Forensisch relevante SNP-Genotypisierung mittels elektronischer Microarray-Technologie

Die vorliegende Dissertation entstand im Rahmen eines multizentrischen EU-geförderten Projektes, das die Anwendungsmöglichkeiten von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zur Individualisierung von Personen im Kontext der Zuordnung von biologischen Tatortspuren oder auch bei der Identifizierung unbekannter Toter behandelt. Die übergeordnete Zielsetzung des Projektes bestand darin, hochauflösende Genotypisierungsmethoden zu etablieren und zu validieren, die mit hoher Genauigkeit aber geringen Aufwand SNPs im Multiplexformat simultan analysieren können. Zunächst wurden 29 Y-chromosomale und 52 autosomale SNPs unter der Anforderung ausgewählt, dass sie als Multiplex eine möglichst hohe Individualisierungschance aufweisen. Anschließend folgten die Validierungen beider Multiplex-Systeme und der SNaPshot™-Minisequenzierungsmethode in systematischen Studien unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen des Projektes. Die validierte Referenzmethode auf der Basis einer Minisequenzierung diente einerseits für die kontrollierte Zusammenarbeit unterschiedlicher Laboratorien und andererseits als Grundlage für die Entwicklung eines Assays zur SNP-Genotypisierung mittels der elektronischen Microarray-Technologie in dieser Arbeit. Der eigenständige Hauptteil dieser Dissertation beschreibt unter Verwendung der zuvor validierten autosomalen SNPs die Neuentwicklung und Validierung eines Hybridisierungsassays für die elektronische Microarray-Plattform der Firma Nanogen Dazu wurden im Vorfeld drei verschiedene Assays etabliert, die sich im Funktionsprinzip auf dem Microarray unterscheiden. Davon wurde leistungsorientiert das Capture down-Assay zur Weiterentwicklung ausgewählt. Nach zahlreichen Optimierungsmaßnahmen hinsichtlich PCR-Produktbehandlung, gerätespezifischer Abläufe und analysespezifischer Oligonukleotiddesigns stand das Capture down-Assay zur simultanen Typisierung von drei Individuen mit je 32 SNPs auf einem Microarray bereit. Anschließend wurde dieses Verfahren anhand von 40 DNA-Proben mit bekannten Genotypen für die 32 SNPs validiert und durch parallele SNaPshot™-Typisierung die Genauigkeit bestimmt. Das Ergebnis beweist nicht nur die Eignung des validierten Analyseassays und der elektronischen Microarray-Technologie für bestimmte Fragestellungen, sondern zeigt auch deren Vorteile in Bezug auf Schnelligkeit, Flexibilität und Effizienz. Die Automatisierung, welche die räumliche Anordnung der zu untersuchenden Fragmente unmittelbar vor der Analyse ermöglicht, reduziert unnötige Arbeitsschritte und damit die Fehlerhäufigkeit und Kontaminationsgefahr bei verbesserter Zeiteffizienz. Mit einer maximal erreichten Genauigkeit von 94% kann die Zuverlässigkeit der in der forensischen Genetik aktuell eingesetzten STR-Systeme jedoch noch nicht erreicht werden. Die Rolle des neuen Verfahrens wird damit nicht in einer Ablösung der etablierten Methoden, sondern in einer Ergänzung zur Lösung spezieller Probleme wie z.B. der Untersuchung stark degradierter DNA-Spuren zu finden sein.

Advances in methods to detect, isolate and quantify foodborne pathogens

Foodborne diseases impact human health and economies worldwide in terms of health care and productivity loss. Prevention is necessary and methods to detect, isolate and quantify foodborne pathogens play a fundamental role, changing continuously to face microorganisms and food production evolution. Official methods are mainly based on microorganisms growth in different media and their isolation on selective agars followed by confirmation of presumptive colonies through biochemical and serological test. A complete identification requires form 7 to 10 days. Over the last decades, new molecular techniques based on antibodies and nucleic acids allow a more accurate typing and a faster detection and quantification. The present thesis aims to apply molecular techniques to improve official methods performances regarding two pathogens: Shiga-like Toxin-producing Escherichia coli (STEC) and Listeria monocytogenes. In 2011, a new strain of STEC belonging to the serogroup O104 provoked a large outbreak. Therefore, the development of a method to detect and isolate STEC O104 is demanded. The first objective of this work is the detection, isolation and identification of STEC O104 in sprouts artificially contaminated. Multiplex PCR assays and antibodies anti-O104 incorporated in reagents for immunomagnetic separation and latex agglutination were employed. Contamination levels of less than 1 CFU/g were detected. Multiplex PCR assays permitted a rapid screening of enriched food samples and identification of isolated colonies. Immunomagnetic separation and latex agglutination allowed a high sensitivity and rapid identification of O104 antigen, respectively. The development of a rapid method to detect and quantify Listeria monocytogenes, a high-risk pathogen, is the second objective. Detection of 1 CFU/ml and quantification of 10–1,000 CFU/ml in raw milk were achieved by a sample pretreatment step and quantitative PCR in about 3h. L. monocytogenes growth in raw milk was also evaluated.

