica [B3LYP/6-311++G(d,p)].

Preparation of new materials by heterogeneous modification of cellulose

O presente trabalho teve como principal objectivo estudar a modificação química heterogénea controlada de fibras de celulose com diferentes reagentes de modo a alterar as suas propriedades de superfície, em especial em termos da criação de um carácter hidrofóbico e lipofóbico, preservando, sempre que possível, as suas propriedades mecânicas e, consequentemente, abrindo novas perspectivas de aplicação. O desenvolvimento do trabalho envolveu três abordagens principais, envolvendo, em cada caso, o estudo de diferentes condições reaccionais. Na primeira abordagem foram utilizados como reagentes de modificação compostos perfluorados, nomeadamente o anidrido trifluoroacético (TFAA), o cloreto de 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoílo (PFBz) e o cloreto de 3,3,3- trifluoropropanoílo (TFP), para promover a acilação heterogénea da superfície das fibras. A segunda estratégia usada consistiu na preparação de híbridos de celulose do tipo orgânico-inorgânico classe-II, através da modificação das fibras de celulose com o (3-isocianatopropil)trietoxissilano (ICPTEOS), um reagente organossilano bifuncional. A ligação às fibras de celulose foi efectuada através das funções isocianato e, posteriormente, os grupos etoxissilano foram sujeitos a tratamentos de hidrólise ácida, como tal ou na presença de outros siloxanos, nomeadamente o tetraetoxissilano (TEOS) e o 1H,1H,2H,2Hperfluorodeciltrietoxissilano (PFDTEOS). Finalmente, a última abordagem foi baseada na modificação das fibras com triclorometilssilano (TCMS), através de uma reacção gás-sólido, que dispensou assim o uso de solventes orgânicos. A ocorrência de modificação química foi em cada caso confirmada por Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier e Reflectância Total Atenuada (FTIR-ATR), Análise Elementar (EA) e determinação de ângulos de contacto. Adicionalmente, e dependendo de cada caso específico, diversas outras técnicas foram empregues na caracterização aprofundada dos materiais preparados, nomeadamente Ressonância Magnética Nuclear CPMAS no Estado Sólido (RMN), Espectroscopia de Difracção de Raios-X (XRD), Análise Termogravimétrica (TGA), Espectrometria de Massa de Iões Secundários com Análise de Tempo de Vôo (ToF-SIMS), Espectroscopia Fotoelectrónica de Raios-X (XPS) e Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM). Relativamente à acilação das fibras de celulose com reagentes perfluorados, o sucesso da reacção foi comprovado por FTIR-ATR, EA, XPS e ToF-SIMS. Neste contexto, obtiveram-se fibras modificadas possuindo graus de substituição (DS) compreendidos entre 0.006 e 0.39. Verificou-se por XRD que, em geral, mesmo para os valores de DS mais elevados, a cristalinidade das fibras não foi afectada, indicando que a modificação foi limitada às camadas mais superficiais das mesmas ou a regiões amorfas das suas camadas mais internas. Adicionalmente, observou-se por ToF-SIMS que a distribuição dos grupos perfluorados à superfície das fibras foi, de facto, bastante heterogénea. Todos os derivados de celulose perfluorados apresentaram elevada hidrofobicidade e lipofobicidade, tendo-se atingido ângulos de contacto com água e diiodometano de 126º e 104º, respectivamente. Um aspecto interessante relativo a estes materiais é que a elevada omnifobicidade foi observada mesmo para valores de DS muito reduzidos, não se mostrando significativamente afectada pelo aumento dos mesmos. Em consonância, verificou-se por XPS que a cobertura da superfície das fibras de celulose com grupos perfluorados aumentou apenas ligeiramente com o aumento do DS, apontando para a esterificação de camadas mais internas das fibras, associada, neste caso, predominantemente aos seus domínios amorfos. No que diz respeito à estabilidade hidrolítica destes derivados, obtiveram-se dois tipos distintos de comportamento. Por um lado, as fibras de celulose trifluoroacetiladas são facilmente hidrolisáveis em meio neutro, e, por outro, as fibras pentafluorobenzoiladas e trifluoropropanoiladas mostram-se bastante resistentes face a condições de hidrólise em meio neutro