Cis- und trans-Regulation bei Drosophila-T-Box-Genen

Die räumliche und zeitliche Organisation von Genexpression ist für die Entwicklung und das Funktionieren eines jeden Lebewesens von immenser Bedeutung. Dazu laufen eine Vielzahl von Regulationsprozessen auf unterschiedlichen Ebenen ab. In dieser Arbeit wurden im ersten Teil Untersuchungen zur Genregulation des Drosophila optomotor-blind Genes und zur Funktion des Omb Proteins durchgeführt. Eine Mutante, der ein großer Teil der upstream regulatory region (URR) fehlt wurde erzeugt, aus einer Vielzahl von Linien isoliert und molekular charakterisiert. Die biologischen Auswirkungen dieser Deletion werden in Shen et al. (2008) beschrieben. Plasmide zur Erzeugung transgener Fliegen, mit deren Hilfe eine bereits von Sivasankaran et al. (2000) durchgeführte Enhancer-reporter-Analyse vervollständigt werden sollte, wurden hergestellt. Die bereits bekannte Inversion In(1)ombH31 wurde molekular kartiert. Eine Reihe von Konstrukten mit Punktmutationen in der Omb T-Domäne wurden generiert, die unter anderem über deren Funktion hinsichtlich DNA-Protein Interaktion und einer potentiellen Metallionenbindefähigkeit (ATCUN) hin Aufschluss geben sollen. Des Weiteren wurde eine Reihe von P-Element-Deletionslinien auf den Verlust eines alternativen omb Transkriptionsstartpunktes hin untersucht, mit dem Ziel eine vollständige Protein-Nullmutante zur Verfügung zu haben. Der zweite Abschnitt dieser Arbeit befasste sich mit der Erzeugung von Dpp-GFP-Fusionskonstrukten, mit deren Hilfe weitere Erkenntnisse über den Dpp-Langstreckentransport erhofft werden. Es wurde außerdem damit begonnen bei einem weitern Drosophila T-Box Transkriptionsfaktor, Optomotor-blind related gene-1 (Org-1), eine Reihe von Varianten mit homopolymeren polyAlanin und polyGlutamin Expansionen unterschiedlicher Länge herzustellen. Durch Experimente mit diesen Konstrukten soll Aufschluss darüber gewonnen werden, ob Glutamin-Expansionen, wie in der Literatur vorgeschlagen, aktivierend und Alanin-Expansionen in Transkriptionsfaktoren vielleicht reprimierend auf Genaktivität wirken. Letztlich wurden in dieser Arbeit im Rahmen des DROSDEL Projektes (Ryder et al., 2004, 2007) Deletionen in der distalen Hälfte des Chromosomenarms 3R hergestellt. Der DROSDEL Deletionskit, der durch eine Kooperation europäischer Labore entstand stellt der Drosophila Forschung einen umfassenden Satz molekular basengenau definierter Defizienzen zur Verfügung.

Synthese, n.c.a. 18F-Markierung und Evaluierung von Antagonisten der Strychnin-unempfindlichen-Glycinbindungsstelle auf Basis der 4-Amino-5,7-Dichlor-1,2,3,4-Tetrahydro-Chinolin-2-Carbonsäure