Entwicklung und Optimierung eines Mikroarray zur Erfassung der genetischen Prädisposition von Atherosklerose

Die Entstehung der Atherosklerose ist ein komplexer Vorgang, der sich durch Ablagerung von Lipiden an der Gefäßwand sowie durch immunologische und inflammatorische Prozesse auszeichnet. Neben konventionellen Risikofaktoren wie Alter, Geschlecht, Rauchen, HDL-Cholesterin, Diabetes mellitus und einer positiven Familienanamnese werden zur Bestimmung des atherosklerotischen Risikos neue Biomarker der inflammatorischen Reaktion untersucht. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Methode zur Diagnostik des Atheroskleroserisikos. Es wurde eine neuartige Chip-Technologie eingesetzt, um das Risiko für eine potentiell drohende atherosklerotische Erkrankung abzuschätzen. Dabei wurde ausgenutzt, dass molekulare Veränderungen in Genen bestimmte Krankheitsbilder auslösen können. rnEs wurde ein molekularbiologischer Test entwickelt, welcher die Untersuchung von genetischen Variationen aus genomischer DNA ermöglicht. Dafür fand die Entwicklung einer Multiplex-PCR statt, deren Produkt mit der Chip-Technologie untersucht werden kann. Dazu wurden auf einem Mikroarray Sonden immobilisiert, mit deren Hilfe genspezifische Mutationen nachgewiesen werden können. So wurden mehrere Gene mit einem geringen Aufwand gleichzeitig getestet. rnDie Auswahl der entsprechenden Marker erfolgte anhand einer Literaturrecherche von randomisierten und kontrollierten klinischen Studien. Der Mikroarray konnte für zwölf Variationen in den acht Genen Prostaglandinsynthase-1 (PTGS1), Endotheliale NO-Synthase (eNOS), Faktor V (F5), 5,10-Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase (MTHFR), Cholesterinester-Transferprotein (CETP), Apolipoprotein E (ApoE), Prothrombin (F2) und Lipoproteinlipase (LPL) erfolgreich etabliert werden. Die Präzision des Biochips wurde anhand der Echtzeit-PCR und der Sequenzierung nachgewiesen. rnDer innovative Mikroarray ermöglicht eine einfache, schnelle und kosteneffektive Genotypisierung von wichtigen Allelen. Viele klinisch relevante Variationen für Atherosklerose können nun in nur einem Test überprüft werden. Zukünftige Studien müssen zeigen, ob die Methode eine Vorhersage über den Ausbruch der Erkrankung und eine gezielte Therapie ermöglicht. Dies wäre ein erster Schritt in Richtung präventive und personalisierter Medizin für Atherosklerose.rn

Identifizierung biogene Amine bildender Bakterien und Einsatz von Enzymen zur Hemmung ihres Wachstums während der Weinbereitung

