Time-resolved surface enhanced resonance Raman spectro-electrochemistry of heme proteins

The membrane protein Cytochrome c Oxidase (CcO) is one of the most important functional bio-molecules. It appears in almost every eukaryotic cell and many bacteria. Although the different species differ in the number of subunits, the functional differences are merely marginal. CcO is the terminal link in the electron transfer pathway of the mitochondrial respiratory chain. Electrons transferred to the catalytic center of the enzyme conduce to the reduction of molecular oxygen to water. Oxygen reduction is coupled to the pumping of protons into the inter-membrane space and hence generates a difference in electrochemical potential of protons across the inner mitochondrial membrane. This potential difference drives the synthesis of adenosine triphosphate (ATP), which is the universal energy carrier within all biological cells. rnrnThe goal of the present work is to contribute to a better understanding of the functional mechanism of CcO by using time-resolved surface enhanced resonance Raman spectroscopy (TR-SERRS). Despite intensive research effort within the last decades, the functional mechanism of CcO is still subject to controversial discussions. It was the primary goal of this dissertation to initiate electron transfer to the redox centers CuA, heme a, heme a3 and CuB electrochemically and to observe the corresponding redox transitions in-situ with a focus on the two heme structures by using SERRS. A measuring cell was developed, which allowed combination of electrochemical excitation with Raman spectroscopy for the purpose of performing the accordant measurements. Cytochrome c was used as a benchmark system to test the new measuring cell and to prove the feasibility of appropriate Raman measurements. In contrast to CcO the heme protein cc contains only a single heme structure. Nevertheless, characteristic Raman bands of the hemes can be observed for both proteins.rnrnIn order to investigate CcO it was immobilized on top of a silver substrate and embedded into an artificial membrane. The catalytic activity of CcO and therefore the complete functional capability of the enzyme within the biomimetic membrane architecture was verified using cyclic voltammetry. Raman spectroscopy was performed using a special nano-structured silver surface, which was developed within the scope of the present work. This new substrate combined two fundamental properties. It facilitated the formation of a protein tethered bilayer lipid membrane (ptBLM) and it allowed obtaining Raman spectra with sufficient high signal-to-noise ratios.rnSpectro-electrochemical investigations showed that at open circuit potential the enzyme exists in a mixed-valence state, with heme a and and heme a3 in the reduced and oxidized state, respectively. This was considered as an intermediate state between the non-activated and the fully activated state of CcO. Time-resolved SERRS measurements revealed that a hampered electron transfer to the redox center heme a3 characterizes this intermediate state.rn

Direct electron transfer to cytochrome c oxidase investigated by electrochemistry and time-resolved surface-enhanced infrared absorption spectroscopy

Cytochrom c Oxidase (CcO), der Komplex IV der Atmungskette, ist eine der Häm-Kupfer enthaltenden Oxidasen und hat eine wichtige Funktion im Zellmetabolismus. Das Enzym enthält vier prosthetische Gruppen und befindet sich in der inneren Membran von Mitochondrien und in der Zellmembran einiger aerober Bakterien. Die CcO katalysiert den Elektronentransfer (ET) von Cytochrom c zu O2, wobei die eigentliche Reaktion am binuklearen Zentrum (CuB-Häm a3) erfolgt. Bei der Reduktion von O2 zu zwei H2O werden vier Protonen verbraucht. Zudem werden vier Protonen über die Membran transportiert, wodurch eine elektrochemische Potentialdifferenz dieser Ionen zwischen Matrix und Intermembranphase entsteht. Trotz ihrer Wichtigkeit sind Membranproteine wie die CcO noch wenig untersucht, weshalb auch der Mechanismus der Atmungskette noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Das Ziel dieser Arbeit ist, einen Beitrag zum Verständnis der Funktion der CcO zu leisten. Hierzu wurde die CcO aus Rhodobacter sphaeroides über einen His-Anker, der am C-Terminus der Untereinheit II angebracht wurde, an eine funktionalisierte Metallelektrode in definierter Orientierung gebunden. Der erste Elektronenakzeptor, das CuA, liegt dabei am nächsten zur Metalloberfläche. Dann wurde eine Doppelschicht aus Lipiden insitu zwischen die gebundenen Proteine eingefügt, was zur sog. proteingebundenen Lipid-Doppelschicht Membran (ptBLM) führt. Dabei musste die optimale Oberflächenkonzentration der gebundenen Proteine herausgefunden werden. Elektrochemische Impedanzspektroskopie(EIS), Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und zyklische Voltammetrie (CV) wurden angewandt um die Aktivität der CcO als Funktion der Packungsdichte zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit betrifft die Untersuchung des direkten ET zur CcO unter anaeroben Bedingungen. Die Kombination aus zeitaufgelöster oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptionsspektroskopie (tr-SEIRAS) und Elektrochemie hat sich dafür als besonders geeignet erwiesen. In einer ersten Studie wurde der ET mit Hilfe von fast scan CV untersucht, wobei CVs von nicht-aktivierter sowie aktivierter CcO mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten gemessen wurden. Die aktivierte Form wurde nach dem katalytischen Umsatz des Proteins in Anwesenheit von O2 erhalten. Ein vier-ET-modell wurde entwickelt um die CVs zu analysieren. Die Methode erlaubt zwischen dem Mechanismus des sequentiellen und des unabhängigen ET zu den vier Zentren CuA, Häm a, Häm a3 und CuB zu unterscheiden. Zudem lassen sich die Standardredoxpotentiale und die kinetischen Koeffizienten des ET bestimmen. In einer zweiten Studie wurde tr-SEIRAS im step scan Modus angewandt. Dafür wurden Rechteckpulse an die CcO angelegt und SEIRAS im ART-Modus verwendet um Spektren bei definierten Zeitscheiben aufzunehmen. Aus diesen Spektren wurden einzelne Banden isoliert, die Veränderungen von Vibrationsmoden der Aminosäuren und Peptidgruppen in Abhängigkeit des Redoxzustands der Zentren zeigen. Aufgrund von Zuordnungen aus der Literatur, die durch potentiometrische Titration der CcO ermittelt wurden, konnten die Banden versuchsweise den Redoxzentren zugeordnet werden. Die Bandenflächen gegen die Zeit aufgetragen geben dann die Redox-Kinetik der Zentren wieder und wurden wiederum mit dem vier-ET-Modell ausgewertet. Die Ergebnisse beider Studien erlauben die Schlussfolgerung, dass der ET zur CcO in einer ptBLM mit größter Wahrscheinlichkeit dem sequentiellen Mechanismus folgt, was dem natürlichen ET von Cytochrom c zur CcO entspricht.