e ácido (pH 4), podendo, contudo, ser facilmente hidrolisadas em meio alcalino (pH 9 e 12, para derivados do PFBz e do TFP, respectivamente). Na segunda abordagem verificou-se a ocorrência de reacção por FTIR-ATR e EA. Em geral, a modificação química com ICPTEOS ocorre predominantemente nas zonas mais superficiais das fibras de celulose ou em regiões amorfas. Contudo, em condições reaccionais mais severas (maior quantidade de reagente e tempo de reacção), esta atingiu também regiões cristalinas, afectando, consequentemente, a estrutura cristalina das fibras, como verificado por XRD. Por RMN de 29Si observou-se que após reacção com o ICPTEOS já existiam indícios de alguma hidrólise dos grupos etoxissilano, e que a sua subsequente condensação parcial tinha levado à formação de uma película inorgânica em redor das fibras (verificado por SEM), constituída maioritariamente por estruturas lineares, com uma contribuição mais modesta de estruturas “diméricas” e outras mais ramificadas. Consequentemente, este revestimento inorgânico transformou as fibras de celulose em materiais híbridos com elevada hidrofobicidade (ângulos de contacto com água entre 103-129º). A hidrólise ácida dos restantes grupos etoxissilano, como tal ou na presença de TEOS, originou híbridos de celulose com elevada hidrofilicidade, sendo impossível medirem-se os ângulos de contacto com água dos produtos finais, devido à presença maioritária de grupos silanol (Si-OH) e ligações Si-O-Si à superfície, os quais contribuíram para o consequente aumento de energia de superfície. No entanto, quando a hidrólise foi realizada na presença de PFDTEOS, obtiveram-se materiais híbridos com elevada hidrofobicidade e lipofobicidade (ângulos de contacto com água e diiodometano de 140º e 134º, respectivamente), devido à combinação da presença de grupos perfluorados e micro- e nano-rugosidades na superfície das fibras de celulose, conforme confirmado por SEM. Finalmente, a última abordagem permitiu preparar materiais derivados de celulose altamente hidrofóbicos e lipofóbicos (ângulos de contacto com água e diiodometano de 136º e 109º, respectivamente) por um processo simples, envolvendo tempos de tratamento tão curtos como 0.5 min. Este comportamento omnifóbico foi gerado pelo efeito sinergético entre a diminuição de energia de superfície das fibras, devido à presença de grupos metilo dos resíduos de TCMS ligados a estas, e a condensação dos resíduos de TCMS na forma de micro- e nano-partículas inorgânicas, que levou à criação de um revestimento rugoso à superfície das fibras, conforme observado por RMN de 29Si e SEM, respectivamente. A pré-humidificação das fibras de celulose demonstrou desempenhar um importante papel de “acelerador” dos processos de hidrólise e condensação das moléculas de TCMS. Nestas condições, o tempo de tratamento foi um dos parâmetros mais relevantes, pois para tempos de tratamento muito curtos (0.5 min) os materiais resultantes não apresentaram quaisquer diferenças a nível de propriedades físico-químicas em relação ao substrato de partida (a humidade em excesso consumiu todo o TCMS antes que este conseguisse reagir com os grupos hidroxilo das fibras de celulose), possuindo, por exemplo, valores de ângulos de contacto com água idênticos. Para tempos de tratamento mais longos, como 30 min, os materiais finais apresentaram a maior quantidade de componentes inorgânicos, tal como verificado por EA e TGA. Assim, o controlo da humidade das fibras é imperativo para se poder moldar as propriedades finais dos produtos. Esta última abordagem é particularmente promissora uma vez que tem como base um sistema simples e “verde” que pode ser facilmente implementado. Em conclusão, este trabalho permitiu demonstrar que a modificação química heterogénea controlada das fibras de celulose representa uma iniciativa promissora para a preparação de novos materiais obtidos a partir de recursos renováveis, com propriedades interessantes e passíveis de ser potencialmente aplicados em diferentes áreas. Para além do mais, as estratégias de modificação estudadas podem também ser precursoras de novos estudos que possam vir a ser desenvolvidos dentro do mesmo âmbito.