Mikroorganismen spielen eine wichtige Rolle in der Weinherstellung. Neben ihren positiven Stoffwechselaktivitäten wie die Bildung von Ethanol während der alkoholischen Gärung sind vor allem Bakterien in der Lage, Weinfehler zu verursachen. Einer dieser Weinfehler ist die Produktion von biogenen Aminen. Diese niedermolekularen Stickstoffverbindungen können zu verschiedenen Gesundheitsproblemen wie Bluthochdruck und Migräne führen. Aufgrund von hohen Ethanolgehalten und dem Vorkommen verschiedener biogener Amine kommt es im Wein zu einer Verstärkung dieser physiologischen Effekte. Um die Bildung dieser Verbindungen zu verhindern, ist es von speziellem Interesse, die verantwortlichen Mikroorganismen zu identifizieren und sie in ihrem Wachstum zu hemmen.In einem Teil der Dissertation stand die Isolierung und Identifizierung biogener Amine produzierender Bakterien aus deutschen Jungweinen und Mosten im Vordergrund. Es konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich Milchsäurebakterien als potenzielle Produzenten in Frage kommen. Diese Bakteriengruppe war in hohen Titern in nahezu allen Proben vorhanden und stellt somit eine potentielle Gefahr für die Weinbereitung dar. Zur Identifizierung der Isolate wurden verschiedene molekularbiologische Methoden wie specifically amplified DNA polymorphic-PCR (Fingerprintmethode), Multiplex-PCR oder 16S rDNA-Sequenzierung angewandt. Das Screening bezüglich der Bildung von biogenen Aminen erfolgte mit Hilfe einer im Rahmen dieser Arbeit entwickelten hochauflösenden Dünnschichtchromatographie gefolgt von der Quantifizierung mittels HPLC.Zur Wachstumshemmung dieser Schadbakterien wurden zwei Exoenzyme aus Streptomyces albidoflavus B578 isolieren. Diese Enzyme wurden gereinigt und als eine Muramidase und eine Protease identifiziert. Aktivitätstests konnten zeigen, dass diese Enzyme eine hohe lytische Wirkung gegen weinrelevante Mikroorganismen aufweisen. Ebenso war die Aktivität der Enzyme unter Weinbedingungen sehr stabil. Aufgrund dieser Ergebnisse könnten diese Enzyme eine mögliche Alternative zur Zugabe von Lysozym oder Schwefeldioxid sein, welche konventionell in der Weinbereitung ihren Einsatz finden.

Populationsgenetik kupfer- und bronzezeitlicher Bevölkerungen der osteuropäischen Steppe

Mit der vorliegenden Arbeit wurden erstmals prähistorische Bevölkerungsstrukturen in der osteuropäischen Steppe von der Oberthrakischen Tiefebene bis zur Wolga populationsgenetisch untersucht. Mit Multiplex-PCR und 454-Sequencing wurden von 65 kupfer- und bronzezeitlichen Individuen die Hypervariable Region I und 30 Abschnitte der coding region der mitochondrialen DNA analysiert. Außerdem wurden bis zu 20 putativ selektierte autosomale SNPs und ein geschlechtsspezifischer Locus genotypsiert. Zu Vergleichszwecken wurden veröffentlichte prähistorische DNA-Daten aus Westeurasien und moderne DNA-Sequenzen herangezogen. Die Ergebnisse stützen die Annahme, dass frühneolithische Bauern aus Südosteuropa durch demische Diffusion an der Etablierung der Viehwirtschaft in der Steppe beteiligt waren. Die durchweg niedrigen FST-Werte zwischen der frühbronzezeitlichen Jamnaja-Kultur in der Steppe und den aufeinanderfolgenden neolithischen Kulturen Mitteleuropas sprechen für regelmäßige Kontakte. Die der Jamnaja-Kultur nachfolgende Katakombengrabkultur ist von einem hohen Anteil der in nord- und osteuropäischen Jäger/Sammler-Populationen verbreiteten Haplogruppe U4 geprägt. Niedrige FST-Werte zwischen den prähistorischen Steppenpopulationen und der heutigen Bevölkerung Mittel- und Osteuropas weisen auf genetische Kontinuität hin. Die nukleären Genotypenfrequenzen bestätigt dies. Der moderne europäische Genpool lässt sich nach aktuellem Kenntnisstand auf drei Wurzeln zurückführen: indigene Mesolithiker, frühe Bauern aus dem Nahen Osten und eine nordeurasische Komponente jungpalaeolithischen Ursprungs. Letztere könnte vielleicht über die nordpontische Population in das Erbgut spätneolithischer Europäer gelangt sein.

