Etablierung und Anwendung von biophysikalischen und molekularbiologischen Methoden zur Untersuchung von Wirkmechanismen neuer Indol-, Carbazol- und Oligopyrrolcarboxamid-Derivate als potentielle antitumoraktive Stoffe

Im Rahmen der gezielten Suche nach neuen Leitstrukturen mit antitumoraler Wirkung werden im Arbeitskreis U. Pindur seit Jahren verschiedene Strukturvarianten der Indol-, Carbazol und Pyrrol-Reihe studiert. Durch die Vielzahl neu synthetisierter Verbindungen war es erforderlich, geeignete Screening-Verfahren für die Routineanalyse zu etablieren, die möglichst früh vielversprechende Substanzen detektieren können.Zwei bedeutsame Targets der antitumoralen Wirkstoffe sind die DNA und die Topoisomerase I. Demzufolge war es das Kernziel dieser Arbeit, in erster Linie Assay-Verfahren zu studieren und neu zu etablieren, die eine Wechselwirkung von neu-synthetisierten Verbindungen mit diesen Targets nachweisen könnten.Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier Assay-Verfahren neu etabliert und für die Routineanwendung optimiert: die Bestimmung der DNA-Schmelztemperatur, der Ethidiumbromid-Verdrängungsassay, der Unwinding-Assay und die Bestimmung der Topoisomerase I-Hemmung.Mit diesen vier Methoden, die mit Hilfe neuer Synthesesubstanzen und bekannter Standard-Cytostatika in dieser Arbeit aufgebaut, validiert und optimiert wurden, und mit den Ergebnissen der Zytotoxizitätsbestimmung, die im National Cancer Institute durchgeführt wurde, sollten nun erste Basisinformationen zum zukünftigen Aufbau von Struktur-Wirkungsbeziehungen der im Arbeitskreis U. Pindur synthetisierten Verbindungen geliefert werden.Aus der Analyse der Problematik bei der Durchführung der Assays zur Bestimmung der Wechselwirkungen mit der DNA und der damit ermittelten Ergebnisse hat sich eine Reduktion der Lipophilie der Testverbindungen als besonders wichtig herausgestellt, denn die meisten Assays werden in wäßrigem Puffer durchgeführt.In Hinblick auf Struktur-Wirkungsbeziehungen der neu synthetisierten Verbindungen konnten ausgehend von den bisherigen Ergebnissen erste vororientierende Korrelationen zwischen den verschiedenen Assay-Daten aufgestellt werden. Allerdings konnte auf Grund der Heterogenität der rationalen Hintergründe der Testverfahren und der Heterogenität der untersuchten Stoffgruppen noch kein einheitliches weiterführendes Strukturkonzept erarbeitet werden. Lediglich bei den Pyrrolcarboxamid-Derivaten konnte unter Berücksichtigung folgender Informationen eine weitergehende Strukturoptimierung vorgenommen werden. Eine terminale Dimethylaminopropyl-Gruppe sowie mindestens zwei Pyrroleinheiten bzw. drei amidische Gruppen bei den DNA-rinnenbindenden Pyrrolcarboxamid-Ketten sind erforderlich, um eine Wechselwirkung mit der DNA zu erreichen. Der interkalierende Teil der als potentielle „Combilexine“ entwickelten Oligopyrrolcarboxamid-Derivate sollte eine große Affinität zur DNA aufweisen, sonst scheint dieser Strukturabschnitt eher einen sterischen Störeffekt bei der Bindung in die Rinnen der Seitenkette hervorzurufen.Eine Analyse der erforderlichen strukturellen Eigenschaften für die Wechselwirkung mit der Topoisomerase I war nicht möglich, denn Testverbindungen unterschiedlichster Struktur haben eine Hemmung dieses Enzyms gezeigt. Weiterhin ist keine Korrelation zwischen der DNA-Affinität und der Fähigkeit zur Hemmung der Topo I festzustellen. Dennoch konnte die zytotoxische Wirkung bei einer Vielzahl von Verbindungen mit einer Hemmung der Topoisomerase I erklärt.Auf Grund der vorliegenden Ergebnisse sollten nun weitere Verbindungen gezielter synthetisiert werden, deren Analyse mit Hilfe der im Rahmen dieser Arbeit etablierten Verfahren zur Aufklärung weiterer essentieller Punkte für die Wechselwirkung mit der DNA und den Topoisomerasen führen soll.