Untersuchungen über das Schalten photochromer Indolinospirobenzopyrane

Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurden grundlegende Aspekte der Photomodulation der Aktivität von Biomolekülen behandelt. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Weg ausgearbeitet, photochrome Indolinospirobenzopyrane kovalent an Immunoglobulin G zu koppeln. Dazu wurde ein vollständig wässriges Verfahren entwickelt, was die Synthese eines noch nicht in der Literatur beschriebenen wasserlöslichen und gleichzeitig zur Kopplung befähigten Indolinospirobenzopyrans voraussetzte. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der spektroskopischen Charakterisierung einer Reihe von photochromen Indolinospirobenzopyranen. Zur Untersuchung der Kinetik des Schaltprozesses wurde die zeitaufgelöste, transiente Absorptionsspektroskopie eingesetzt. Die erhaltenen Daten wurden vor dem Hintergrund von in der Literatur postulierten Schaltmechanismen kontrovers diskutiert. Darüber hinaus wurden mit Hilfe der elektrooptischen Absorptionsmessung die Dipolmomente im Grundzustand und im ersten angeregten Zustand für eine Reihe von Indolinospirobenzopyranen bestimmt. Zur Durchführung der Messungen wurde die bestehende Apparatur zu Messung von photochromen Verbindungen im photostationären Gleichgewicht erweitert. Erwartungsgemäß wurden für die Merocyaninformen sehr große Dipolmomente um 18 Debye gefunden. Das Dipolmoment im ersten angeregten Zustand betrug dagegen nur etwa 12 Debye. Im Fall der Spiroformen war das Dipolmoment im Grundzustand klein (3-5 Debye), während es im ersten angeregten Zustand auf etwa 20 D anstieg.

Confocal microscopy applied to the study of single entity fluorescence and light scattering

A sample scanning confocal optical microscope (SCOM) was designed and constructed in order to perform local measurements of fluorescence, light scattering and Raman scattering. This instrument allows to measure time resolved fluorescence, Raman scattering and light scattering from the same diffraction limited spot. Fluorescence from single molecules and light scattering from metallic nanoparticles can be studied. First, the electric field distribution in the focus of the SCOM was modelled. This enables the design of illumination modes for different purposes, such as the determination of the three-dimensional orientation of single chromophores. Second, a method for the calculation of the de-excitation rates of a chromophore was presented. This permits to compare different detection schemes and experimental geometries in order to optimize the collection of fluorescence photons. Both methods were combined to calculate the SCOM fluorescence signal of a chromophore in a general layered system. The fluorescence excitation and emission of single molecules through a thin gold film was investigated experimentally and modelled. It was demonstrated that, due to the mediation of surface plasmons, single molecule fluorescence near a thin gold film can be excited and detected with an epi-illumination scheme through the film. Single molecule fluorescence as close as 15nm to the gold film was studied in this manner. The fluorescence dynamics (fluorescence blinking and excited state lifetime) of single molecules was studied in the presence and in the absence of a nearby gold film in order to investigate the influence of the metal on the electronic transition rates. The trace-histogram and the autocorrelation methods for the analysis of single molecule fluorescence blinking were presented and compared via the analysis of Monte-Carlo simulated data. The nearby gold influences the total decay rate in agreement to theory. The gold presence produced no influence on the ISC rate from the excited state to the triplet but increased by a factor of 2 the transition rate from the triplet to the singlet ground state. The photoluminescence blinking of Zn0.42Cd0.58Se QDs on glass and ITO substrates was investigated experimentally as a function of the excitation power (P) and modelled via Monte-Carlo simulations. At low P, it was observed that the probability of a certain on- or off-time follows a negative power-law with exponent near to 1.6. As P increased, the on-time fraction reduced on both substrates whereas the off-times did not change. A weak residual memory effect between consecutive on-times and consecutive off-times was observed but not between an on-time and the adjacent off-time. All of this suggests the presence of two independent mechanisms governing the lifetimes of the on- and off-states. The simulated data showed Poisson-distributed off- and on-intensities, demonstrating that the observed non-Poissonian on-intensity distribution of the QDs is not a product of the underlying power-law probability and that the blinking of QDs occurs between a non-emitting off-state and a distribution of emitting on-states with different intensities. All the experimentally observed photo-induced effects could be accounted for by introducing a characteristic lifetime tPI of the on-state in the simulations. The QDs on glass presented a tPI proportional to P-1 suggesting the presence of a one-photon process. Light scattering images and spectra of colloidal and C-shaped gold nano-particles were acquired. The minimum size of a metallic scatterer detectable with the SCOM lies around 20 nm.

