猕猴精子优选及体外获能的研究

选择活率高的精子并进行体外获能是开展猕猴体外受精研究的必要程序, 是研究猕猴受精生物学的重要 手段。本实验采用上浮法和Percoll 梯度离心法对猕猴精液进行了优选, 并对处理后的精子形态正常率、精子活 率、密度及受精率作了比较, 发现二者差异不显著; 用dbcAMP 和咖啡因使精子获能, 发现只有两种获能剂同时 存在才能使猕猴精子获能并使卵母细胞受精。结论为: 上浮法和Percoll 法都是有效的精子优选法, 对受精率的 影响差异不显著; dbcAMP 和咖啡因在猕猴精子体外获能时缺一不可。

不同渗透压的稀释液对猕猴精子低温冷冻保存的影响

以稀释液TTE (382 mOsm/ kg) 为对照, 研究了5 种渗透压(688 、389 、329 、166 、43 mOsm/ kg) 的TEST 稀释液(TEST、mTEST1、mTEST2、mTEST3、mTEST4) 在冷冻过程中对猕猴精子功能的影响。精液一 步稀释于含甘油的防冻液中, 甘油的终浓度为5 % (v/ v) 。在冷冻前后分别检测精子的运动度和质膜完整性, 后者用Hoechst 33342 和碘化丙锭双色标记流式细胞术分析。结果表明: 冷冻之前, 与鲜精相比, 用TEST 和 mTEST4 稀释的精子运动度和质膜完整性显著降低( P < 01001) , 其余组中除mTEST2 稀释的精子质膜完整性显 著降低( P < 0105) 外, 精子运动度无差异; 冷冻复苏后, TTE、mTEST3 和mTEST1 冻存精子的运动度和质膜 完整性最高, 其次是mTEST2 , TEST和mTEST4 冷冻效果最差( P < 0105) 。提示等渗、适当高渗或低渗的稀释 液适合猕猴精子的冷冻保存; 对精子产生高渗毒害作用是导致猕猴精子用TEST 冷冻存活率低的主要原因。

四种渗透性防冻剂在猕猴精子低温冷冻保存中对精子功能状态的影响

以冷冻精子的复苏运动度、荧光染料Hoechst 33258 检测的细胞膜完整率、异硫氰酸荧光素标记的 花生凝集素(FITC2PNA) 检测的顶体完整率作为精子功能状态的指标, 对甘油、二甲亚砜、乙二醇和丙二醇4 种常用渗透性防冻剂在猕猴精子冷冻保存过程中的作用进行了比较。结果表明: 冷冻保存精子的复苏运动度, 甘油(4713 ±517 %) 和乙二醇(4418 ±617 %) > 二甲亚砜(2219 ±019 %) > 丙二醇(0 ±0 %) ; 细胞膜完整 率, 甘油(5418 ±312 %) 和乙二醇(5410 ±617 %) > 二甲亚砜(3715 ±710 %) > 丙二醇(2813 ±615 %) ; 顶 体完整率, 甘油(8212 ±214 %) 和乙二醇(8214 ±214 %) > 二甲亚砜(6817 ±517 %) 和丙二醇(7213 ± 315 %) ( P < 0105) 。结果提示: 二甲亚砜和丙二醇, 尤其是丙二醇并不适合猕猴精子的冷冻保存; 而乙二醇具 有和甘油相似的保护作用, 是一种极具潜力的猕猴精子冷冻保存的渗透性防冻剂。

雌性猕猴尿中生殖激素的变化

　用人血清激素放射免疫测定试剂盒,测定了4 只未孕雌性猕猴8 个月经周期尿中促黄体生成素 (LH) 、孕酮(P) 和雌二醇( E2) 的含量,结合对猕猴繁殖行为学的观察,研究了各激素分泌之间的关系及其与繁殖行 为的内在联系。结果表明:4 只雌性猕猴8 个月经周期的平均长度为(26. 25 ±2. 10) d ,行经时间(2. 25 ±0. 66) d , LH 峰值出现在(12. 75 ±0. 91) d ,平均峰值为(86. 30 ±20. 11) miu/ mL ;P 峰值出现在(19. 75 ±1. 87) d ,平均峰值为 (7. 47 ±1. 78) ng/ mL ;E2 峰值出现在(11. 75 ±1. 81) d ,平均峰值为(679. 11 ±90. 66) pg/ mL 。研究表明,人血清激 素放射免疫测定试剂盒可以测定出猕猴尿中生殖激素的变化趋势;LH、P、E2 的变化情况基本上能反映出猕猴月 经周期中卵泡形成、排卵及黄体形成的时间。

