Prozessierung des humanen GARP–Rezeptors und die physiologischen Auswirkungen

GARP (Glycoprotein A Repetitions Predominant) ist ein Oberflächenrezeptor auf regulatorischen T–Zellen (TRegs), der den latenten TGF–β (Transforming Growth Factor–β) bindet. Ein Funktionsverlust von T Regs hat gravierende Autoimmunerkrankungen wie das Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X–linked Syndrome (IPEX), Multiple Sklerose (MS) oder Rheumatoide Arthritis (RA) zur Folge. GARP stellt über eine Erhöhung der Aktivierbarkeit von TGF–β den regulatorischen Phänotyp von TRegs sicher und inhibiert die Ausbreitung von autoreaktiven TH17 Zellen.rn In dieser Arbeit stand die Regulation von GARP selbst im Mittelpunkt. Es konnte gezeigt werden, dass es sich innerhalb der kiefertragenden Vertebraten um ein strikt konserviertes Protein handelt. Datenbankanalysen machten deutlich, dass es zuerst in basalen Knochenfischen zusammen mit anderen Komponenten der adaptiven Immunantwort auftritt. Ein 3D–Modell, welches über Homologiemodellierung erstellt wurde, gab Aufschluss über die Struktur des Rezeptors und mögliche intramolekulare Disulfidbrücken. Für in vitro Versuche wurde eine lösliche Variante von GARP durch einen Austausch der Transmembrandomäne durch C–terminale Meprin α Domänen konstruiert. Diese Variante wurde in der eukaryotischen Zellkultur zuverlässig in den Überstand sezerniert und konnte chromatografisch gereinigt werden. Mit diesem rekombinanten GARP wurden Prozessierungsversuche mit Autoimmunpathogenese assoziierten Proteasen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Serinproteasen Trypsin, Neutrophile Elastase und Plasmin, sowie die Metalloprotease MMP2 in der Lage sind, GARP vollständig zu degradieren. In TGF–β sensitiven Proliferationsuntersuchungen stellte sich heraus, dass die entstandenen Fragmente immer noch in der Lage waren die Aktivierbarkeit von TGF–β zu erhöhen. Neben der Degradierung durch die oben genannten Proteasen konnte ebenfalls beobachtet werden, dass MMP9 und Ovastacin in der Lage sind GARP spezifisch zu schneiden. Ovastacin mRNA wurde in dieser Arbeit das erste Mal außerhalb der Oocyte, in T–Zellen beschrieben. Mit GARP wurde zudem das zweite Proteinsubstrat, neben dem Zona Pellucida Protein 2 identifiziert. Das durch MMP9 erzeugte N–terminale Fragment besitzt zwar die Eigenschaft, an TGF–β zu binden, kann aber die Aktivierbarkeit von TGF–β nicht mehr wie das intakte GARP erleichtern. rnDiese Arbeit zeigte, dass GARP durch Proteolyse reguliert wird, wobei die entstehenden Fragmente unterschiedlichen Einfluss auf die Aktivierbarkeit von TGF–β haben. Dieses Wissen bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen im translationalen Forschungsbereich, um die gewonnenen Erkenntnisse zur Immunmodulation in der Therapie verschiedener Krankheiten einsetzen zu können.rn

GARP (Glycoprotein A Repetitions Predominant) is a transmembrane protein, which binds the latent form of TGF-β (Transforming Growth Factor-β) on the surface of regulatory T-cells (TRegs). A functional loss of Tregs results in severe autoimmune diseases like Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X–linked Syndrome (IPEX), multiple sclerosis (MS) or rheumatoid arthritis (RA). GARP ensures the Tregs’ regulatory phenotype by the enhancement of TGF-β activability and inhibits the proliferation of autoreactive TH17 cells.rnThe main focus of this thesis was the regulation of GARP itself. Inside the phyla of jawed vertebrates GARP is strictly conserved. Genome analysis showed, that GARP evolves together with other crucial components of the adaptive immunity in early bony fish. To gain a closer look at the structure and putative disulfide-bonds of GARP, a 3D model was generated via homology modelling. To further analyze GARP in vitro, a soluble variant was made by an exchange of GARP’s transmembrane domain against the c-terminal part of meprin α. This variant was secreted reliably into the supernatant of different eukaryotic cells. From these supernatants recombinant GARP could by purified using a tandem chromatography. To test the cleavability of GARP, autoimmune associated proteases were incubated with the recombinant protein. The serine proteases trypsin, neutrophil elastase and plasmin, as well as the metalloprotease MMP2 were able to completely degrade GARP. In a TGF-β dependent proliferation assay it was possible to show that the generated GARP fragments are still able to enhance the activability of TGF-β. Beside the degradation process by the former named proteases, two additional proteases could be identified which are able to cleave GARP specifically at a designated region. These proteases are ovastacin and MMP9. ovastacin mRNA could be detected in T-cells, which was the first time outside the oocyte. Beside the zona pellucida protein 2, GARP is the second described protein substrate for ovastacin. The cleavage of GARP by MMP9 results in the generation of two fragments. The n-terminal is responsible for the binding of TGF-β but is not anymore able to enhance its activability. rnThis work shows a regulation of GARP through proteases and the generated fragments show a different impact on the activability of TGF-β. In addition, these experiments provide the basis for further research in the translational area, where the obtained knowledge could be used in the future to modulate the immune response in certain diseases.rn