ZUSAMMENFASSUNGDer glutamaterge N-Methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA) ist ein wichtiger ionotroper Rezeptor, der die exzitatorische synaptische Transmission im zentralen Nervensystem von Säugetieren vermittelt. Der NMDA-Rezeptor nimmt unter den Glutamatrezeptoren dabei eine Sonderstellung ein, da er mit einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie dem Morbus Parkinson, dem Morbus Huntington, dem Morbus Alzheimer, der Schizophrenie und der Epilepsie in Zusammenhang gebracht wird. Daher besteht ein großes Interesse an der Entwicklung geeigneter 18F-markierter NMDA-Rezeptorliganden zur nicht-invasiven Visualisierung des NMDA-Rezeptorkomplexes mittels der Positronenemissionstomographie.Die 19F-Analoga ADTC1, tADTC1 und tADTC3 - 5 und das nicht-fluorierte 12C-Analogon tADTC2 wurden synthetisiert und ihre in-vitro Affinität und Lipophilie bestimmt. Mit Ausnahme von ADTC1 und tADTC5 die mikromolare Affinitäten besitzen, haben die Liganden in [H-3]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassays niedrige nanomolare Affinitäten für die Glycinbindungsstelle. Die Lipophilie der Verbindungen wurde mit drei verschiedenen Verfahren untersucht und ergab logD7,4-Werte von ungefähr 1 für cADTC1 und tADTC1 – 4, während tADTC5 mit einem logD7,4 von –1,15 eine sehr niedrige Lipophilie aufwies. Die Radiosynthesen der 18F-Liganden wurden hinsichtlich der Umsetzung der Markierungsvorläufer mit 2-[F-18]Fluorethyltosylat oder [F-18]Fluorid untersucht und optimiert. Die höchsten radiochemischen Ausbeuten von ungefähr 90% wurden, unter Verwendung von NaOH als Hilfsbase, bei der 18F-Fluorethylierung von t[F-18]ADTC4 und t[F-18]ADTC5 mit 2-[F-18]Fluorethyltosylat erzielt.

Konformationsanalyse und Lipidbindung am rekombinanten Lichtsammlerprotein LHCIIb höherer Pflanzen

Die Struktur des Haupt-Lichtsammlerproteins II (LHCIIb) höherer Pflanzen ist aufgrund kristallographischer Strukturanalysen zu 94% aufgeklärt. Dennoch ist es bislang nicht gelungen, die aminoterminale Region des Komplexes vollständig zu lokalisieren. In einem ersten Abschnitt dieser Dissertation sollte anhand einer vergleichenden Bindungsstudie mit Hilfe von in vitro - Rekonstitutionen des LHCIIb geklärt werden, ob es sich bei dem so genannten N - terminalen Trimerisierungsmotiv des Lichtsammlerproteins um eine Interaktionsstelle mit dem Phospholipid Phosphatidylglyzerin handelt. Dazu wurden mehrere vergleichende Lipidbindungsstudien an rekombinantem Wildtyp - Protein und verschiedenen LHCIIb - Trimerisierungsmotiv - Mutanten durchgeführt, die allerdings nicht zu reproduzierbaren Ergebnissen führten.Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden intra- und intermolekulare Distanzmessungen an rekombinantem LHCIIb mit Hilfe der Elektronenspin - Resonanz - Spektroskopie durchgeführt. Dazu wurden zweifach mit einem Spin - Label markierte LHCIIb - Monomere und Trimere mit je einer Markierungsposition pro Monomer benutzt. Im Anschluss an die Messungen wurden die erhaltenen Distanzinformationen zusammen mit den bereits zugänglichen Kristallstrukturdaten des Komplexes für eine Modellierung der aminoterminalen Region des LHCIIb verwendet. Die resultierenden Modelle lassen den Schluss zu, dass es im LHCIIb - Trimer zu konformativen Restriktionen des Aminoterminus kommt. Dem entgegen findet man eine größere konformative Diversität in den vermessenen monomeren Komplexen.

Charakterisierung funktioneller Domänen für GABA und Furosemid auf GABA A-Rezeptoren