HORMONAL-REGULATION OF TISSUE-TYPE PLASMINOGEN-ACTIVATOR AND PLASMINOGEN-ACTIVATOR INHIBITOR TYPE-1 IN CULTURED MONKEY SERTOLI CELLS

Sertoli cells play a central role in the control and maintenance of spermatogenesis. Isolated Sertoli cells of mouse and rat testes have been shown to secrete plasminogen activator (PA) and a plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) in culture. In this study, we have investigated the hormonal regulation of PA and PAI-1 activities in cultured monkey Sertoli cells. Sertoli cells (5x10(5) cells/well) isolated from infant rhesus monkey testes were preincubated at 35 degrees C for 16 h in 24-well plates precoated with poly(D-lysine) (5 mu g/cm(2)) in 0.5 mi McCoy's 5a medium containing 5% of fetal calf serum and further incubated for 48 h in 0.5 mi serum-free medium with or without various hormones or other compounds, PA as well as PAI-1 activities in the conditioned media were assayed by fibrin overlay and reverse fibrin autography techniques respectively. The Sertoli cells in vitro secreted only tissue-type PA (tPA), no detectable amount of urokinase-type PA (uPA) could be observed, Monkey Sertoli cells were also capable of secreting PAI-1, Immunocytochemical studies indicated that both tPA and PAI-1 positive staining localized in the Sertoli cells, spermatids and residual bodies of the seminiferous epithelium; Northern blot analysis further confirmed the presence of both tPA and PAI-1 mRNA in monkey Sertoli cells. Addition of follicle-stimulating hormone (FSH) or cyclic adenosine monophosphate (cAMP) derivatives or cAMP-generating agents and gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist or phorbol ester (PMA) to the cell culture significantly increased tPA activity. PAI-1 activity in the culture was also enhanced by these reagents except 8-bromo-dibutyryl-cAMP, forskolin and 3-isobutyl-1-methylxanthin (MIX) which greatly stimulated tPA activity, whereas decreased PAI-1 activity, implying that neutralization of PAI-1 activity by tile high level of tPA in the conditioned media may occur. These data suggest that increased intracellular signals which activate protein kinase A (PKA), or protein kinase C (PKC) can modulate Sertoli cell tPA and PAI-1 activities, The concomitant induction of PA and PAI-1 by the same reagents in the Sertoli cells may reflect a finely tuned regulatory mechanism in which PAI-1 could limit the excession of the proteolysis.

猕猴胚胎干细胞神经分化过程中ASPP家族变化的初步研究

为研究肿瘤细胞凋亡调控因子ASPP(Apoptosis-stimulating protein of p53)家族蛋白(ASPP1,ASPP2,iASPP)在猕猴神经系统细胞早期发育过程中是否存在变化,并初步研究其变化趋势,通过体外诱导猕猴胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞模拟猕猴神经系统细胞早期发育过程,并对此过程中细胞内ASPP蛋白量进行检测,检测方法使用细胞免疫荧光和western blotting.实验初步检测出,肿瘤调控因子ASPP家族蛋白在猕猴神经系统细胞早期发育过程中在蛋白量和蛋白分子量上有变化,并且可以初步了解其变化趋势.该实验结果表明ASPP蛋白家族作为肿瘤细胞凋亡调控因子与猕猴神经系统早期发育过程有着密切的关系,这也许对将来治疗神经系统退行性疾病和肿瘤发生有一定帮助.