Liquid crystalline oligofluorenes and their derivatives

Homo-oligofluorenes (OFn), polyfluorenes (PF2/6) and oligofluorenes with one fluorenenone group in the center (OFnK) were synthesized. They were used as model compounds to understand of the structure-property relationships of polyfluorenes and the origin of the green emission in the photoluminescence (after photooxidation of the PFs) and the electroluminescence (EL) spectra. The electronic, electrochemical properties, thermal behavior, supramolecular self-assembly, and photophysical properties of OFn, PF2/6 and OFnK were investigated. Oligofluorenes with 2-ethylhexyl side chain (OF2-OF7) from the dimer up to the heptamer were prepared by a series of stepwise transition metal mediated Suzuki and Yamamoto coupling reactions. Polyfluorene was synthesized by Yamamoto coupling of 2,7-dibromo-9,9-bis(2-ethylhexyl)fluorene. Oligofluorenes with one fluorenone group in the center (OF3K, OF5K, OF7K) were prepared by Suzuki coupling between the monoboronic fluorenyl monomer, dimer, trimer and 2, 7-dibromofluorenone. The electrochemical and electronic properties of homo-oligofluorenes (OFn) were systematically studied by several combined techniques such as cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, UV-vis absorption spectroscopy, steady and time-resolved fluorescence spectroscopy. It was found that the oligofluorenes behave like classical conjugated oligomers, i.e., with the increase of the chain-length, the corresponding oxidation potential, the absorption and emission maximum, ionization potential, electron affinity, band gap and the photoluminescence lifetime displayed a very good linear relation with the reciprocal number of the fluorene units (1/n). The extrapolation of these linear relations to infinite chain length predicted the electrochemical and electronic properties of the corresponding polyfluorenes. The thermal behavior, single-crystal structure and supramolecular packing, alignment properties, and molecular dynamics of the homo-oligofluorenes (OFn) up to the polymer were studied using techniques such as TGA, DSC, WAXS, POM and DS. The OFn from tetramer to heptamer show a smectic liquid crystalline phase with clearly defined isotropization temperature. The oligomers do show a glass transition which exhibits n-1 dependence and allows extrapolation to a hypothetical glass transition of the polymer at around 64 °C. A smectic packing and helix-like conformation for the oligofluorenes from tetramer to heptamer was supported by WAXS experiments, simulation, and single-crystal structure of some oligofluorene derivatives. Oligofluorenes were aligned more easily than the corresponding polymer, and the alignability increased with the molecular length from tetramer to heptamer. The molecular dynamics in a series of oligofluorenes up to the polymer was studied using dielectric spectroscopy. The photophysical properties of OFn and PF2/6 were investigated by the steady-state spectra (UV-vis absorption and fluorescence spectra) and time-resolved fluorescence spectra both in solution and thin film. The time-resolved fluorescence spectra of the oligofluorenes were measured by streak camera and gate detection technique. The lifetime of the oligofluorenes decreased with the extension of the chain-length. No green emission was observed in CW, prompt and delayed fluorescence for oligofluorenes in m-THF and film at RT and 77K. Phosphorescence was observed for oligofluorenes in frozen dilute m-THF solution at 77K and its lifetime increased with length of oligofluorenes. A linear relation was obtained for triplet energy and singlet energy as a function of the reciprocal degree of polymerization, and the singlet-triplet energy gap (S1-T1) was found to decrease with the increase of degree of polymerization. Oligofluorenes with one fluorenone unit at the center were used as model compounds to understand the origin of the low-energy (“green”) emission band in the photoluminescence and electroluminescence spectra of polyfluorenes. Their electrochemical properties were investigated by CV, and the ionization potential (Ip) and electron affinity (Ea) were calculated from the onset of oxidation and reduction of OFnK. The photophysical properties of OFnK were studied in dilute solution and thin film by steady-state spectra and time-resolved fluorescence spectra. A strong green emission accompanied with a weak blue emission were obtained in solution and only green emission was observed on film. The strong green emission of OFnK suggested that rapid energy transfer takes place from higher energy sites (fluorene segments) to lower energy sites (fluorenone unit) prior to the radiative decay of the excited species. The fluorescence spectra of OFnK also showed solvatochromism. Monoexponential decay behaviour was observed by time-resolved fluorescence measurements. In addition, the site-selective excitation and concentration dependence of the fluorescence spectra were investigated. The ratio of green and blue emission band intensities increases with the increase of the concentration. The observed strong concentration dependence of the green emission band in solution suggests that increased interchain interactions among the fluorenone-containing oligofluorene chain enhanced the emission from the fluorenone defects at higher concentration. On the other hand, the mono-exponential decay behaviour and power dependence were not influenced significantly by the concentration. We have ruled out the possibility that the green emission band originates from aggregates or excimer formation. Energy transfer was further investigated using a model system of a polyfluorene doped by OFnK. Förster-type energy transfer took place from PF2/6 to OFnK, and the energy transfer efficiency increased with increasing of the concentration of OFnK. Efficient funneling of excitation energy from the high-energy fluorene segments to the low-energy fluorenone defects results from energy migration by hopping of excitations along a single polymer chain until they are trapped on the fluorenone defects on that chain or transferred onto neighbouring chains by Förster-type interchain energy transfer process. These results imply that the red-shifted emission in polyfluorenes can originate from (usually undesirable) keto groups at the bridging carbon atoms-especially if the samples have been subject to photo- or electro-oxidation or if fluorenone units are present due to an improper purification of the monomers prior to polymerization.