Die Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen

„Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen“ Das Glycoprotein MUC1 ist in Tumorepithelzellen sonderlich stark überexprimiert und wegen der vorzeitig einsetzenden Sialylierung sind die Saccharid-Epitope der O-Glycanketten stark verkürzt (sog. tumorassoziierte Antigene). Dadurch werden auch bisher verborgene Peptidepitope des Glycoprotein-Rückgrates auf der Zelloberfläche der Epithelzellen zugänglich, die als fremd von den Zellen des Immunsystems erkannt werden können. Dies macht das MUC1-Zelloberfächenmolekül zu einem Zielmolekül in der Entwicklung von Tumorvakzinen. Diese beiden strukturellen Besonderheiten wurden in der Synthese von Glycohexadecapeptiden verbunden, indem die veränderten tumorassoziierten Saccharidstrukturen TN-, STN- und T-Antigen als Glycosylaminosäure-Festphasenbausteine synthetisiert wurden und in das Peptidepitop der Wiederholungseinheit des MUC1 durch Glycopeptid-Festphasensynthese eingebaut wurden. Wegen der inhärenten schwachen Immunogenität der kurzen Glycopeptide müssen die synthetisierten Glycopeptidstrukturen an ein Trägerprotein, welches das Immunsystem stimuliert, gebunden werden. Zur Anbindung der Glycopeptide ist ein selektives Kupplungsverfahren nötig, um definierte und strukturell einheitliche Glycopeptid-Protein-Konjugate zu erhalten. Es konnte eine neue Methode entwickelt werden, bei der die Konjugation durch eine radikalische Additionsreaktion von als Allylamide funktionalisierten Glycopeptiden an ein Thiol-modifiziertes Trägerprotein erfolgte. Dazu wurde anhand von synthetisierten, als Allylamide modifizierten Modellaminosäuren untersucht, ob diese Reaktion generell für eine Biokonjugation geeignet ist und etwaige Nebenreaktionen auftreten können. Mit dieser Methode konnten verschiedene MUC1-Glycopeptid-Trägerprotein-Konjugate hergestellt werden, deren immunologische Untersuchung noch bevorsteht. Das tumorassoziierte MUC1 nimmt in der immundominanten Region seiner Wiederholungseinheit eine knaufartige Struktur ein. Für die Entwicklung von selektiven Tumorvakzinen ist es von großer Bedeutung möglichst genau die Struktur der veränderten Zelloberflächenmoleküle nachzubilden. Durch die Synthese von cyclischen (Glyco)Peptiden wurde dieses Strukturelement fixiert. Dazu wurden olefinische Aminosäure Festphasenbausteine hergestellt, die zusammen mit den oben genannten Glycosylaminosäuren mittels einer Glycopeptid-Festphasensynthese in acyclische Glycopeptide eingebaut wurden. Diese wurden dann durch Ringschlussmetathese zyklisiert und im Anschluss reduziert und vollständig deblockiert. In einem dritten Projekt wurde der Syntheseweg zur Herstellung einer C-Glycosylaminosäure mit einer N-Acetylgalactosamin-Einheit entwickelt. Wichtige Schritte bei der von Glucosamin ausgehenden Synthese sind die Keck-Allylierung, eine Epimerisierung, die Herstellung eines Brom-Dehydroalanin-Derivates und eine B-Alkyl-Suzuki-Miyaura-Kreuzkupplung sowie Schutzgruppenoperationen. Der racemische Baustein konnte dann in der Peptid-Festphasensynthese eines komplexen MUC1-Tetanustoxin-Konjugates eingesetzt werden.

Structure formation as studied by EPR spectroscopy: From simple solutions to nanoparticles