猕猴结肠镜下活检组织病理学观察

目的通过对猕猴结肠镜检及活检取材，对结肠镜检测方法应用于非人灵长类动物予以评价。方法 实验猴在麻醉状态下接受结肠镜检查和活检标本取材，对活检标本进行固定和病理切片观察，并对所检猴进行解 剖和组织学观察，比较各取材点的情况。结果结肠镜下及大体标本观察见猕猴肠壁厚度明显小于人体，活检取 材部位见黏膜破损、肠出血，个别部位见肠穿孔。病理切片HE 染色观察发现，与人体比较，猕猴大肠腺较小而表 浅，固有层内淋巴小结数量较少，肌层、黏膜下层明显较薄。结论对猕猴行结肠镜检查及镜下活检取材是可行 的，但因猕猴肠壁较人体薄而极易穿孔，故需尽量应用活检杯小的活检钳，并需要充分的肠道准备和有经验的肠镜 操作。

恒河猴TRIM5α 的组织分布及TRIMCyp 限制HIV-1 病毒颗粒产生的初步研究

三重基序蛋白TRIM5α(Tripartite motif protein 5 alpha)是哺乳动物细胞中一种重要的限制因子，广泛分布于各种哺乳动物细胞中。人类TRIM5α mRNA 广泛表达于人类各个组织中，并且I 型干扰素IFN-α/β/γ 均能与TRIM5α 基因启动子的ISRE 元件结合，上调TRIM5α mRNA 的表达。恒河猴(Macaca mulatta)TRIM5α 是恒河猴体内重要的限制因子。目前对恒河猴尤其是中国恒河猴TRIM5α 的组织分布以及在受到外界刺激时TRIM5α mRNA 表达量的变化研究还未见报道。本论文通过从中国恒河猴各组织中提取总RNA，以β-actin 基因作为内参照，通过逆转录PCR 检测各组织中TRIM5α mRNA 的表达。我们选择用HIV-GFP-VSVG 感染、用佛波脂(Phorbol myfismte acetate, PMA)+离子霉素(Ionomycin, Ion)，CD28 抗体+CD49d 抗体分别共刺激恒河猴PBMC，研究不同刺激对中国恒河猴TRIM5α mRNA 表达量的影响。研究发现：TRIM5α mRNA 广泛表达于恒河猴各组织中，在免疫系统和泌尿生殖系统各组织，如腹淋巴结、睾丸和附睾中表达量最高，而在神经系统各组织如大脑、脊髓中表达量比较少，在其他各组织中未见明显的表达差异。此外HIV-GFP-VSVG 感染、PMA+ Ion 与CD28 抗体+CD49d 抗体分别共刺激PBMC 均能促进PBMC TRIM5α mRNA 表达量的上调。 TRIM5α 作为恒河猴体内的最主要的限制HIV-1 感染的限制因子，除了可能通过促进HIV-1 的脱壳和阻止整合前复合物PIC(pre-integration complex)入核，恒河猴TRIM5α 还能限制HIV-1 病毒颗粒的产生。在这个过程中B30.2 结构域是非必需的，而B-box2 和Coiled-Coil 结构域起着决定性的作用。因为鹰猴(Aotes trivirgatus)TRIMCyp(omTRIMCyp) 蛋白和北平顶猴(Macaca leouina) TRIMCyp(npmTRIMCyp）蛋白的B-box2 和Coiled-Coil 结构域与恒河猴TRIM5α 的B-box2 和Coiled-Coil 具有很高的同源性，我们希望了解鹰猴TRIMCyp 蛋白和北平顶猴TRIMCyp 蛋白对HIV-1 病毒颗粒的产生是否有限制作用。本论文主要通过将质粒pNL4.3 分别与质粒pLPCX 、pLPCX-npmTRIMCyp-HA 、 pLPCX-omTRIMCyp-HA和pLPCX-rhTRIM5α-HA共转染293T细胞，通过western blot 检测细胞内Gag 蛋白和TRIM5 蛋白的表达情况，研究omTRIMCyp 蛋白和 npmTRIMCyp 蛋白对HIV-1 病毒颗粒产生的限制作用。结果表明：北平顶猴 TRIMCyp 蛋白、鹰猴TRIMCyp 蛋白都能不同程度的促进HIV-1 病毒Gag 蛋白的降解。