Das wasserlösliche Chlorophyll-Protein (WSCP): biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur biologischen Funktion

Das WSCP (water-soluble chlorophyll protein) der Brassicaceen ist das einzig bekannte Chlorophyll-bindende Protein, welches keine Carotinoide bindet. Es ist ein wasserlösliches, ca. 80 kDa großes Homotetramer mit 1-4 gebundenen Chlorophyllen. Das Protein ist äußerst stabil und vermag die gebundenen Chlorophylle vor Photooxidation zu schützen. Seine Funktion in der Pflanze ist bis heute ein Rätsel und sollte in dieser Arbeit zusammen mit seinen biochemischen Eigenschaften weiter aufgeklärt werden. Es wurden Versuche durchgeführt mit nativem und rekombinantem WSCP aus Blumenkohl (BoWSCP bzw. BoWSCPhis) und aus Arabidopsis thaliana (AtWSCP bzw. AtWSCPhis). Die Expressionsausbeute von BoWSCPhis konnte verbessert werden und zusätzlich wurde die Rekonstitutionsmethode für das rekombinante WSCP optimiert, sodass das pigmentierte Protein mit hoher Ausbeute und großer Reinheit gewonnen werden konnte. Zudem wurde ein neuer WSCP-Klon hergestellt, mBoWSCPhis, der in seiner Sequenz dem maturen nativen BoWSCP entspricht und weitaus weniger Aggregationsprobleme zeigte als BoWSCPhis. Weiterführende Versuche zur Stabilität und dem Oligomerisierungsgrad von WSCP haben die neue Erkenntnis erbracht, dass die Phytolschwänze der von WSCP gebundenen Chlorophylle zwar essentiell sind für die Stabilität von WSCP-Oligomeren, nicht aber für die Oligomerisierung selbst, wie es in der Literatur bislang postuliert wurde. Zusätzlich zu ihrer außerordentlichen Hitzestabilität erwiesen sich die Chl-WSCP-Komplexe als stabil in einem breiten pH-Spektrum. AtWSCPhis besaß eine vergleichbare Stabilität, und auch das Oligomerisierungsverhalten zeigte Ähnlichkeiten zu BoWSCPhis. Im Rahmen einer Forschungskooperation mit dem Institut für Optik und Atomare Physik der TU Berlin wurden zeitaufgelöste Absorptionsspektren sowie Tieftemperatur-Fluoreszenzspektren an Chl-WSCP-Komplexen gemessen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die WSCP-gebundenen Chlorophylle excitonisch gekoppelt sind und wiesen zudem auf unterschiedliche Chl-Bindungsmodi hin. Aufgrund seines einfachen Aufbaus und seines geringen Chlorophyllgehalts hat sich WSCP bei diesen Versuchen als sehr geeignetes Modellsystem erwiesen, um Messungen zur Chlorophyllbindung mit Vorhersagen aus theoretischen Modellen zu vergleichen. Bei den Experimenten zur biologischen Funktion wurden einerseits Arabidopsis thaliana WSCP-„knock-out“-Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert, andererseits wurden Experimente mit rekombinantem WSCP durchgeführt, um eine mögliche Interaktion mit anderen Proteinen zu detektieren. Die vegetativen Stadien der Mutante zeigten keinen Phänotyp; das native Arabidopsis-WSCP konnte später bei der Wildtyp-Pflanze ausschließlich in jungen Schoten lokalisiert werden, was eine Erklärung hierfür lieferte. Rekombinantes WSCP konnte Chlorophylle aus nativem LHCII entfernen, eine Interaktion mit Chlorophyllase konnte jedoch nicht nachgewiesen werden; daher konnte auch die Hypothese, WSCP sei ein Chl-Carrier beim Chl-Abbau, nicht untermauert werden. Bei den durchgeführten Enzym-Assays wurde eine geringfügige Inhibition der Cysteinprotease Papain beobachtet, aber keine Inhibition der Serinprotease Trypsin, obwohl Blumenkohl-WSCP N-proximal das Motiv der Künitz-Proteaseinhibitoren besitzt. Die Frage nach der biologischen Funktion von WSCP bleibt also weiterhin offen.

Hundertneunundzwanzig Xe NMR for investigations of complex and dynamic systems

In this work, the remarkable versatility and usefulness of applications of Xe-129 NMR experiments is further extended. The application of Xe-129 NMR spectroscopy to very different system is studied, including dynamic and static, solid and liquid, porous and non-porous systems. Using the large non-equilibrium polarization created by hyperpolarization of Xe-129, time-resolved NMR measurements can be used for the online-monitoring of dynamic systems. In the first part of this work, several improvements for medical applications of hyperpolarized Xe-129 are achieved and their feasibility shown experimentally. A large gain in speed and reproducibility of the accumulation process of Xe-129 as ice and an enhancement of the usable polarization in any experiment requiring prior accumulation are achieved. An enhancement of the longitudinal relaxation time of Xe-129 is realized by admixture of a buffer gas during the storage of hyperpolarized Xe-129. Pursuing the efforts of simplifying the accumulation process and enhancing the storage time of hyperpolarized Xe-129 will allow for a wider use of the hyperpolarized gas in (medical) MRI experiments. Concerning the use of hyperpolarized Xe-129 in MRI, the influence of the diffusion coefficient of the gas on parameters of the image contrast is experimentally demonstrated here by admixture of a buffer gas and thus changing the diffusion coefficient. In the second part of this work, a polymer system with unique features is probed by Xe-129 NMR spectroscopy, proving the method to be a valuable tool for the characterization of the anisotropic properties of semicrystalline, syndiotactic polystyrene films. The polymer films contain hollow cavities or channels with sizes in the sub-nanometer range, allowing for adsorption of Xe-129 and subsequent NMR measurements. Despite the use of a ’real-world’ system, the transfer of the anisotropic properties from the material to adsorbed Xe-129 atoms is shown, which was previously only known for fully crystalline materials. The anisotropic behavior towards atomar guests inside the polymer films is proven here for the first time for one of the phases. For the polymer phase containing nanochannels, the dominance of interactions between Xe-129 atoms in the channels compared to interactions between Xe atoms and the channel walls are proven by measurements of a powder sample of the polymer material and experiments including the rotation of the films in the external magnetic field as well as temperature-dependent measurements. The characterization of ’real-world’ systems showing very high degrees of anisotropy by Xe-129 are deemed to be very valuable in future applications. In the last part of this work, a new method for the online monitoring of chemical reactions has been proposed and its feasibility and validity are experimentally proven. The chemical shift dependence of dissolved Xe-129 on the composition of a reaction mixture is used for the online monitoring of free-radical miniemulsion polymerization reactions. Xe-129 NMR spectroscopy provides an excellent method for the online monitoring of polymerization reactions, due to the simplicity of the Xe-129 NMR spectra and the simple relationship between the Xe-129 chemical shift and the reaction conversion. The results of the time-resolved Xe-129 NMR measurements are compared to those from calorimetric measurements, showing a good qualitative agreement. The applicability of the new method to reactions other than polymerization reactions is investigated by the online monitoring of an enzymatic reaction in a miniemulsion. The successful combination of the large sensitivity of Xe-129, the NMR signal enhancements due to hyperpolarization, and the solubility of Xe-129 gives access to the large new field of investigations of chemical reaction kinetics in dynamic and complex systems like miniemulsions.