In this thesis, three nitroxide based ionic systems were used to investigate structure and dynamics of their respective solutions in mixed solvents by means of electron paramagnetic resonance (EPR) and electron nuclear double resonance (ENDOR) spectroscopy at X- and W-band (9.5 and 94.5 GHz, respectively). rnFirst, the solvation of the inorganic radical Fremy’s salt (K2ON(SO3)2) in isotope substituted binary solvent mixtures (methanol/water) was investigated by means of high-field (W-band) pulse ENDOR spectroscopy and molecular dynamics (MD) simulations. From the analysis of orientation-selective 1H and 2H ENDOR spectra the principal components of the hyperfine coupling (hfc) tensor for chemically different protons (alcoholic methyl vs. exchangeable protons) were obtained. The methyl protons of the organic solvent approach with a mean distance of 3.5 Å perpendicular to the approximate plane spanned by ON(S)2 of the probe molecule. Exchangeable protons were found to be distributed isotropically, approaching closest to Fremy’s salt from the hydrogen-bonded network around the sulfonate groups. The distribution of exchangeable and methyl protons as found in MD simulations is in full agreement with the ENDOR results. The solvation was found to be similar for the studied solvent ratios between 1:2.3 and 2.3:1 and dominated by an interplay of H-bond (electrostatic) interactions and steric considerations with the NO group merely involved into H-bonds.rnFurther, the conformation of spin labeled poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDADMAC) solutions in aqueous alcohol (methanol, ethanol, n-propanol, ethylene glycol, glycerol) mixtures in dependence of divalent sodium sulfate was investigated with double electron-electron resonance (DEER) spectroscopy. The DEER data was analyzed using the worm-like chain model which suggests that in organic-water solvent mixtures the polymer backbones are preferentially solvated by the organic solvent. We found a less serve impact on conformational changes due to salt than usually predicted in polyelectrolyte theory which stresses the importance of a delicate balance of hydrophobic and electrostatic interactions, in particular in the presence of organic solvents.rnFinally, the structure and dynamics of miniemulsions and polymerdispersions prepared with anionic surfactants, that were partially replaced by a spin labeled fatty acid in presence and absence of a lanthanide beta-diketonate complex was characterized by CW EPR spectroscopy. Such miniemulsions form multilayers with the surfactant head group bound to the lanthanide ion. Beta-diketonates were formerly used as NMR shift reagents and nowadays find application as luminescent materials in OLEDs and LCDs and as contrast agent in MRT. The embedding of the complex into a polymer matrix results in an easy processable material. It was found that the structure formation takes place in miniemulsion and is preserved during polymerization. For surfactants with carboxyl-head group a higher order of the alkyl chains and less lateral diffusion is found than for sulfat-head groups, suggesting a more uniform and stronger coordination to the metal ion. The stability of these bilayers depends on the temperature and the used surfactant which should be considered for the used polymerization temperature if a maximum output of the structured regions is wished.

Structure and dynamics of ionic liquid,electrode interfaces

In the early 20th century, Gouy, Chapman, and Stern developed a theory to describe the capacitance and the spatial ion distribution of diluted electrolytes near an electrode. After a century of research, considerable progress has been made in the understanding of the electrolyte/electrode interface. However, its molecular-scale structure and its variation with an applied potential is still under debate. In particular for room-temperature ionic liquids, a new class of solventless electrolytes, the classical theories for the electrical double layer are not applicable. Recently, molecular dynamics simulations and phenomenological theories have attempted to explain the capacitance of the ionic liquid/electrode interface with the molecular-scale structure and dynamics of the ionic liquid near the electrode. rnHowever, experimental evidence is very limited. rnrnIn the presented study, the ion distribution of an ionic liquid near an electrode and its response to applied potentials was examined with sub-molecular resolution. For this purpose, a new sample chamber was constructed, allowing in situ high energy X-ray reflectivity experiments under potential control, as well as impedance spectroscopy measurements. The combination of structural information and electrochmical data provided a comprehensive picture of the electric double layer in ionic liquids. Oscillatory charge density profiles were found, consisting of alternating anion- and cation-enriched layers at both, cathodic and anodic, potentials. This structure was shown to arise from the same ion-ion correlations dominating the liquid bulk structure that were observed as a distinct X-ray diffraction peak. Therefore, existing physically motivated models were refined and verified by comparison with independent measurements. rnrnThe relaxation dynamics of the interfacial structure upon potential variation were studied by time resolved X-ray reflectivity experiments with sub-millisecond resolution. The observed relaxation times during charging/discharging are consistent with the impedance spectroscopy data revealing three processes of vastly different characteristic time-scales. Initially, the ion transport normal to the interface happens on a millisecond-scale. Another 100-millisecond-scale process is associated with molecular reorientation of electrode-adsorbed cations. Further, a minute-scale relaxation was observed, which is tentatively assigned to lateral ordering within the first layer.