调节性T细胞在SIVmac239感染中国恒河猴中的变化及其机制的初步研究

CD4+CD25+调节性T细胞是1995年才发现的一个具有免疫抑制功能的T细胞亚群，主要通过细胞与细胞间直接接触和分泌抑制性细胞因子发挥作用，在维持机体免疫自稳、防止自身免疫以及肿瘤免疫、移植免疫等方面起着重要作用。有关Treg HIV/SIV病毒感染及AIDS的进展关系密切，但却有两种不同的观点。一种认为Treg的数量和功能受到损伤，从而导致宿主免疫系统过度活化。另一种则认为Treg在早期抑制了针对HIV/SIV的特异性的免疫反应，从而导致机体无法清除感染的病毒。本文利用动物模型对CD4+CD25+调节性T细胞在SIV感染后的数量和功能做了动态的检测，并对其中的机制做了初步的探讨。我们首先建立了SIVmac239病毒株对中国起源的恒河猴感染的动物模型，建立了前病毒的检测方法、血浆病毒载量的测定方法、血浆病毒特异性抗体的测定方法，以及病毒的分离方法，并获得了早期感染的相关数据。在研究中我们发现，SIV感染后的1周后即可在恒河猴外周单个核细胞DNA中检测到前病毒。病毒血症也在1周后出现，并很快达到高峰。不同的个体对病毒感染的体液免疫不尽相同，血浆抗体很快出现，但是99003猴抗体下降很快，而99083猴则保持了一定数量的抗体。同时，伴随SIV的感染进程的还有T淋巴细胞的数量变化，CD4+T细胞数量持续下降，而CD8+T细胞数量则在增加，出现CD4/CD8倒置的现象。以上说明恒河猴被SIV所成功感染。在该动物模型的基础上，我们利用体内传代的SIVmac239病毒株，对4只健康恒河猴进行了感染，并对CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）亚群在数量上的变化进行了检测，并对其中的机制做了初步探讨。我们在研究中发现，外周血中的Treg在SIV感染后无论是绝对数量还是在占CD4+T细胞中的相对数量均有增加，而且Treg仍然保持了对靶细胞的抑制功能。对腹部淋巴结的分析显示，SIV感染后的一段时期内，该部位FoxP3 mRNA的表达水平也在上升，TGF-β、IL-10的转录也显著增加。前者可以通过抑制树突状细胞间接抑制效应细胞，而后者则是一个抑制性的细胞因子，可以直接作用于靶细胞。因此，我们推测SIV引起免疫系统的过度活化可能不是由于Treg功能的受损，其中的机制需要深入研究。 Treg表达CCR5表面分子（HIV辅助受体之一），同时也有CD4分子的表达，因此推测HIV/SIV可以感染Treg。但是国内外这方面的文献很少。我们对Treg中前病毒的检测发现，SIV可以感染Treg，而且对Treg的感染比例高于CD4+CD25－T细胞。这个结果与Treg绝对数量的上升的结果说明，SIV感染Treg但可能却没有杀伤Treg，因此Treg在数量上有所增加。不过，其中的机制仍有待于进一步的研究。在对SIV引起的体液免疫的研究中还发现，机体针对SIV不同抗原的抗体有不同的模式。部分抗原很快就产生了比较强的反应，但是却不能维持高水平的表达。而针对p27蛋白的抗体产生比较晚，但却长时间维持在比较高的水平。是否这样高水平的抗体有助于控制病毒复制是个值得探讨的问题。