Kinetische Studien zur OH-Bildung über die Reaktionen von HO 2 mit organischen Peroxyradikalen

Es wurde untersucht, wie sich das Substitutionsmuster organischer Peroxyradikale (RO2) auf die Ratenkonstante k1 und die Verzweigungsverhältnisse α, β und γ der Reaktionen von RO2 mit HO2 auswirkt. Die Effekte der Deuterierung von HO2 wurden ebenfalls studiert. Für zwei RO2 wurde zusätzlich das UV-Absorptionsspektrum bestimmt.rnrn αrnRO2 + HO2 → RO + OH + O2 R1arnrn βrn → RO2H + O2 R1brnrn γrn → ROH + O3 R1crnrnIn dieser Arbeit wurde ein neues Experiment aufgebaut. Für die direkte und zeitaufgelöste Messung der OH-Konzentration wurde das Verfahren der Laser-induzierten Fluoreszenz angewendet. Die Radikalerzeugung erfolgte mittels gepulster Laserphotolyse, wodurch unerwünschte Nebenreaktionen weitgehend unterdrückt werden konnten. Mittels transienter Absorptionsspektroskopie konnten die Menge der photolytisch erzeugten Radikale bestimmt und die Ozonbildung über R1c quantifiziert werden. Für die Auswertung wurden kinetische Modelle numerisch an die Messdaten angepasst. Um die experimentellen Unsicherheiten abzuschätzen, wurde ein Monte-Carlo-Ansatz gewählt.rnrnk1 und α reagieren sehr empfindlich auf Veränderungen des RO2-Substitutionsmusters. Während sich eine OH-Bildung für das unsubstituierte C2H5O2 (EtP) mit α EtP ≤ 5 % nicht nachweisen lässt, stellt R1a bei den α-Oxo-substituierten H3CC(O)O2 (AcP) und HOCH2C(O)O2 (HAP) mit α AcP = (63 ± 11) % bzw. α HAP = (69 ± 12) % den Hauptkanal dar. Wie die mit α HEP = (10 ± 4) % geringfügige OH-Bildung bei HOC2H4O2 (HEP) zeigt, nimmt die OH-Gruppe in β-Stellung weniger Einfluss auf den Wert von α als die Oxogruppe in α-Stellung. Bei der Erzeugung α-Oxo-substituierter RO2 kann ebenfalls OH entstehen (R+O2→RO2/OH). Die Druckabhängigkeit dieser OH-Quelle wurde mit einem innovativen Ansatz bestimmt. Mit γ AcP = (15+5-6) % bzw. γ HAP = (10+2-3) % lässt sich für die Reaktionen der α-Oxo-substituierten RO2 eine erhebliche Ozonbildung nachweisen. Durch die Einführung der α-Oxogruppe steigt k1 jeweils um 1,3 • 10-11 cm3s-1 an, der Effekt der β-Hydroxygruppe ist halb so groß (k1 AcP = (2,0 ± 0,4) • 10-11 cm3s-1, k1 HAP = (2,6 ± 0,4) • 10-11 cm3s-1). Das Verzweigungsverhältnis α steigt weiter, wenn das HO2 deuteriert wird (α AcP,iso = (80 ± 14) %, k1 AcP,iso = (2,1 ± 0,4) • 10-11 cm3s-1). Vergleiche mit älteren Studien zeigen, dass die OH-Bildung über R1a bislang deutlich unterschätzt worden ist. Die möglichen Ursachen für die Unterschiede zwischen den Studien werden ebenso diskutiert wie die Hintergründe der beobachteten Substituenteneffekte.