Entwicklung und Evaluierung von Methoden zur zeitnahen Identifizierung weinrelevanter Mikroorganismen

Hefen der Gattung Saccharomyces und Milchsäurebakterien sind bei der Weinbereitung von besonderer Bedeutung. Neben der alkoholischen Gärung sind Hefen an der Ausbildung von Aromastoffen beteiligt. Milchsäurebakterien spielen eine Rolle beim biologischen Säureabbau (malolaktische Fermentation), können jedoch aufgrund ihrer Stoffwechseleigenschaft weitere Aromamodifikationen bewirken. Die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora zu verschiedenen Zeitpunkten der Weinbereitung hat einen direkten Einfluss auf die Qualität der Weine, welche sich sowohl positiv als auch negativ verändern kann. Daher ist die zuverlässige Identifizierung und Differenzierung verschiedener Mikroorganismen auf Art- aber auch Stamm-Ebene während der Vinifikation von Bedeutung.rnDer erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Differenzierung von Hefearten der Gattung Saccharomyces, welche mit Hilfe konventioneller Methoden nicht eindeutig identifiziert werden können. Unter Verwendung des DNA-Fingerprintverfahrens Specifically Amplified Polymorphic DNA (SAPD)-PCR sowie der Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization-Time-Of-Flight-Mass-Spectrometry (MALDI-TOF-MS) war eine Differenzierung dieser taxonomisch sehr nah verwandten Arten möglich. Weiterhin konnten interspezifische Hybridstämme detektiert werden. In diesem Zusammenhang wurde der Hybridcharakter des Stammes NCYC 3739 (S. cerevisiae x kudriavzevii) entdeckt. Um die Elternspezies eines Hybridstamms zuverlässig zu bestimmen, sind weiterführende Genanalysen notwendig. Hierzu konnte eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse verschiedener genetischer Marker erfolgreich herangezogen werden.rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde weiterhin ein Schnellidentifizierungssystem zum Nachweis weinrelevanter Milchsäurebakterien entwickelt. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik konnten artspezifische Primer generiert werden, welche auf der Grundlage charakteristischer Fragmente der SAPD-PCR abgeleitet wurden. Durch die Anwendung dieser Primer in einer Multiplex-PCR-Reaktion war die Detektion verschiedener, einerseits häufig in Wein vorkommender und andererseits potentiell an der Ausbildung von Weinfehlern beteiligter Milchsäurebakterien-Arten möglich. Die ermittelte Nachweisgrenze dieser Methode lag mit 10^4 - 10^5 Zellen/ml im Bereich der Zelltiter, die in Most und Wein anzutreffen sind. Anhand der Untersuchung verschiedener Weinproben von Winzern in Rheinhessen wurde die Praxistauglichkeit dieser Methode demonstriert. rnUm die gesamten Milchsäurebakterien-Population im Verlauf der Weinbereitung zu kontrollieren, kann die Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese herangezogen werden. Hierzu wurden in dieser Arbeit Primer zur Amplifikation eines Teilbereichs des rpoB-Gens abgeleitet, da dieses Gen eine Alternative zur 16S rDNA darstellt. Die DNA-Region erwies sich als geeignet, um zahlreiche weinrelevante Milchsäurebakterien-Arten zu differenzieren. In einigen ersten Versuchen konnte gezeigt werden, dass diese Methode für eine praktische Anwendung in Frage kommt.rnOenococcus oeni ist das wichtigste Milchsäurebakterien während der malolaktischen Fermentation und wird häufig in Form kommerzieller Starterkulturen eingesetzt. Da verschiedene Stämme unterschiedliche Eigenschaften aufweisen können, ist es von Bedeutung, die Identität eines bestimmten Stammes zweifelsfrei feststellen zu können. Anhand der Analyse verschiedener O. oeni-Stämme aus unterschiedlichen Weinbaugebieten konnte gezeigt werden, dass sowohl die nested SAPD-PCR als auch die MALDI-TOF-MS genügend Sensitivität aufweisen, um eine Unterscheidung auf Stamm-Ebene zu ermöglichen, wobei die mittels nSAPD-PCR ermittelten Distanzen der Stämme zueinander mit deren geographischer Herkunft korrelierte.rnDie in der vorliegenden Arbeit entwickelten Methoden können dazu beitragen, den Prozess der Weinherstellung besser zu kontrollieren und so eine hohe Qualität des Endproduktes zu gewährleisten.rn

Diversity of baculoviruses isolated from cutworms (Agrotis spp.)