Effect of water chemistry on the physiology and toxicity assessment in Daphnia

Todos os sistemas aquáticos estão potencialmente expostos a alterações nos parâmetros da água em consequência de fenómenos ambientais tais como deposição ácida, lixiviação de iões dos solos e alterações climáticas. Dado que os parâmetros químicos da água estão geralmente correlacionados, é pertinente estudar os seus efeitos combinados para o biota aquático. Assim, o principal objetivo desta tese é avaliar a importância ecológica da variação simultânea dos principais parâmetros fisico-químicos da água nos parâmetros de história de vida dos crustáceos tanto na ausência como na presença de metais. Foram estudados os seguintes parâmetros: dureza (0.5 - 3.5 mM), alcalinidade (0.3 - 2.3 mM), pH (5.7 - 9.0) e temperatura (13 - 30ºC). A Daphnia magna foi usada como espécie modelo representando os crustáceos aquáticos. A variação simultânea da dureza e alcalinidade afetou significativamente o crescimento, reprodução e crescimento populacional de Daphnia; no entanto, os efeitos da dureza excederam os efeitos da alcalinidade. Pareceu haver interação entre a dureza e alcalinidade na reprodução dos dafnídeos, o que sugere que os efeitos da variação da dureza para Daphnia e provavelmente outros crustáceos poderão depender do nível de alcalinidade. O pH e dureza da água exerceram efeitos combinados para Daphnia, sendo os efeitos do pH mais pronunciados do que os efeitos da dureza. A diminuição do pH reduziu a sobrevivência, crescimento, reprodução, taxa de ingestão e crescimento populacional dos dafnídeos. No entanto, os efeitos do pH baixo foram mais adversos a baixa dureza, o que sugere uma interação entre estes parâmetros. Assim, a diminuição do pH em lagos de água mole pode ser um estressor determinante para os crustáceos sensíveis à acidez, ameaçando a sua sobrevivência e, consequentemente, afetando a estrutura das cadeias alimentares aquáticas. A temperatura e a química da água (dureza e alcalinidade) interagiram entre si nos parâmetros de história de vida de Daphnia; no entanto, os efeitos da temperatura excederam os efeitos da química da água. De um modo geral, temperaturas extremas reduziram o crescimento, reprodução e, consequentemente, o crescimento populacional de Daphnia. Os efeitos do aumento da temperatura foram mais adversos a baixa dureza e alcalinidade, aumentando a preocupação com os efeitos ecológicos do aquecimento global em águas moles. A dureza e alcalinidade da água também desempenharam um papel importante na toxicidade aguda e subletal (inibição da ingestão) dos metais para Daphnia. A diminuição da dureza aumentou a toxicidade aguda do zinco. Por outro lado, a diminuição da alcalinidade aumentou a toxicidade aguda e subletal do cobre, mas reduziu a toxicidade subletal do zinco, tornando evidente o importante papel da alcalinidade na toxicidade subletal dos metais para Daphnia. Globalmente, os parâmetros fisico-químicos da água parecem interagir entre si, afetando os parâmetros de história de vida e o crescimento populacional de Daphnia e também afetam a toxicidade dos metais. Em particular, a baixa dureza agrava os efeitos adversos da diminuição do pH, aumento da temperatura e toxicidade dos metais, o que aumenta a preocupação com os efeitos ecológicos da sua variação simultânea sobre os crustáceos e, portanto, sobre as cadeias alimentares aquáticas.