树突状细胞亚群在SIVmac239感染中国恒河猴中数量、表型和功能变化及其机制的研究

本论文主要由3 个相对独立的部分组成：中国恒河猴单核细胞来源的树突 状细胞的表型及功能研究；外周血DC 亚群在SIVmac239 感染的中国恒河猴中 数量及细胞因子的变化以及急性感染期SIVmac239 对中国恒河猴外周血DC 亚 群的凋亡和免疫表型的影响。 非人灵长类动物是人类的近亲，由于在组织结构、免疫、生理和代谢等诸 多方面与人类高度近似，科学界较普遍地利用非人灵长类作为动物模型来进行 艾滋病（AIDS）的发病机制和疫苗研究。中国恒河猴发病缓慢，更适合于HIV 感染的相关研究。在本研究中，我们在体外成功培养了中国恒河猴单核细胞来 源的树突状细胞（monocyte derived dendritic cells，MDDC），并测定其表型和免 疫刺激功能。通过GM-CSF 和IL-4 共同刺激培养单核细胞6 天以后便获得了未 成熟MDDC，随后加入IL-1β、PGE2、LPS 和TNF-α 联合刺激MDDC 成熟。 成熟的MDDC 上调了共刺激分子和CD83 的表达，具有很强的刺激T 淋巴细胞 增殖的能力并分泌大量的IL-12。本研究为后续的DC 疫苗研究奠定了基础。 我们实验室建立了SIVmac239 感染的中国恒河猴动物模型。以该模型为依 托，我们研究了外周血中DC 亚群在急性感染期以及慢性感染期的数量、表型 及功能变化。DC 作为最重要的连接先天免疫与获得性免疫的抗原递呈细胞， 在AIDS 发病进程中扮演着重要的角色。研究发现AIDS 患者血液和淋巴结中 髓样DC（myeloid DC，mDC）和浆细胞样DC（plasmacytoid DC，pDC）会随 着感染的进程而减少，并且伴随着功能损伤。本论文通过研究发现，中国恒河 猴的DC 亚群数量在感染后尽管波动十分剧烈，但并没有显著性地增加或减少， 中文摘要 2 在后期DC 数量能够回升到正常的范围之类，这种回升不同于印度恒河猴，很 可能是中国恒河猴缓慢发病的原因之一。进一步通过研究体外刺激DC 亚群分 泌的细胞因子，我们发现在急性感染期，pDC 分泌的IFN-α 显著提高，并很可 能刺激mDC 成熟并促进了IL-12 的分泌。早期大量细胞因子的分泌有助于控制 病毒复制，但同时也激起了整个免疫系统的活化，促进了疾病进程。而在整个 感染阶段，IFN-α 与CD4+ T 细胞呈正相关，而与病毒载量呈负相关，表明了 IFN-α 对于延缓疾病进程具有重要的意义。 我们测定了急性感染期DC 亚群受病毒影响而发生的表型变化，发现pDC 更容易受到病毒影响而发生凋亡，这可能与pDC 高表达SIV 受体CD4 和CCR5 有关。在感染过程中，尽管mDC 和pDC 都显著地下调了CD4 表达，而上调了 CCR5 的表达，不过仅发现pDC CD4 的表达与病毒载量呈负相关，而CCR5 的 表达与病毒载量呈正相关。在此过程中DC 亚群都会因为病毒的影响而活化， 继而提高CCR7 的表达。同时无论mDC 还是pDC，其表达的CD80 和CD86 都与病毒载量呈正相关。在早期感染中，DC 的活化促使整个免疫系统针对病 毒发挥免疫反应，对于控制疾病发展具有重要意义。