Larven der Eulenfalter, Gattung Agrotis (Lepidoptera: Noctuidae), sind Schädlinge in der Landwirtschaft, welche gravierende Fraßschäden an bodennahen Pflanzenteilen verursachen. Häufig kommt es zum Absterben der noch jungen Pflanzen oder zu Beschädigungen der pflanzlichen Produkte, was zu finanziellen Ertragsverlusten führt. Zwei der wichtigsten landwirtschaftlichen Schädlinge der Gattung Agrotis sind die Larven der Saateule (Agrotis segetum) und der Ypsiloneule (Agrotis ipsilon), welche bisher überwiegend mittels chemischer Pestizide bekämpft werden. Als eine umweltfreundliche, nachhaltige und vielversprechende Alternative in der Bekämpfung wird der Einsatz von Baculoviren berücksichtigt. Baculoviren zeichnen sich durch eine hohe Virulenz und einem sehr engen Wirtsbereich aus. Häufig werden nur wenige nah verwandte Arten der gleichen Gattung infiziert. Aus der Gattung Agrotis wurden bisher mindestens vier Baculoviren isoliert und charakterisiert, welche als potentielle biologische Pflanzenschutzmittel in Frage kommen; sie gehören zu zwei Gattungen der Baculoviren: rnAlphabaculovirusrn(i) Agrotis segetum nucleopolyhedrovirus A (AgseNPV-A)rn(ii) Agrotis segetum nucleopolyhedrovirus B (AgseNPV-B)rn(iii) Agrotis ipsilon nucleopolyhedrovirus (AgipNPV)rnBetabaculovirusrn(i) Agrotis segetum granulovirus (AgseGV).rnDie Genome der AgseNPV-A, AgipNPV sowie des AgseGV wurden in vorherigen Studien bereits vollständig sequenziert und publiziert. In der vorgelegten Dissertation wurde das AgseNPV-B sequenziert und umfassend mit AgseNPV-A und AgipNPV verglichen. Das Genom von AgseNPV-B ist 148981 Kbp groß und kodiert ….. offene Leseraster. Phylogenetische Analysen zeigen eine enge Verwandtschaft dieser drei Viren und klassifizieren AgseNPV-B als eine neue Art innerhalb der Gattung Alphabaculovirus. Auf Basis der vorhandenen Genomsequenzen konnte eine PCR-basierende Methode zur Detektion und Quantifizierung on AgseNPV-A, AgseNPV-B, AgipNPV und AgseGV etabliert werden. Dises Verfahren ermöglichte die Quantifizierung von AgseNPV-B und AgseGV in Larven von A. segetum, die von beiden Viren zeitgleichinfiziert waren. Durch das gemeinsame Auftreten dieser beiden Wiren innerhalb eines Wirtsindividuums stellte sich die Frage, welche Art der Interaktion bei einer Ko-Infektion vorliegt. Durch Mischinfektionsversuche von AgseNPV-B und AgseGV konnte gezeigt werden, dass beide Viren um die Ressourcen der Larven konkurrieren. Eine für landwirtschaftliche Zwecke vorteilige Interaktion, wie das vorzeitige Verenden der Larven, das bereits für andere interagierende Baculoviren nachgewiesen wurde, konnte ausgeschlossen werden. Neben den Mischinfektionsversuchen wurden auch AgseGV und AgseNPV-B einzeln auf ihre Eignung als biologisches Pflanzenschutzmittel getestet. AgseGV zeigte in den Laborversuchen eine relativ langsame Wirkung, während AgseNPV-B durchaus Potential für ein rasche Abtötung besitzt. rnDie durchgeführten Aktivitätsstudien und die Charakterisierung von AgseNPV-B als neue Art erlauben ein vertieftes biologisches und molekulares Verständnis des Virus legen den Grundstein für und eine mögliche spätere Zulassung als Pflanzenschutzmittel. Die Methode zur Identifizierung und Quantifizierung der Agrotis-Baculoviren stellt ein wichtiges Instrument in der Qualitätskontrolle für Produzenten dar und ermöglicht zudem weitere Untersuchungen von Agrotis-Baculoviren in Mischinfektionen.

