Inhibition allergenspezifischer Immunantworten im Mausmodell der Typ-I Allergie nach biolistischer Vakzinierung mit allergenkodierenden Plasmiden in Kombination mit für immunmodulatorische Moleküle kodierender Plasmid-DNA

Die Induktion von Toleranz spielt bei der Inhibition allergischer Immunreaktionen eine wichtige Rolle. Hierbei ist die Induktion regulatorischer T Zellen (Treg) von großer Bedeutung. Da zu einer erfolgreichen Behandlung von allergischen Erkrankungen bisher nur wenige Therapiemöglichkeiten zur Verfügung stehen wie die spezifische Immuntherapie (SIT), die allerdings nicht immer zum Erfolg führt, ist es wichtig neue Therapieformen zu entwickeln. rnIn dieser Arbeit wurde daher die biolistische DNA-Immunisierung mit Kombinations-Vakzinen bestehend aus einem allergenkodierenden Plasmid (βGalaktosidase (βGal)) in Kombination mit einem Plasmid, welches für ein immunmodulatorisches Molekül kodiert (Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO), Transforming Growth Factor beta (TGF-β) oder Interleukin-10 (IL-10)), durchgeführt und im Mausmodell der allergeninduzierten IgE-vermittelten Atemwegsinflammation auf ihre Wirksamkeit untersucht. Die Expression des Allergens zusammen mit dem immunregulatorischen Molekül in transfizierten Dendritischen Zellen (DCs) sollte zu einer Induktion von Treg führen und somit eine Suppression der Immunantwort bewirken. rnIn den Versuchen wurde zunächst der Effekt einer Transgenexpression unter der Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors mit dem der Transgenexpression unter der Kontrolle des Fascin-Promotors, der eine Genxpression spezifisch in DCs erlaubt, verglichen. Hierbei stellte sich heraus, dass es wichtig ist die Expression des Antigens mit Hilfe des Fascin-Promotors auf DCs zu beschränken. Einzig in diesem Fall konnte nach der Vakzinierung ein inhibitorischer Effekt auf die Entwicklung einer Atemwegshyperreaktivität durch Expression des Immunmodulatoren IDO beobachtet werden. Es zeigte sich auch, dass es von Vorteil ist, wenn das immunregulatorische Molekül unter Verwendung des CMV-Promotors in allen transfizierten Zellen exprimiert wird. Dies bewirkt, dass IDO in ausreichenden Konzentrationen vorhanden ist. rnDie Expression von βGal unter der Kontrolle des Fascin-Promotors (pFascin-βGal) in Kombination mit der Expression der Moleküle IL-10, TGF-β oder IDO unter Kontrolle des CMV-Promotors (pCMV-IL-10, pCMV-TGFβ, pCMV-IDO) bewirkte eine Immunsupprimierung, die sich in einer inhibierten Produktion antigenspezifischer Antikörper, einer verminderten Zytokin-Produktion, einer reduzierten Induktion zytotoxischer T-Zellen und in einer Inhibition der allergeninduzierten Atemwegshyperreaktivität zeigte, im Vergleich zu einer Vakzinierung mit pFascin-βGal in Kombination mit einem Kontroll-Plasmid. Bei nachfolgender Proteinsensibilisierung blieben diese Effekte jedoch nicht bestehen. Einzig durch Vakzinierung mit IL-10-kodierenden Plasmiden konnte eine moderate Verminderung der Atemwegsreaktivität nachgewiesen werden. rnIn einem therapeutischen Modell der Atemwegsinflammation, in dem die Mäuse vor der DNA-Immunisierung mit dem Protein sensibilisiert wurden, wurde demonstriert, dass im Vergleich zu Mäusen, die nur mit dem Protein sensibilisiert wurden, eine DNA-Immunisierung mit pFascin-βGal aber auch mit pCMV-βGal einen inhibierenden Einfluss auf die Entwicklung einer Atemwegsinflammation hat. Eine weitere Reduktion der Atemwegsreaktivität durch eine kombinierte Vakzinierung mit pCMV-IDO wurde nur erreicht, wenn βGal unter der Kontrolle des Fascin-Promotors exprimiert wurde, nicht aber unter Kontrolle des CMV-Promotors.rn

Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-Rezeptor

Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-RezeptorDie kontaktabhängige Wachstumshemmung, Kontaktinhibition, basierend auf der Interaktion von Contactinhibin (Ci) und seinem Rezeptor (CiR), reguliert das Zellwachstum. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Signalweiterleitung über den CiR.Der transformierende Wachstumsfaktor TGF-beta führt in den meisten Zelltypen wie die Kontaktinhibition zum Zellzyklusstopp in der G1-Phase. Um mögliche Interaktionen der beiden Signalkaskaden zu untersuchen, wurden humane Keratinozyten (HaCaT) mit einem dominant-negativen TGF-beta-Rezeptor Typ II stabil transfiziert. Das Ausschalten des TGF-beta-Signalweges resultierte in einer erhöhten Sättigungsdichte und Aufhebung der Kontaktinhibition. Die durch Kontaktinhibition induzierte Zunahme der Expression der TGF-beta-mRNA bestätigte die mögliche Interaktion der beiden Signalwege.In einem weiteren Ansatz sollte die Proteinkinase C (PKC) als möglicher Second Messenger der Kontaktinhibition untersucht werden. Die Herunterregulierung der PKC-Isoformen alpha, delta, epsilon und mu nach Langzeit-Behandlung mit 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat führte in humanen Fibroblasten (FH109) zu einer Reduktion der Kontaktinhibition. Nur durch Inkubation mit dem spezifischen Inhibitor der delta-Isoform Rottlerin konnte die Kontaktinhibition vollständig aufgehoben werden. Eine Beteiligung der PKC-delta in die Kontaktinhibition wurde dadurch bestätigt, daß sowohl die Stärke ihrer Proteinexpression als auch ihre intrazelluläre Verteilung über Zell-Zellkontakte reguliert wurde. Außerdem führte die transiente Transfektion von Maus-Fibroblasten, NIH3T3, mit einer dominant-negativen Mutante der PKC-delta zu einem transformierten Phänotyp.

Die Rolle von Chemokinrezeptor CXCR4 und Connective Tissue Growth Factor innerhalb der Tumor-Stroma-Interaktion in der akuten myeloischen Leukämie

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene Erkrankung der hämatopoetischen Vorläuferzelle, die durch unkontrollierte Vermehrung und ein reduziertes Differenzierungsverhalten gekennzeichnet ist. Aufgrund von Therapieresistenzen und häufig vorkommenden Rückfällen ist die AML mit einer schlechten Langzeitprognose verbunden. Neue Studienergebnisse zeigen, dass leukämische Zellen einer hierarchischen Ordnung unterliegen, an deren Spitze die leukämische Stammzelle (LSC) steht, welche den Tumor speist und ähnliche Charakteristika besitzt wie die hämatopoetische Stammzelle. Die LSC nutzt den Kontakt zu Zellen der hämatopoetischen Nische des Knochenmarks, um die erste Therapie zu überdauern und Resistenzen zu erwerben. Neue Therapieansätze versuchen diese Interaktion zwischen leukämischen Zellen und supportiv wirkenden Stromazellen anzugreifen. rnrnIn dieser Arbeit sollte die Bedeutung des CXC-Motiv Chemokinrezeptors Typ 4 (CXCR4) und des Connective Tissue Growth Factors (CTGF) innerhalb der AML-Stroma-Interaktion untersucht werden. CXCR4, der in vivo dafür sorgt, dass AML-Zellen in der Nische gehalten und geschützt werden, wurde durch den neuwertigen humanen CXCR4-spezifischen Antikörper BMS-936564/MDX-1338 in AML-Zelllinien und Patientenzellen in Zellkulturversuchen blockiert. Dies induzierte Apoptose sowie Differenzierung und führte in Kokulturversuchen zu einer Aufhebung des Stroma-vermittelten Schutzes gegenüber der Chemotherapie. Für diese Effekte musste teilweise ein sekundärer Antikörper verwendet werden, der die CXCR4-Moleküle miteinander kreuzvernetzt.rnDie Auswertung eines quantitativen Real time PCR (qPCR)-Arrays ergab, dass CTGF in der AML-Zelllinie Molm-14 nach Kontakt zu Stromazellen hochreguliert wird. Diese Hochregulation konnte in insgesamt drei AML-Zelllinien sowie in drei Patientenproben in qPCR- und Western Blot-Versuchen bestätigt werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass diese Hochregulation (i) unabhängig von der Stromazelllinie ist, (ii) den direkten Kontakt zum Stroma benötigt und (iii) auch unter hypoxischen Bedingungen, wie sie innerhalb des Knochenmarks vorherrschen, stattfindet. Der durch Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Kontakt gesteuerte Hippo-Signalweg konnte aus folgenden Gründen als möglicher upstream-Regulationsmechanismus identifiziert werden: (i) Dessen zentraler Transkriptions-Kofaktor TAZ wurde in kokultivierten Molm-14-Zellen stabilisiert, (ii) der shRNA-gesteuerte Knockdown von TAZ führte zu einer reduzierten CTGF-Hochregulation, (iii) CTGF wurde in Abhängigkeit von der Zelldichte reguliert, (iv) Cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61), ein weiteres Zielgen von TAZ, wurde in kokultivierten AML-Zellen ebenfalls verstärkt exprimiert. Der Knockdown von CTGF führte in vitro zu einer partiellen Aufhebung der Stroma-vermittelten Resistenz und die Blockierung von CTGF durch den Antikörper FG-3019 wirkte im AML-Mausmodell lebensverlängernd. rn rnDie Rolle von CTGF in der AML ist bisher nicht untersucht. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass CTGF ein interessantes Therapieziel in der AML darstellt. Es bedarf weiterer Untersuchungen, um die Bedeutung von CTGF in der Tumor-Stroma-Interaktion näher zu charakterisieren und nachgeschaltete Signalwege zu identifizieren.