猕猴多潜能成体肝前体细胞及猕猴ES 定向分化为胆管上皮细胞的研究

为解决供体器官的不足，以细胞移植为基础的替代疗法已成为治疗不可逆肝 脏疾病新的希望。 肝前体（干）细胞（Hepatic progenitor cellS，HPCs）和 胚胎干细胞（embryoic stem cells, ES）由于其特殊的细胞特性已成为细胞替 代治疗理想的种源细胞。 然而一方面包括人在内的灵长类动物的正常成体肝来 源的HPCs 的分离依然是很困难的；另一方面，ES 细胞来源的肝细胞和胆管细胞 的生成效率依旧很低。因此有必要建立稳定的高效的灵长类动物HPCs 细胞分离 培养体系及ES 细胞的肝细胞或胆管细胞分化体系以满足供体细胞的不足；这种 体系的建立还有利于研究肝细胞生物学如分化机制、自我更新机制等方面的重要 基础问题。 本研究以猕猴为实验模型，研究了正常成体肝来源的猕猴HPCs 分离、纯化 的条件，系统地鉴定了猕猴HPCs 的细胞特性和体内、外分化潜能，并评价了体 内移植效果。 同时以rES 为材料，建立了rES 高效分化为限定性内胚层 （definitive endoderm cells, DE）和胆管上皮细胞的分化体系。主要实验结 果包括：1）： FBS、EGF、HGF 及rat tail collagen (鼠尾胶原)是分离培养正 常成体猕猴来源的肝上皮前体细胞(rhesus monkey liver epithelial progenitor cells, mLEPCs)所必需的，mLEPCs 在此培养体系中至少可以扩增20 代或5 个月以上，并仍然保持原有的细胞特性；mLEPCs 呈现典型的上皮细胞形 态，并表达HPCs 细胞特有的表达模式即同时表达肝细胞和胆管细胞相关基因 （ALB，APOH，CX43，IB4）或蛋白（CK7，CK8，CK18）；在适宜的分化体系下， mLEPCs 可分化为功能性的肝细胞，形成具有胆管上皮细胞的胆管样结构，并能 转分化形成肌肉样细胞、肌样成纤维细胞及少突样细胞；移植入肝损伤的免疫抑 制的小鼠体内后，mLEPCs 能参与受体肝组织的再生，并能分化成ALB 阳性的肝 细胞；体内定位发现mLEPCs 与胆管区的细胞有相似的免疫原性，提示mLEPCs 可能来源于胆管区。2）：rES 在高浓度的acitvin A（100ng/ml）和低浓度的血 清(1%)单层诱导体系下可定向分化得到高比率的限定性内胚层细胞（definitive endoderm cells，DE 细胞）(约80%)； 高比率的DE 细胞的得到还与rES 细胞的接种密度相关；BMP4 和FGF1 可诱导DE 细胞高效向胆管上皮细胞分化（约90%）， 但并不能得到肝细胞；而Notch 信号通路可维持DE 细胞的存活，并决定着DE 细胞向胆管细胞分化，在Notch 信号通路失活的情形下，即使存在BMP4 和FGF1 都不能促使DE 细胞向胆管细胞分化。 本实验首次成功建立了正常猕猴成体肝HPCs 分离培养体系，证实了分离得 到的猕猴肝上皮前体细胞不但具有正常HPCs 的增殖活力和参与受体肝组织的再 生能力，而且还具有三个胚层的分化潜能，这一结果将为以HPCs 为基础的细胞 替代治疗人类肝脏疾病的实现提供了可能，并首次证明了HPCs 也可以像某些少 数成体干细胞一样具有三个胚层得分化潜能。 此外，本研究建立了rES 高效定 向分化为DE 细胞和胆管细胞的分化体系，这一方法的建立将促进灵长类动物的 DE 细胞的发育机制研究，同时也可为高比率的内胚层功能细胞（如胰岛细胞、 肝细胞、肺细胞）的获得提供丰富的种源细胞和平台。

猕猴胚胎干细胞无饲养层、无血清培养及诱导分化成O2A 胶质前体细胞的研究

灵长类胚胎干细胞（ES 细胞）不仅能为研究生殖发育生物学基础理论提供良好的 模型，而且可为细胞替代治疗提供大量的供体细胞，因此具有重要的研究价值。当前 灵长类ES 细胞研究还有很多问题需要解决，如分离建立更多的胚胎干细胞系，优化培 养体系，提高ES 细胞定向分化为特定细胞的比例，研究ES 细胞自我更新和分化的机 制等。本文一方面概括了灵长类ES 细胞的研究进展，另一方面并对制备抗体，免疫外 科手术法分离灵长类胚胎内细胞团，建立猕猴ES 细胞的无饲养层、无血清培养体系和 诱导猕猴ES 细胞分化成高纯度的O2A 神经胶质前体细胞进行了研究。主要结论如下： 1）分别以猕猴脾脏淋巴细胞和人外周血单个核细胞作为免疫原，免疫日本大耳白兔， 得到免疫血清。在补体介导的细胞毒作用下，兔抗人和兔抗猕猴免疫血清可以裂解人 和猕猴囊胚滋养层细胞，从而分离出内细胞团，用于分离培养人和猕猴胚胎干细胞。2） 猕猴ES 细胞在以层粘连蛋白（laminin）为胞外基质，含转化生长因子beta1（TGFβ1） 的无血清培养基（SFM）中可以稳定的增殖至少22 代，保持不分化，并具有分化成三 个胚层细胞的能力。进一步的研究发现去除TGFβ1 后，猕猴ES 细胞出现分化，整合 素表达降低，推测TGFβ1 可能通过促进猕猴ES 细胞整合素的表达，加强其与胞外基 质的相互作用，从而维持ES 细胞的自我更新。然而猕猴ES 细胞不能在纤粘连蛋白 （fibronectin）和明胶上生长。3）无饲养层、无血清培养体系中长期培养的猕猴ES 细 胞，分化出拟胚体，14 天的拟胚体在血清中分化培养一周后，在含碱性成纤维生长因 子bFGF、表皮生长因子EGF 和胰岛素＋转铁蛋白＋亚硒酸钠ITS 的培养基中培养， 获得97％的O2A 胶质前体细胞，得到的O2A 细胞能够稳定增殖，并且可以自发分化 为II 型星型胶质细胞和少突胶质细胞。本实验的结果有助于猕猴ES 细胞分离建系和培 养系统的优化、推动猕猴ES 细胞自我更新和诱导为神经胶质细胞机制的研究，便于建 立ES 细胞替代治疗的猕猴模型，从而为人类ES 细胞的临床疾病治疗提供参考。