Clonal spread of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in Europe and North America: an international multicentre study

OBJECTIVES: The aim of this study was to determine the phenotypic and genotypic resistance profiles of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) and to examine the clonal distribution in Europe and North America. METHODS: A total of 103 MRSP isolates from dogs isolated from several countries in Europe, the USA and Canada were characterized. Isolates were identified by PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP), antimicrobial susceptibility was determined by broth dilution or gradient diffusion, and antimicrobial resistance genes were detected using a microarray. Genetic diversity was assessed by multilocus sequence typing (MLST), PFGE and spa typing. Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) elements were characterized by multiplex PCR. RESULTS: Thirteen different sequence types (STs), 18 PFGE types and 8 spa types were detected. The hybrid SCCmec element II-III described in a MRSP isolate was present in 75 (72.8%) isolates. The remaining isolates either had SCCmec type III (n=2), IV (n=6), V (n=14) or VII-241 (n=4) or were non-typeable (n=2). The most common genotypes were ST71(MLST)-J(PFGE)-t02(spa)-II-III(SCCmec) (56.3%) and ST68-C-t06-V (12.6%). In addition to mecA-mediated beta-lactam resistance, isolates showed resistance to trimethoprim [dfr(G)] (90.3%), gentamicin/kanamycin [aac(6')-Ie-aph(2')-Ia] (88.3%), kanamycin [aph(3')-III] (90.3%), streptomycin [ant(6')-Ia] (90.3%), streptothricin (sat4) (90.3%), macrolides and/or lincosamides [erm(B), lnu(A)] (89.3%), fluoroquinolones (87.4%), tetracycline [tet(M) and/or tet(K)] (69.9%), chloramphenicol (cat(pC221)) (57.3%) and rifampicin (1.9%). CONCLUSIONS: Two major clonal MRSP lineages have disseminated in Europe (ST71-J-t02-II-III) and North America (ST68-C-t06-V). Regardless of their geographical or clonal origin, the isolates displayed resistance to the major classes of antibiotics used in veterinary medicine and thus infections caused by MRSP isolates represent a serious therapeutic challenge.

Assessment of the prevalence of Trichinella spp. in red foxes and Eurasian lynxes from Switzerland

Trichinella spp. larvae have not been detected in Swiss pigs, horses, or wild boar for many decades, whereas the parasite was repeatedly isolated from red foxes and Eurasian lynxes. Whenever the isolated larvae could be subjected to genotyping, T. britovi was found as infective agent. The present study was initiated to re-assess the epidemiological situation of Trichinella infection in Swiss carnivorous wildlife, namely in red foxes and lynxes. Tissue samples from 1,298 foxes were collected between 2006 and 2007, and those of 55 lynxes between 1999 and 2007. All samples were tested by a standard artificial digestion method and a multiplex-PCR to determine the species and/or genotypes of recovered larvae. Trichinella larvae were found in 21 foxes (1.6%) and 15 lynxes (27.3%), and T. britovi was identified as infecting species in all cases. The geographic distribution of positive foxes showed two main clusters: one in Central Switzerland and one in the West of the country, where also many lynxes were found to be positive. While the prevalence for Trichinella infection in foxes was not statistically correlated with sex or age class, the prevalence in lynx was significantly higher in males compared to females, and in adults compared to juveniles.

Phenotypic and genotypic identification of streptococci and related bacteria isolated from bovine intramammary infections.

BACKGROUND Streptococcus spp. and other Gram-positive, catalase-negative cocci (PNC) form a large group of microorganisms which can be found in the milk of cows with intramammary infection. The most frequently observed PNC mastitis pathogens (major pathogens) are Streptococcus uberis, Strep. dysgalactiae, and Strep. agalactiae. The remaining PNC include a few minor pathogens and a large nonpathogenic group. Improved methods are needed for the accurate identification and differentiation of PNC. A total of 151 PNC were collected from cows with intramammary infection and conclusively identified by 16S rRNA sequencing as reference method. Nine phenotypic microbiological tests (alpha-hemolysis, CAMP reaction, esculin hydrolysis, growth on kanamycin esculin azide agar and on sodium chloride agar, inulin fermentation, hippurate hydrolysis, leucine aminopeptidase and pyrrolidonyl peptidase activity), multiplex PCR for the three major pathogens (target genes for Strep. uberis, Strep. dysgalactiae and Strep. agalactiae: pauA, 16S rRNA, and sklA3, respectively), and mass spectroscopy using the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF MS) were evaluated for the diagnosis and discrimination of the three clinically most relevant PNC. RESULTS The probability that a strain of Strep. uberis, Strep. dysgalactiae and Strep. agalactiae was correctly identified by combining the results of the 9 phenotypic tests was 92%, 90%, and 100%, respectively. Applying the multiplex PCR, all strains of the three major pathogens were correctly identified and no false positive results occurred. Correct identification was observed for all strains of Strep. uberis and Strep. agalactiae using MALDI-TOF MS. In the case of Strep. dysgalactiae, some variability was observed at the subspecies level, but all strains were allocated to one single cluster. CONCLUSIONS The results of the present study show that reliable identification of the clinically most relevant PNC (Strep. uberis, Strep. agalactiae and Strep. dysgalactiae) can be obtained by use of a combination of colony morphology, hemolysis type and catalase reaction, and a multiplex PCR with specific primers restricted to these 3 pathogens. The MALDI-TOF MS is a fast method that shows promising results, although identification of Strep. dysgalactiae at the subspecies level is not yet satisfactory.