Prozessierung des humanen GARP–Rezeptors und die physiologischen Auswirkungen

GARP (Glycoprotein A Repetitions Predominant) ist ein Oberflächenrezeptor auf regulatorischen T–Zellen (TRegs), der den latenten TGF–β (Transforming Growth Factor–β) bindet. Ein Funktionsverlust von T Regs hat gravierende Autoimmunerkrankungen wie das Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X–linked Syndrome (IPEX), Multiple Sklerose (MS) oder Rheumatoide Arthritis (RA) zur Folge. GARP stellt über eine Erhöhung der Aktivierbarkeit von TGF–β den regulatorischen Phänotyp von TRegs sicher und inhibiert die Ausbreitung von autoreaktiven TH17 Zellen.rn In dieser Arbeit stand die Regulation von GARP selbst im Mittelpunkt. Es konnte gezeigt werden, dass es sich innerhalb der kiefertragenden Vertebraten um ein strikt konserviertes Protein handelt. Datenbankanalysen machten deutlich, dass es zuerst in basalen Knochenfischen zusammen mit anderen Komponenten der adaptiven Immunantwort auftritt. Ein 3D–Modell, welches über Homologiemodellierung erstellt wurde, gab Aufschluss über die Struktur des Rezeptors und mögliche intramolekulare Disulfidbrücken. Für in vitro Versuche wurde eine lösliche Variante von GARP durch einen Austausch der Transmembrandomäne durch C–terminale Meprin α Domänen konstruiert. Diese Variante wurde in der eukaryotischen Zellkultur zuverlässig in den Überstand sezerniert und konnte chromatografisch gereinigt werden. Mit diesem rekombinanten GARP wurden Prozessierungsversuche mit Autoimmunpathogenese assoziierten Proteasen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Serinproteasen Trypsin, Neutrophile Elastase und Plasmin, sowie die Metalloprotease MMP2 in der Lage sind, GARP vollständig zu degradieren. In TGF–β sensitiven Proliferationsuntersuchungen stellte sich heraus, dass die entstandenen Fragmente immer noch in der Lage waren die Aktivierbarkeit von TGF–β zu erhöhen. Neben der Degradierung durch die oben genannten Proteasen konnte ebenfalls beobachtet werden, dass MMP9 und Ovastacin in der Lage sind GARP spezifisch zu schneiden. Ovastacin mRNA wurde in dieser Arbeit das erste Mal außerhalb der Oocyte, in T–Zellen beschrieben. Mit GARP wurde zudem das zweite Proteinsubstrat, neben dem Zona Pellucida Protein 2 identifiziert. Das durch MMP9 erzeugte N–terminale Fragment besitzt zwar die Eigenschaft, an TGF–β zu binden, kann aber die Aktivierbarkeit von TGF–β nicht mehr wie das intakte GARP erleichtern. rnDiese Arbeit zeigte, dass GARP durch Proteolyse reguliert wird, wobei die entstehenden Fragmente unterschiedlichen Einfluss auf die Aktivierbarkeit von TGF–β haben. Dieses Wissen bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen im translationalen Forschungsbereich, um die gewonnenen Erkenntnisse zur Immunmodulation in der Therapie verschiedener Krankheiten einsetzen zu können.rn