Natural substances and high pressure processing to preserve sea bass

Esta tese teve como objectivo estudar estratégias de conservação de pescado fresco, recorrendo ao uso de extractos e óleos essenciais de plantas e do processamento por alta pressão (HPP), usando filetes de robalo como um caso de estudo modelo. Relativamente aos extractos e óleos essenciais, avaliaram-se as suas propriedades antibacterianas e antioxidantes. Os extractos aquosos quente de poejo e de orégão e o óleo essencial de cravinho apresentaram a maior actividade antioxidante. Os óleos essenciais foram mais eficientes do que os extractos para inibir o crescimento das estirpes bacterianas testadas, tendo-se observado os menores valores de concentração mínima inibitória nos óleos essenciais de orégão, citronela, alho e orégão Espanhol. De seguida, estudou-se o efeito dos óleos essenciais de orégão Espanhol e de limão na conservação de filetes de robalo fresco tendo em conta critérios microbiológicos, químicos, físicos e sensoriais. A aplicação do óleo essencial de orégão Espanhol aumentou o tempo de vida útil dos filetes sob o ponto de vista bacteriano, mas não em termos sensoriais. A combinação dos óleos essenciais de orégão Espanhol e de limão melhorou o efeito antioxidante e reduziu a intensidade do odor e a sua eficácia em relação às Enterobacteriaceae, comparando com o tratamento com óleo essencial de orégão Espanhol per se. No sentido de reduzir o odor conferido pelos óleos essenciais realizou-se um estudo de conservação para avaliar o efeito de películas com óleos essenciais (citronela, alho e tomilho) em filetes de robalo, recorrendo a uma teste de desafio bacteriano. As películas sem óleos essenciais aumentaram o tempo de vida útil sob o ponto de vista bacteriano, mas este efeito não foi observado com a incorporação dos óleos essenciais nas películas. Em relação ao HPP, testaram-se diversas condições (nível de pressão, tempo de pressurização e taxa de pressurização) e avaliaram-se os efeitos na actividade enzimática, na qualidade global e na conservação de filetes de robalo fresco. Em geral, o aumento do nível de pressão e do tempo de pressurização diminuiu a actividade da fosfatase ácida e das enzimas proteolíticas, a carga bacteriana e a capacidade de retenção de água, enquanto que os filetes ficaram mais brancos. O HPP revelou potencial para o desenvolvimento de novos produtos: mais brancos, não translúcidos, mais firmes e com maior tempo de frescura e estabilidade microbiológica. Em conclusão, os óleos essenciais e o HPP têm potencial para conservar pescado fresco, devido aos seus efeitos na qualidade bacteriana. Ainda assim, mais esforços devem ser feitos no sentido de reduzir a transferência de odor dos óleos essenciais para o pescado e os efeitos do HPP no aspecto do pescado e na oxidação lipídica.

Sinalização celular e a resposta a estrogénios do epitélio mamário

Estrogens, such as 17β-estradiol (E2) are essential for normal growth and differentiation of the mammary gland. There are two estrogen receptors (ERs), ERα and ERβ which are ligand activated transcription factors. ERα stimulates proliferation and is the single most powerful predictor of breast cancer prognosis and since 70% of breast cancers express ERα, strategies to block this receptor are the primary breast cancer treatment. Unlike ERα, the role of ERβ in breast cancer and its potential as alternative therapeutic target remains controversial, mainly due to the lack of correlation between results obtained in vitro and epidemiological studies. The aim of this thesis was to increase our understanding of the molecular and cellular mechanisms of estrogen signaling in normal and cancerous cells, in different cellular contexts and with focus on ERβ. In Paper I we characterized the effect of the flavone PD098059 - which is a commonly used MEK1 inhibitor - on activation of transcription by ERα and ERβ. We found that the estrogenic effect of PD098059 is dose dependent in concentrations ranging from 1 – 10 μM and that activation of transcription by ER is suppressed by the inhibitory effect of PD98059 on MEK1 at concentrations above 50 μM. In agreement with its flavone nature, PD098059 had a much stronger effect on ERβ than on ERα transcriptional activity. Therefore, use of this compound for the study of signalling events in cells expressing ER should be carefully considered. In Paper II we assessed the effect of ERβ agonists in vivo and administered under different conditions in vitro. In basal conditions, ERβ induced apoptosis; however, in vivo ERβ agonists stimulated proliferation and inhibited apoptosis. In vivo effects were reproduced in culture, by activation of MAPK/ERK½ pathway with epidermal growth factor or basement membrane extract. In addition, insulin signalling and PI3-K/AKT activation was necessary for stimulation of proliferation. These results suggest that the cellular context modulates ERβ activity. Manuscript presents preliminary work aimed at the set-up of a methodological strategy to isolate ERs and to identify interacting proteins in different cellular contexts and which could modulate the bi-phased effects of ERβ in cell growth. In conclusion, the studies presented in this thesis contribute to clarify the apparent contradictory information regarding ERβ function in normal and cancerous mammary epithelium and suggest that the cellular context should be considered when ERβ effects are studied.