One-Step Identification of Five Prominent Chicken Salmonella Serovars and Biotypes.

Based on bacterial genomic data, we developed a one-step multiplex PCR assay to identify Salmonella and simultaneously differentiate the two invasive avian-adapted S. enterica serovar Gallinarum biotypes Gallinarum and Pullorum, and the most frequent, specific, and asymptomatic colonizers of chickens, serovars Enteritidis, Heidelberg, and Kentucky.

Detecção de Enterococcus resistentes a vancomicina em criações comerciais de ovinos e caprinos das regiões centro-leste e nordeste do Estado de São Paulo

As exigências das condições higiênico-sanitárias na produção de animais de interesse zootécnico vêm aumentando progressivamente dada à necessidade de aliar-se produtividade a produtos de alta qualidade para atender a mercados consumidores cada vez mais exigentes. Nesse sentido, a utilização de antimicrobianos, tanto na profilaxia como na terapêutica, permanece como estratégia de controle para vários microrganismos patogênicos, de importância não apenas para a produção animal como também para a saúde humana, ainda que restrições ao uso indiscriminado desses produtos têm se intensificado. Não obstante, o uso excessivo desses produtos está associado à seleção de microrganismos resistentes nas áreas de produção. Por outro lado, investigações sobre circulação de cepas resistentes em rebanhos animais, até então restritas a populações humanas, ainda permanecem limitadas no Brasil. Bactérias do gênero Enterococcus, integrantes usuais da microbiota gastrointestinal animal e humana, são indicadoras ambientais de contaminação fecal e tem-se tornado objeto de preocupação em saúde pública e veterinária dada a ocorrência de cepas resistentes à vancomicina (VRE). O presente trabalho teve como objetivo isolar, quantificar e caracterizar VRE presentes em amostras fecais de ovinos oriundos de pequenas propriedades das regiões centro-leste e nordeste do estado de São Paulo. Para tanto, 132 amostras fecais foram coletadas diretamente do reto dos animais ou do piso das instalações. As amostras foram semeadas em ágar m-Enterococcus e subcultivadas em Ágar Bile Esculina acrescido de 6 µg/mL de vancomicina (ABEV), para confirmação de Enterococcus spp e detecção de cepas resistentes. Procedeu-se igualmente a observação da morfologia, características tintoriais, bioquímicas e moleculares. O número máximo de Enterococcus spp. encontrado foi de 2,6 × 105 e 1,70 × 105 UFC/g de fezes do ambiente e dos animais, respectivamente. Na caracterização bioquímica espécies mais prevalentes foram: Enterococcus faecalis e Vagococcus fluvialis. No ABEV, houve crescimento de colônias VRE em 33 das 84 amostras de ovinos-caprinos e em 21 das 48 amostras ambientais, representando, respectivamente 46,7% e 29,3% das amostras analisadas. A análise por multiplex PCR das 54 cepas VRE obtidas indicaram que 23 (43%), 22 (41%), 2 (3,5%) e 2 (3,5%) foram positivas, respectivamente, para os genes vanC2/C3, vanC1, vanA e vanB, sendo que para 5,3% dos isolados nenhum produto foi amplificado, sugerindo a possível ocorrência de genes dos demais grupos van conhecidos entre os isolados. Os resultados obtidos indicam, de forma inédita no país, a circulação de VRE em propriedades produtoras de ovinos e caprinos, sem ocorrência de manifestações clínicas aparentes nos animais, porém com possíveis riscos à saúde dos produtores e profissionais envolvidos, bem como a eventuais consumidores.