Nanofiber-based spectroscopy of organic molecules

This thesis reports on the experimental realization of nanofiber-based spectroscopy of organic molecules. The light guided by subwavelength diameter optical nanfibers exhibits a pronounced evanescent field surrounding the fiber which yields high excitation and emission collection efficiencies for molecules on or near the fiber surface.rnThe optical nanofibers used for the experiments presented in this thesis are realized as thernsub-wavelength diameter waist of a tapered optical fiber (TOF). The efficient transfer of thernlight from the nanofiber waist to the unprocessed part of the TOF depends critically on therngeometric shape of the TOF transitions which represent a nonuniformity of the TOF. Thisrnnonuniformity can cause losses due to coupling of the fundamental guided mode to otherrnmodes which are not guided by the taper over its whole length. In order to quantify the lossrnfrom the fundamental mode due to tapering, I have solved the coupled local mode equationsrnin the approximation of weak guidance for the three layer system consisting of fiber core andrncladding as well as the surrounding vacuum or air, assuming the taper shape of the TOFsrnused for the experiments presented in this thesis. Moreover, I have empirically studied therninfluence of the TOF geometry on its transmission spectra and, based on the results, I haverndesigned a nanofiber-waist TOF with broadband transmission for experiments with organicrnmolecules.rnAs an experimental demonstration of the high sensitivity of nanofiber-based surface spectroscopy, I have performed various absorption and fluorescence spectroscopy measurements on the model system 3,4,9,10-perylene-tetracarboxylic dianhydride (PTCDA). The measured homogeneous and inhomogeneous broadening of the spectra due to the interaction of the dielectric surface of the nanofiber with the surface-adsorbed molecules agrees well with the values theoretically expected and typical for molecules on surfaces. Furthermore, the self-absorption effects due to reasorption of the emitted fluorescence light by circumjacent surface-adsorbed molecules distributed along the fiber waist have been analyzed and quantified. With time-resolved measurements, the reorganization of PTCDA molecules to crystalline films and excimers can be observed and shown to be strongly catalyzed by the presence of water on the nanofiber surface. Moreover, the formation of charge-transfer complexes due to the interaction with localized surface defects has been studied. The collection efficiency of the molecular emission by the guided fiber mode has been determined by interlaced measurements of absorption and fluorescence spectra to be about 10% in one direction of the fiber.rnThe high emission collection efficiency makes optical nanofibers a well-suited tool for experiments with dye molecules embedded in small organic crystals. As a first experimental realization of this approach, terrylene-doped para-terphenyl crystals attached to the nanofiber-waist of a TOF have been studied at cryogenic temperatures via fluorescence and fluorescence excitation spectroscopy. The statistical fine structure of the fluorescence excitation spectrum for a specific sample has been observed and used to give an estimate of down to 9 molecules with center frequencies within one homogeneous width of the laser wavelength on average for large detunings from resonance. The homogeneous linewidth of the transition could be estimated to be about 190MHz at 4.5K.

Präparation eines reinen metastabilen 7 Li +-Ionenstrahls für die Präzisionsspektroskopie im Speicherring

An dem Schwerionenspeicherring TSR (MPI für Kernphysik, Heidelberg) wurde ein 7 Li +-Ionenstrahl geringer Dichte durch RF-Bunchen und Laserkühlung präpariert.Die Phasenraumverteilung in dem Strahl wurde durch Laser- spektroskopie an Ionen im metastabilen Zustand untersucht. Ein umlaufsynchrones, zeitaufgelöstes Meßverfahren für das Fluoreszenzlicht ermöglichte die Bestimmung der räumlichen Struktur mit dieser rein optischen Methode.Durch einen speziellen Präparationsschritt wurden die Ionen im Grundzustand aus dem Speicherring entfernt. Der sonst dominierende Heizeffekt der strahlinternen Streuung war dadurch vernachlässigbar und es konnte eine Temperatur von 160 mK erreicht werden.Der präparierte Ionenstrahl bietet besondere Eigenschaften im Hinblick auf Präzisionsexperimente, bei denen mit möglichst ungestörten Ionen gearbeitet werden soll. Es wird gezeigt, daß die Phasenraumverteilung der Ionen nicht mehr durch Ion-Ion-Wechselwirkungen bestimmt ist und daß der verbleibende Heizmechanismus durch die Streuung am Restgas erklärt werden kann.1993 wurde durch Laserspektroskopie an 7 Li + im TSR die spezielle Relativitätstheorie im Hinblick auf die relativistische Zeitdilatation experimentell getestet. In diesem Zusammenhang wird das zu erwartende Ergebnis eines Experimentes diskutiert, das, basierend auf den in dieser Arbeit vorgestellten Verfahren, einen erneuten Test der relativistischen Zeitdilatation mit verbesserter Genauigkeit durchführen könnte.

Rylenfarbstoffe in nanoskopischen Systemen

ZusammenfassungDurch die Funktionalisierung des Chromophors Tetraphenoxyperylendiimid mit vier Ethinylgruppen stand ein Farbstoff zur Verfügung, welcher sich als Kernmolekül für den Aufbau von Polyphenylendendrimeren eignet. Ausgehend von dem Farbstoffkern wurden drei Dendrimergenerationen synthetisiert. Durch die Dendronisierung wird die Aggregation des zentralen Farbstoffs im Festkörper verhindert, weshalb das G1-Dendrimer als aktive Schicht in LED´s eingesetzt wurde und zur Verbesserung dieser Bauelemente führte. Weiterhin wurde auch die Oberfläche der Polyphenylendendrimere mit 4, 8 bzw. 16 Perylenmonoimidfarbstoffen funktionalisiert. Durch zeitaufgelöste Absorptions- und Emissionsmessungen und Einzelmolekülspektroskopie des G2-Dendrimers wurde ein photophysikalisches Modell des multichromophoren Systems entwickelt.Neben Polyphenylendendrimeren dienten auch Emulsionspolymerisate, Miniemulsionspolymerisate und Halbleiterkristalle als nanoskopische Trägermaterialien für Rylenfarbstoffe. Für die Anknüpfung an Lartices wurden amino- und styrylfunktionalisierte Perylen- und Terrylenchromophore dargestellt, was zu einer statistischen Verteilung der Farbstoffe auf der Oberfläche bzw. im Inneren führte. Außerdem wurden Rylenfarbstoffe als stabile Fluoreszenzmarkierung von Metallocenkatalysatoren eingesetzt. Silica- und polymergeträgerte markierte Katalysatoren wurden zur Polymerisation von Ethylen verwendet und lieferten fluoreszente PE-Produkte, ohne Einfluß auf die Polymerisation zu nehmen. Zum Einen wurde mit Hilfe der Dotierung der heterogenen Polymerisationskatalysatoren der Verbleib des fragmentierten Trägermaterials in den PE-Produktpartikeln detektiert. Zum Anderen erlaubt der Einsatz unterschiedlich fluoreszierender Markierungsgruppen die Durchführung eines kombinatorischen Verfahrens zum Testen von Polymerisationskatalysatoren.