Integration of geochemical and biological modifications in mining areas: waters, sediments and diatoms

The development of mining activities over thousands of years in the region of Aljustrel is nowadays visible as a vast area of ore tailings, slag and host rocks of sulphides mineralization. The generation of acidic waters by the alteration of pyritic minerals - Acid Mine Drainage (AMD) - causes a significant impact on the river system both in the south of the village (Rib ª. Água Forte) and in the north of it (Rib ª. Água Azeda and Barranco do Farrobo), which is reflected in extremely low pH values (< 3) and high concentrations of As, Cd, Cu, Fe, Mn, Pb, Zn and sulphates. This study aimed to assess the environmental impacts extent, integrating geochemical (surface waters and stream sediments) and biological (diatoms) parameters. Three groups of sites were defined, based on sediments and water analysis, which integration with diatom data showed the same association of groups: Group 1- impacted, with acidic pH (1.9-5.1), high metal contents (0.4-1975 mg L-1) and Fe-Mg-sulphate waters, being metals more bioavailable in waters in cationic form (Me2+); mineralogically the sediments were characterized by phyllosilicates and sulphates/oxy-hydroxysulphate phases, easily solubilized, retaining a high amount of metals when precipitated; dominant taxon was Pinnularia aljustrelica (a new species); Group 2- slightly impacted, weak acid to neutral pH (5.0-6.8), metal contents not so high (0.2-25 mg L-1) and Fe-Mg-sulphate to Mg-chloride waters; dominant taxa were Brachysira neglectissima and Achnanthidium minutissimum; Group 3- unimpacted, alkaline pH (7.0-8.4), low metal contents (0-7 mg L-1) with Mg-chloride waters. In this group, metals were associated to the primary phases (e.g. sulphides), not so easily available; the existence of high chloride contents explained the presence of typical taxa of brackish/marine (e.g. Entomoneis paludosa) waters. Taxonomical aspects of the diatoms were studied (discovery of a new species: Pinnularia aljustrelica Luis, Almeida et Ector sp. nov.), as well as morphometric (size decrease of diatoms valves, as well as the appearance of deformed valves of Eunotia exigua in Group 1 and A. minutissimum in Group 2) and physiological (effective to assess the effects of metals/acidity in the photosynthetic efficiency through PAM Fluorometry) aspects. A study was carried out in an artificial river system (microcosm) that aimed to mimic Aljustrel’s extreme conditions in controlled laboratory conditions. The chronic effects of Fe, SO42- and acidity in field biofilms, inoculated in the artificial rivers, were evaluated as well as their contribution to the communities’ tolerance to metal toxicity, through acute tests with two metals (Cu and Zn). In general, the effects caused by low pH values and high concentrations of Fe and SO42- were reflected at the community level by the decrease in diversity, the predominance of acidophilic species, the decrease in photosynthetic efficiency and the increase of enzymatic (e.g. catalase, superoxide dismutase) and non-enzymatic activities (e.g. total glutathione and total phytochelatins). However, it was possible to verify that acidity performed a protective effect in the communities, upon Cu and Zn addition. A comparative study between Aljustrel mining area and New Brunswick mining area was carried out, both with similar mining and geological conditions, reflected in similar diatom communities in both mines, but in very different geographic and climatic areas.