Isolation and characterization of microorganisms with probiotic potential

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016

Analyse de la distribution d'Escherichia coli, utilisée comme un marqueur microbiologique, dans un réseau de production porcin

La présence d’Escherichia coli pathogènes en élevages porcins entraine des retards de croissance et la mortalité. La transmission des E. coli pathogènes entre les élevages et l'abattoir d’un même réseau de production n'est pas bien décrite. La détection des gènes de virulence des E. coli pathogènes pourrait permettre d’identifier un marqueur de contamination dans le réseau. L’objectif de cette étude a été d’identifier un marqueur de contamination E. coli dans un réseau de production porcine défini afin de décrire certains modes de transmission des E. coli pathogènes. Pour ce faire, une région géographique comprenant 10 fermes d’engraissement, un abattoir et un réseau de transport a été sélectionnée. Trois lots de production consécutifs par ferme ont été suivis pendant 12 mois. Des échantillons environnementaux ont été prélevés à l’intérieur et à l’extérieur des fermes (3 visites d’élevage), dans la cour de l’abattoir (2 visites lors de sorties de lot) et sur le camion de transport. La détection des gènes de virulence (eltB, estA, estB, faeG, stxA, stx2A, eae, cnf, papC, iucD, tsh, fedA) dans les échantillons a été réalisée par PCR multiplexe conventionnelle. La distribution temporelle et spatiale des gènes de virulence a permis d’identifier le marqueur de contamination ETEC/F4 défini par la détection d’au moins un gène d’entérotoxine ETEC (estB, estA et eltB) en combinaison avec le gène de l’adhésine fimbriaire (faeG). La distribution des échantillons positifs ETEC/F4 qualifie la cour de l’abattoir comme un réservoir de contamination fréquenté par les transporteurs, vecteurs de contamination entre les élevages. Ceci suggère le lien microbiologique entre l’élevage, les transporteurs et l’abattoir jouant chacun un rôle dans la dissémination des microorganismes pathogènes et potentiellement zoonotiques en production porcine.

Development of an oligonucleotide-based SNP detection method on lateral flow strips using hexapet tages

Detection of point mutations or single nucleotide polymorphisms (SNPs) is important in relation to disease susceptibility or detection in pathogens of mutations determining drug resistance or host range. There is an emergent need for rapid detection methods amenable to point-of-care applications. The purpose of this study was to reduce to practice a novel method for SNP detection and to demonstrate that this technology can be used downstream of nucleic acid amplification. The authors used a model system to develop an oligonucleotide-based SNP detection system on nitrocellulose lateral flow strips. To optimize the assay they used cloned sequences of the herpes simplex virus-1 (HSV-1) DNA polymerase gene into which they introduced a point mutation. The assay system uses chimeric polymerase chain reaction (PCR) primers that incorporate hexameric repeat tags ("hexapet tags"). The chimeric sequences allow capture of amplified products to predefined positions on a lateral flow strip. These "hexapet" sequences have minimal cross-reactivity and allow specific hybridization-based capture of the PCR products at room temperature onto lateral flow strips that have been striped with complementary hexapet tags. The allele-specific amplification was carried out with both mutant and wild-type primer sets present in the PCR mix ("competitive" format). The resulting PCR products carried a hexapet tag that corresponded with either a wild-type or mutant sequence. The lateral flow strips are dropped into the PCR reaction tube, and mutant sequence and wild-type sequences diffuse along the strip and are captured at the corresponding position on the strip. A red line indicative of a positive reaction is visible after 1 minute. Unlike other systems that require separate reactions and strips for each target sequence, this system allows multiplex PCR reactions and multiplex detection on a single strip or other suitable substrates. Unambiguous visual discrimination of a point mutation under room temperature hybridization conditions was achieved with this model system in 10 minutes after PCR. The authors have developed a capture-based hybridization method for the detection and discrimination of HSV-1 DNA polymerase genes that contain a single nucleotide change. It has been demonstrated that the hexapet oligonucleotides can be adapted for hybridization on the lateral flow strip platform for discrimination of SNPs. This is the first step in demonstrating SNP detection on lateral flow using the hexapet oligonucleotide capture system. It is anticipated that this novel system can be widely used in point-of-care settings.