Grundlegende Untersuchungen zur Abbindereaktion von Zinkphosphatzement

Zusammenfassung Das Ziel der Arbeit bestand darin, mit der Aufklärung der Abbindereaktion von Zinkphosphatzement eine Grundlage für eine gezielte Modifikation bzw. Optimierung zu schaffen, insbesondere im Hinblick auf einen Einsatz als permanenter Füllungswerkstoff. Über den Abbindechemismus war bislang lediglich bekannt, daß es sich bei den primär gebildeten Reaktionsprodukten um röntgenamorphe Phasen handelt, die sich nach Wochen bzw. Monaten in das thermodynamisch stabile Reaktionsprodukt alpha-Hopeit (alpha-Zn3(PO4)2·4H2O) umwandeln.Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang durch den Einsatz der Infrarot-Reflexionsspek-troskopie (DRIFT) die Identifikation von Dizink Cyclotetraphosphat-Octahydrat (Zn2P4O12·8H2O) als röntgenamorpher Vorläuferphase. Das kondensierte Phosphat ist hydrolyseempfindlich sowie thermodynamisch instabil. Mit Hilfe der zeitaufgelösten 1H NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß bereits nach ca. 10 Minuten eine Phasenumwandlung (topochemische Disproportionierung) in ein zunächst röntgenamorphes Orthophosphat stattfindet. Mittels 31P Doppelquanten-NMR-Spektroskopie gelang der Nachweis, daß innerhalb des röntgenamorphen Bereiches lokal nahgeordnete (nanokristalline) Bereiche auftreten, deren Ordnung sich auf einer Längenskala von 10 bis 30 Å erstreckt. Die Nanokristallite unterliegen einem Wachstumsprozeß, der schließlich zu alpha-Hopeit-Kristallen mit Ausdehnungen im Mikrometerbereich führt. Die Ursache für die primäre Ausbildung röntgenamorpher Reaktionsprodukte kann zunächst gelösten Aluminophosphatkomplexen zugeordnet werden, die im Verlauf der Abbindereaktion zu anorganischen Polymeren aggregieren und damit als Kristallisationsinhibitoren fungieren.

Untersuchung der Strukturdynamik arbeitender F1-ATPase und ATP-Synthase aus Micrococcus luteus in Einzelschußexperimenten mit Synchrotronstrahlung

ZusammenfassungDie ATP-Synthase koppelt im Energiestoffwechsel der Zellen den Protonentransport über die biologische Membran mit der Synthese des energiespeichernden Moleküls ATP aus ADP und Phosphat. ATP-Synthasen bestehen aus 2 Subkomplexen, wobei der katalytische F1-Teil von der membranständigen Domäne abgelöst werden kann und nur zur ATP-Hydrolyse fähig ist. Der hochkooperative Reaktionsmechanismus der dreizentrigen ATP-Synthasen ist weitgehend unklar.Im Rahmen dieser Arbeit wurde der ATP-Synthasekomplex und ihr wasserlösliches katalytisches F1-Fragment aus Micrococcus luteus in präparativem Maßstab mittels chromatographischer Trennmethoden isoliert. Die Überprüfung der Funktionalität beider Enzyme erfolgte mit enzymatischen Methoden. Durch zeitaufgelöste Röntgenkleinwinkelstreuung wurde die Strukturdynamik der arbeitenden ATP-Synthase und ihres F1-Fragmentes aus Micrococcus luteus im Laufe des ATP-Hydrolysezyklus untersucht. Diese Methode diente zum Nachweis weiträumiger Konformationsänderungen innerhalb der arbeitenden Enzyme unter nativen physiologischen Bedingungen. Die zeitaufgelösten Streuexperimente fanden an der ESRF (Europäische Synchrotronstrahlungsquelle) in Grenoble (F) statt. Dort wurden für beide Enzyme im Laufe des ATP-Hydrolysezykus molekulare Bewegungen nachgewiesen. Als Referenz zu den zeitaufgelösten Messungen dienten statische Messungen zur Strukturuntersuchung der Proteine am schwächeren DESY. Anhand dieser Strukturdaten wurden Molekülmodelle der F1-ATPase und ATP-Synthase aus Micrococcus luteus konstruiert. Das Molekülmodell der F1-ATPase war die Grundlage zur Modellierung einzelner Teilschritte des ATP-Hydrolysezyklus bei 20°C. Die experimentellen Daten wurden mit einer Kippbewegung der membranseitigen Domäne der katalytischen b-Untereinheiten der F1-ATPase während des ATP-Hydrolysezyklus interpretiert.