Biology, ecology, population dynamics and distribution of metals in Sepia officinalis on a typical estuarine coastal lagoon - Ria de Aveiro

The common cuttlefish, Sepia officinalis, is a necto-benthic cephalopod that can live in coastal ecosystems, with high influence of anthropogenic pressures and thus be vulnerable to exposure to various types of contaminants. The cuttlefish is a species of great importance to the local economy of Aveiro, considering the global data of catches of this species in the Ria de Aveiro. However, studies on this species in Ria de Aveiro are scarce, so the present study aims to fill this information gap about the cuttlefish in the Ria de Aveiro. The cuttlefish enters Ria de Aveiro in the spring and summer to reproduce, returning to deeper waters in the winter. In terms of abundance, the eastern and center regions of the lagoon, closer to the sea, showed the highest values of abundance, while the northern and southern regions of the main channel had the lowest abundance. This fact may be related to abiotic factors, as well as depth, salinity and temperature. In the most southern point of the Ria de Aveiro (Areão) no cuttlefish was caught. This site had the lowest values of salinity and depth. The cuttlefish has an allometric the females being heavier than males to mantle lengths greater than 82.4 mm. Males reach sexual maturity first than females. In Ria de Aveiro in a generation of parents was found. The cuttlefish, presents itself as opportunistic predators, consuming a wide variety of prey from different taxa. The diet was similar in different sampling locations observing significant differences for the seasons. S. officinalis was captured at 10 sites in the Ria de Aveiro with different anthropogenic sources of contamination. Thus, levels of metals analyzed were similar at all sampling sites, with the exception of a restricted area, Laranjo, which showed higher values. The cuttlefish has the ability to accumulate metals in your body. The levels of Fe, Zn, Cu, Cd, Pb and Hg found in the digestive gland and mantle reflect a differential accumulation of metals in the tissues. This accumulation is related to the type and function of tissue analyzed and the type of metal analysis (essential and non-essential). The metal concentrations in the digestive gland are higher than in the mantle, with the exception of mercury. This may be due to the high affinity of the mantle for the incorporation of methylmercury (MeHg), the most abundant form of mercury. The accumulation of metals can vary over a lifetime, depending on the metal. The concentrations of Zn, Cd and Hg increases throughout life, while Pb decreases and essential metals such as Fe and Cu remain constant. The data collected suggest that the cuttlefish (Sepia officinalis) can be used as a bioindicator of environmental contamination for some metals.

Structural analysis of glycans and development of microarrays from Helcobacter pylori cell surface glycome

