猕猴精子冷冻保存方法的改进及活率检测

精液的冷冻保存对家畜繁殖、人类辅助生殖以及濒危物种保护有着重要意义。然而目前精子冷冻的研究很大程度上是经验性的，并且要使用含卵黄、脱脂乳等复杂成分的稀释液。这些复杂成分不仅是潜在的污染源，也使精子冷冻中的质量控制及分析特定物质的功能变得困难。即便如此也仅有约50％的精子能够存活下来，而且存活精子的受精能力也有所下降。称猴是生物医学研究中使用广泛的灵长类动物，开展赫猴精子的冷冻保存有利于该物种的繁殖并促进基础胚胎学的研究，成功的称猴精子冷冻方法还可以为其它珍稀濒危灵长类动物所借鉴。但是目前成功的称猴精子冷冻的报道仍然很少，且精子质量检测方法并不完善。因此本文致力于建立简单有效的称猴精子冷冻方法和活率检测方法。主要结果如下：1）建立了一种用单一紫外激光同时激发Hoechst33342和碘化丙锭结合流式细胞术检测称猴精子活率的有效方法，并将此方法用于称猴精子冷冻研究。2）发现甘油的一步加入或去除与分步加入或去除对称猴精子冷冻效果没有明显影响，在此基础上发现各种糖类稀释液之间的作用差异很小，但不含糖的化学成分确定的TT稀释液对精子冷冻保护作用显著高于糖类稀释液。这可能是因为TT的渗透压（138mOsm/kg）较好地适合于猫猴精子的冻存，高渗毒害作用可能是导致称猴精子用TEST冷冻存活率低的重要原因。3）以TT为基础稀释液，探讨了精子冷冻中一些关键因素，以期进一步改进冷冻方法。结果表明精液一步稀释于含5％甘油的一倍浓度TT，平衡0.5h可得到最佳效果，总体上复苏精子的运动度可达到55％以上，质膜完整性能达到6D％左右。这种方法与传统的以含有卵黄的TTE为稀释液的称猴精子冷冻方法效果相当，复苏精子还能够成功地进行体外受精。另外，用液化精液1：2直接稀释于防冻液还能进一步提高冷冻效果。本研究建立的用化学成分确定稀释液冷冻称猴精子的简单方法，有利于提高称猴精子的冻存效率，并有助于分析特定成分在精子冷冻中的作用。而Hoechst33342和碘化丙锭双染方法，是一种简单有效的精子活率检测方法，并在多参数精子功能的流式检测中有很高应用价值。