猕猴胚胎干细胞培养以及定向分化成神经细胞的研究

灵长类胚胎干细胞（Es）的研究不仅对理解生殖发育生物学的基础理论、而且对实现细胞替代治疗具有重要意义。当前灵长类ES细胞还有很多问题需要解决，如ES细胞培养体系的改进、ES细胞定向分化成高纯度特定组织细胞的可能性、有效性以及分化机制等问题。本文一方面概述了灵长类ES细胞相关领域的研究进展；另一方面，以称猴胚胎干细胞（rEs）为材料，在改善rES细胞的培养体系、提高其定向分化成神经前体细胞（NPs）和少突细胞的比率进行了研究。实验采用同源称猴细胞系作为饲养层培养rES细胞，并在此基础上利用肝生长因子（HGF）和GS诱导rES细胞定向分化成高纯度的NPs和少突细胞，并评价了NPs是否具有移植功能。主要结论如下：1）四种称猴细胞系（MOF、MESF、MFG和CMESF）可作为饲养层支持rES细胞的生长，保持ES自我更新的能力和分化的多能性。而且这几种称猴饲养层支持ES细胞生长的能力存在明显的差异，进一步的研究表明这些差异主要是由于基因表达种类以及表达量上的差异而导致的。2）采用HGF和GS作为诱导因子添加到NDCM液中，诱导rES细胞分化成可移植的NPs。实验结果如下：单独的HGF或GS仅能诱导ES细胞分化成65±8.3％和69±14％NPs，而HGF和GS的联合使用NPs的比率达到88.3±8.1％，进一步纯化后获得98±1.2％的NPs。获得的NPs能在体内、外分化成三个谱系神经细胞，并能整合到大鼠脑部，发生迁移和分化。25％的NPs细胞8周后仍保持存活状态，其中65-80％的细胞发生了不同程度的迁移，而且细胞在脑部的分化种类以及数目与细胞在体内所处的微环境具有重要的关系。亚克隆实验也进一步证明采用HGF＋GS获得的部分单个NPs具有神经干细胞的特性，也能在体内、外分化成三个谱系的神经细胞，而另外的却只能分化成其中的一、两种谱系的细胞。3）利用五步法，ES细胞能分化成75±6.8％的少突祖细胞和81土8．6％的成熟少突细胞。HGF通过抑制NPs的凋亡和缩短NPs的复制周期，共同促进NPs的增殖。HGF也能诱导HGF+G5获得的NPs分化成少突祖细胞和成熟少突细胞，并且促进少突细胞成熟。而且HGF促进NPs分化成少突细胞的能力受到GS的调控，单独HGF作用将导致ES细胞分化成神经元。本实验的结果为促进rES细胞相关领域的研究，以及ES细胞在神经系统疾病临床应用上提供信息，也为研究NPs和少突细胞的发育提供典型的细胞模型。