Helicobacter pylori is a bacterial pathogen that affects more than half of the world’s population with gastro-intestinal diseases and is associated with gastric cancer. The cell surface of H. pylori is decorated with lipopolysaccharides (LPSs) composed of three distinct regions: a variable polysaccharide moiety (O-chain), a structurally conserved core oligosaccharide, and a lipid A region that anchors the LPS to the cell membrane. The O-chain of H. pylori LPS, exhibits unique oligosaccharide structures, such as Lewis (Le) antigens, similar to those present in the gastric mucosa and are involved in interactions with the host. Glucan, heptoglycan, and riban domains are present in the outer core region of some H. pylori LPSs. Amylose-like glycans and mannans are also constituents of some H. pylori strains, possibly co-expressed with LPSs. The complexity of H. pylori LPSs has hampered the establishment of accurate structure-function relationships in interactions with the host, and the design of carbohydrate-based therapeutics, such as vaccines. Carbohydrate microarrays are recent powerful and sensitive tools for studying carbohydrate antigens and, since their emergence, are providing insights into the function of carbohydrates and their involvement in pathogen-host interactions. The major goals of this thesis were the structural analysis of LPSs from H. pylori strains isolated from gastric biopsies of symptomatic Portuguese patients and the construction of a novel pathogen carbohydrate microarray of these LPSs (H. pylori LPS microarray) for interaction studies with proteins. LPSs were extracted from the cell surface of five H. pylori clinical isolates and one NCTC strain (26695) by phenol/water method, fractionated by size exclusion chromatography and analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry. The oligosaccharides released after mild acid treatment of the LPS were analysed by electrospray mass spectrometry. In addition to the conserved core oligosaccharide moieties, structural analyses revealed the presence of type-2 Lex and Ley antigens and N-acetyllactosamine (LacNAc) sequences, typically found in H. pylori strains. Also, the presence of O-6 linked glucose residues, particularly in LPSs from strains 2191 and NCTC 26695, pointed out to the expression of a 6-glucan. Other structural domains, namely ribans, composed of O-2 linked ribofuranose residues were observed in the LPS of most of H. pylori clinical isolates. For the LPS from strain 14382, large amounts of O-3 linked galactose units, pointing to the occurrence of a galactan, a domain recently identified in the LPS of another H. pylori strain. A particular feature to the LPSs from strains 2191 and CI-117 was the detection of large amounts of O-4 linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) residues, suggesting the presence of chitin-like glycans, which to our knowledge have not been described for H. pylori strains. For the construction of the H. pylori LPS microarray, the structurally analysed LPSs, as well as LPS-derived oligosaccharide fractions, prepared as neoglycolipid (NGL) probes were noncovalently immobilized onto nitrocellulosecoated glass slides. These were printed together with NGLs of selected sequence defined oligosaccharides, bacterial LPSs and polysaccharides. The H. pylori LPS microarray was probed for recognition with carbohydratebinding proteins (CBPs) of known specificity. These included Le and blood group-related monoclonal antibodies (mAbs), plant lectins, a carbohydratebinding module (CBM) and the mammalian immune receptors DC-SIGN and Dectin-1. The analysis of these CBPs provided new information that complemented the structural analyses and was valuable in the quality control of the constructed microarray. Microarray analysis revealed the occurrence of type-2 Lex and Ley, but not type-1 Lea or Leb antigens, supporting the results obtained in the structural analysis. Furthermore, the H. pylori LPSs were recognised by DC-SIGN, a mammalian lectin known to interact with this bacterium through fucosylated Le epitopes expressed in its LPSs. The -fucose-specific lectin UEA-I, showed restricted binding to probes containing type-2 blood group H sequence and to the LPSs from strains CI-117 and 14382. The presence of H-type-2, as well Htype- 1 in the LPSs from these strains, was confirmed using specific mAbs. Although H-type-1 determinant has been reported for H. pylori LPSs, this is the first report of the presence of H-type-2 determinant. Microarray analysis also revealed that plant lectins known to bind 4-linked GlcNAc chitin oligosaccharide sequences bound H. pylori LPSs. STL, which exhibited restricted and strong binding to 4GlcNAc tri- and pentasaccharides, differentially recognised the LPS from the strain CI-117. The chitin sequences recognised in the LPS could be internal, as no binding was detected to this LPS with WGA, known to be specific for nonreducing terminal of 4GlcNAc sequence. Analyses of the H. pylori LPSs by SDS-PAGE and Western blot with STL provided further evidence for the presence of these novel domains in the O-chain region of this LPS. H. pylori LPS microarray was also applied to analysis of two human sera. The first was from a case infected with H. pylori (H. pylori+ CI-5) and the second was from a non-infected control.The analysis revealed a higher IgG-reactivity towards H. pylori LPSs in the H. pylori+ serum, than the control serum. A specific IgG response was observed to the LPS isolated from the CI-5 strain, which caused the infection. The present thesis has contributed to extension of current knowledge on chemical structures of LPS from H. pylori clinical isolates. Furthermore, the H. pylori LPS microarray constructed enabled the study of interactions with host proteins and showed promise as a tool in serological studies of H. pyloriinfected individuals. Thus, it is anticipated that the use of these complementary approaches may contribute to a better understanding of the molecular complexity of the LPSs and their role in pathogenesis.

Endocrine regulation of extracellular matrix proteins in calcified tissue in teleost fish

Tese dout., Biologia, Universidade do Algarve, 2005

Efeito do cloro no desenvolvimento e na tiróide da Tilápia Moçambicana (Oreochromis mossambicus)

Dissertação mest., Biotecnologia, Universidade do Algarve, 2009

Polycyclic aromatic hydrocarbons and oxidative stress markers in the clam Ruditapes decussatus from the Ria Formosa (Portugal)

Tese dout., Ciências e Tecnologias do Ambiente, Universidade do Algarve, 2007