Optische Spektroskopie an Fermium (Z=100)

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals Laser-Atomspektroskopie an einem Element durchgeführt, für das bisher keine atomaren Niveaus bekannt waren. Die Experimente wurden am Element Fermium mit der Ordnungszahl Z=100 mit der Resonanzionisationsspektroskopie (RIS) in einer Puffergaszelle durchgeführt. Verwendet wurde das Isotop 255Fm mit einer Halbwertszeit von 20.1 h, das im Hochflusskernreaktor des ORNL, Oak Ridge, USA, hergestellt wurde. Die von einem elektrochemischen Filament in das Argon-Puffergas bei einer Temperatur von 960(20)°C abgedampften Fm-Atome wurden mit Lasern in einem Zweistufenprozess resonant ionisiert. Dazu wurde das Licht eines Excimerlaser gepumpten Farbstofflasers für den ersten Anregungsschritt um die Wellenlänge 400 nm durchgestimmt. Ein Teil des Excimer (XeF) Laser Pumplichtes mit den Wellenlänge 351/353 nm wurde für die nicht-resonante Ionisation verwendet. Die Ionen wurden mit Hilfe elektrischer Felder aus der optischen Zelle extrahiert und nach einem Quadrupol Massenfilter mit einem Channeltron-Detektor massenselektiv nachgewiesen. Trotz der geringen Probenmenge von 2.7 x 10^10 eingesetzten Atomen wurden zwei atomare Resonanzen bei Energien von 25099.8(2) cm-1 und 25111.8(2) cm-1 gefunden und das Sättigungsverhalten dieser Linien gemessen. Es wurde ein theoretisches Modell entwickelt, dass sowohl das spektrale Profil der sättigungsverbreiterten Linien als auch die Sättigungskurven beschreibt. Durch Anpassung an die Messdaten konnten die partiellen Übergangsraten in den 3H6 Grundzustand Aki=3.6(7) x 10^6/s und Aki=3.6(6) x 10^6/s bestimmt werden. Der Vergleich der Niveauenergien und Übergangsraten mit Multikonfigurations Dirac-Fock Rechnungen legt die spektroskopische Klassifizierung der beobachteten Niveaus als 5f12 7s7p 5I6 und 5G6 Terme nahe. Weiterhin wurde ein Übergang bei 25740 cm-1 gefunden, der aufgrund der beobachteten Linienbreite von 1000 GHz als Rydbergzustand Zustand mit der Niveauenergie 51480 cm-1 interpretiert wurde und über einen Zweiphotonen Prozess angeregt werden kann. Basierend auf dieser Annahme wurde die Obergrenze für die Ionisationsenergie IP = 52140 cm-1 = 6.5 eV abgeschätzt. In den Messungen wurden Verschiebungen in den Zeitverteilungsspektren zwischen den mono-atomaren Ionen Fm+ und Cf+ und dem Molekül-Ion UO+ festgestellt und auf Driftzeitunterschiede im elektrischen Feld der gasgefüllten optischen Zelle zurückgeführt. Unter einfachen Modellannahmen wurde daraus auf die relativen Unterschiede Delta_r(Fm+,Cf+)/r(Cf+) ˜ -0.2 % und Delta_r(UO+,Cf+)/r(Cf+) ˜ 20 % in den Ionenradien geschlossen. Über die Bestimmung der Abnahme der Fm-a Aktivität des Filamentes auf der einen Seite und die Messung der Resonanzzählrate auf der anderen Seite, wurde die Nachweiseffizienz der Apparatur zu 4.5(3) x 10^-4 bestimmt. Die Nachweisapparatur wurde mit dem Ziel weiterentwickelt, Laserspektroskopie am Isotop 251Fm durchzuführen, das über die Reaktion 249Cf(a,2n)251Fm direkt in der optischen Zelle erzeugt werden soll. Das Verfahren wurde am chemischen Homolog Erbium getestet. Dabei wurde das Isotop 163Er über die Reaktion 161Dy(a,2n)163Er erzeugt und nach Resonanzionisation nachgewiesen. Die Nachweiseffizienz der Methode wurde zu 1 x 10^-4 bestimmt.

Zeitaufgelöste Messung der Faltung und Pigmentbindung des Lichtsammlerproteins LHCIIb anhand verschiedener spektroskopischer Monitore

Über die Biogenese des Lichtsammelkomplexes des Photosystems II höherer Pflanzen (LHCII) in der Thylakoidmembran der Chloroplasten existieren wenige Daten. Deswegen soll die Aufklärung des Faltungsmechanismus in vitro anhand von zeitaufgelösten Messungen der Rückfaltung des Komplexes Rückschlüsse auf die Situation in vivo ermöglichen.Zur Beobachtung der Rückfaltung wurden Methoden der Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie verwendet. Die Pigmentbindung und die Ausbildung von α-helikaler Sekundärstruktur erfolgt in einem schnelleren und einem langsameren apparenten Schritt (Sekunden und Minuten); beide Vorgänge sind eng gekoppelt und limitiert durch die Bindung der Carotinoide. In der schnelleren Phase ist die Bindung von Chl a und Lutein ausreichend für die Zunahme an α-helikaler Struktur. Ein thermodynamisch stabiler Komplex erfordert die Bindung von Chl b und Carotinoiden. In der schnellen Phase bindet Chl a vor Chl b und Lutein mindestens so schnell wie Chl b; beide Pigmente limitieren die Bindung von Chl b. Chl b ist notwendig für die Ereignisse der langsameren Phase.Bzgl. der Situation in vivo deuten die Daten auf (1) eine aktive Rolle der Pigmentbindung für die Membraninsertion des Proteins, (2) einen Schutz vor Photooxidation der Chlorophylle durch die obligatorische Carotinoidbindung und (3) die Möglichkeit der Umsetzung von LHCII-gebundem Chl a zu Chl b.