猕猴精子冷冻保存方法的改进及活率检测

精液的冷冻保存对家畜繁殖、人类辅助生殖以及濒危物种保护有着重要意义。然而目前精子冷冻的研究很大程度上是经验性的，并且要使用含卵黄、脱脂乳等复杂成分的稀释液。这些复杂成分不仅是潜在的污染源，也使精子冷冻中的质量控制及分析特定物质的功能变得困难。即便如此也仅有约50％的精子能够存活下来，而且存活精子的受精能力也有所下降。称猴是生物医学研究中使用广泛的灵长类动物，开展赫猴精子的冷冻保存有利于该物种的繁殖并促进基础胚胎学的研究，成功的称猴精子冷冻方法还可以为其它珍稀濒危灵长类动物所借鉴。但是目前成功的称猴精子冷冻的报道仍然很少，且精子质量检测方法并不完善。因此本文致力于建立简单有效的称猴精子冷冻方法和活率检测方法。主要结果如下：1）建立了一种用单一紫外激光同时激发Hoechst33342和碘化丙锭结合流式细胞术检测称猴精子活率的有效方法，并将此方法用于称猴精子冷冻研究。2）发现甘油的一步加入或去除与分步加入或去除对称猴精子冷冻效果没有明显影响，在此基础上发现各种糖类稀释液之间的作用差异很小，但不含糖的化学成分确定的TT稀释液对精子冷冻保护作用显著高于糖类稀释液。这可能是因为TT的渗透压（138mOsm/kg）较好地适合于猫猴精子的冻存，高渗毒害作用可能是导致称猴精子用TEST冷冻存活率低的重要原因。3）以TT为基础稀释液，探讨了精子冷冻中一些关键因素，以期进一步改进冷冻方法。结果表明精液一步稀释于含5％甘油的一倍浓度TT，平衡0.5h可得到最佳效果，总体上复苏精子的运动度可达到55％以上，质膜完整性能达到6D％左右。这种方法与传统的以含有卵黄的TTE为稀释液的称猴精子冷冻方法效果相当，复苏精子还能够成功地进行体外受精。另外，用液化精液1：2直接稀释于防冻液还能进一步提高冷冻效果。本研究建立的用化学成分确定稀释液冷冻称猴精子的简单方法，有利于提高称猴精子的冻存效率，并有助于分析特定成分在精子冷冻中的作用。而Hoechst33342和碘化丙锭双染方法，是一种简单有效的精子活率检测方法，并在多参数精子功能的流式检测中有很高应用价值。

猕猴精子的冷冻保存以及影响冷冻复苏精子功能的因素

自从1949年Polge等研究者发现甘油的冷冻保护作用，开创了低温生物学的里程碑以来，精子冷冻保存已经逐渐成为治疗人类不育、家畜繁殖和生物多样性保护的重要手段。然而目前人类对多数物种的基本生殖生物学及其种质冷冻保存的低温生物学知识仍很缺乏。哺乳动物精子冷冻的研究很大程度上是经验性的，即使运用最现代的低温冷冻程序和仪器设备，也仅有约50％的精子能够存活下来。灵长类动物的精子对冷冻非常敏感，迄今为止应用称猴冷冻精子人工受精仅产生过一个后代。为了提高冷冻保存精子的功能和受精能力，本论文以称猴为动物模型，以冷冻复苏精一的运动度、精子质膜和顶体的完整率以及体外受精作为精子功能的检钡l指标，探讨影响动物精子冷冻保存的因素。通过研究1）建立了适合称猴精子冷冻保存的适宜方法以及冷冻复苏精子功能的检测方法，并首次成功地运用冷冻称猴精子体外受精；2）检测了不同甘油浓度和二甲亚飒浓度对冷冻复苏精子运动能力、精子质膜、精子顶体结构和受精能力的影响，确定了称猴精子冷冻保存的适宜甘油浓度；3）对比研究了不同类型渗透性防冻剂在精子冷冻保存中的作用以及对冷冻复苏精子功能的影响，发现对于称猴精子，除了甘油外，乙二醇也是一种优秀的渗透性防冻剂，而丙二醇和二甲亚矾对精子产生了较大的毒害作用，并不适合称猴精子的冷冻保存；4）研究了单糖、二糖和二糖在精子冷冻复苏过程中的保护作用，发现不同类型糖类的冷冻保护作用存在显著差异，单糖和二糖对精子的冷冻保护作用优于二糖，二糖在冷冻复苏过程中对于精子的顶体产生了破坏作用，不同类型的糖类配合使用可以提高对精子的冷冻保护效率。本研究的结果有利于优化灵长类动物精子冷冻保存的方法，包括调整防冻液的成分和冷冻降温程序，从而有助于提高精子冷冻保存的存活率。此外，还有利于深入研究哺乳动物精子冷冻损伤的机制和探讨防冻剂的冷冻保护机理.