ZUSAMMENFASSUNGDie schnelle inhibitorische Neurotransmission im Säugerhirn ist wesentlich GABA-erg vermittelt.Neben GABA binden u.a. Picrotoxinin und TBPS (tert-Butylbicyclophosphorothionat) am GABAA-Rezeptor. Die Bindung von [35S]TBPS wird durch alle am GABAA-Rezeptor bindenden Substanzen moduliert. Zur Untersuchung der GABAA-Rezeptor-Funktionen wurden TBPS-Bindungsstudien an rekombinant exprimierten Rezeptoren in vitro und nativen Rezeptoren in situ verwendet.Die alpha-Untereinheiten spielen bei der gehirnarealspezifischen Auswirkungen verschiedener GABA-Mimetika, der Charakterisierung subtypspezifischer Substanzen und der Ausprägung der GABA-Sensitivitäten eine große Rolle. Für die Detaillierung der höheren GABA-Sensitivität alpha6-enthaltender Rezeptoren wurden Chimären und Punktmutationen zwischen den Untereinheiten alpha1 und alpha6 hergestellt. Nach Austausch des Asparagins 188 in der alpha1-Untereinheit durch das alpha6-entsprechende Lysin zeigten Rezeptoren in Kombination mit den Untereinheiten beta3 und gamma2 eine erhöhte GABA-Sensitivität gegenüber dem Wildtyp. Dementsprechend wiesen alpha6-enthaltende Rezeptoren mit der umgekehrten Punktmutation L187N eine geringere GABA-Sensitivität auf. Furosemid wirkt ausschließlich auf alpha6beta2/3-enthaltende GABAA-Rezeptors GABA-agonistisch. [35S]TBPS-Bindungsstudien an chimären alpha1/alpha6-Rezeptoren weisen auf eine niedrigpotente Bindungsstelle für Furosemid im extrazellulären Sequenzabschnitt zwischen der Aoc I-Schnittstelle und der TM3-Region hin. Die Substanz 4 PIOL zeigte subtypspezifischen Charakter am GABAA-Rezeptor. In den [35S]TBPS-Autoradiographien und den Bindungsstudien an Membranen wirkte 4 PIOL auf alpha6-enthaltende Rezeptoren schwach GABA-mimetisch bzw. agonistisch, in den [35S]TBPS-Bindungsstudien an alpha6-enthaltenden rekombinanten Rezeptoren schwach negativ modulatorisch oder antagonistisch.

Immune escape durch Überexpression von HER-2/neu

In Tumoren und Onkogen-transformierten Zellen finden sich häufig Defizienzen in der Expression von Komponenten der MHC Klasse I-Antigenprozessierung, die mit einer verminderten MHC Klasse I-Oberflächenexpression und einer reduzierten Sensitivität der Zellen gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse gekoppelt sein können. Da in den meisten Fällen die reduzierten Expressionsmuster über Zytokine revertiert werden können, werden verschiedene Regulationsmechanismen als Ursache für die Defizienzen postuliert. Auch in Zellen, die den „human epidermal growth factor receptor 2“ (HER-2/neu) überexprimieren, wurden derartige „Immune escape“-Mechanismen identifiziert. Aufgrund der Amplifikation und/oder Überexpression dieses Onkogens in Tumoren, die mit einer schnellen Progression der Erkrankung und einer schlechten Heilungsprognose assoziiert ist, wurden zahlreiche Therapien entwickelt, die auf einer Mobilisierung des Immunsystems gegenüber HER-2/neu oder dessen Blockade durch spezifische Antikörper abzielen. Die bisher jedoch nur unzureichenden Erfolge dieser Therapien könnten ihre Ursache in einer verminderten Immunogenität der HER-2/neu+-Zellen aufgrund von Defizienzen in der MHC Klasse I-Antigenprozessierung haben, weshalb die Untersuchung der molekularen Ursachen dieser Suppression für die Therapie von HER-2/neu+-Tumoren von besonderer Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurde anhand eines in vitro-Systems ein HER-2/neu-vermittelter „Immune escape“-Phänotyp charakterisiert und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen untersucht. Hierzu wurden murine, HER-2/neu--NIH3T3-Zellen mit HER-2/neu-transfizierten NIH3T3-Zellen verglichen. Die Untersuchung zeigte, dass die Oberflächenexpression von MHC Klasse I-Antigenen bei einer HER-2/neu-Überexpression vermindert ist. Dies ist assoziiert mit reduzierten Expressionen von LMP2, LMP10, PA28a, PA28b, ERAAP, TAP1, TAP2, und Tapasin, einem blockiertem TAP-Transport und einer fehlenden Sensitivität gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse. Da die analysierten Defekte durch eine Stimulation mit IFN‑g wieder revertiert werden können, wird eine transkriptionelle oder translationelle Regulation der betroffenen Gene durch HER-2/neu postuliert. Aufgrund dieser Ergebnisse ist eine T-Zell-vermittelte Therapie von HER-2/neu+-Tumoren als kritisch anzusehen. Die Untersuchung der Promotoren von TAP1/LMP2, TAP2 und Tapasin ergab geringere und durch IFN‑g-induzierbare Promotoraktivitäten in den HER-2/neu+-Zellen im Vergleich zu den HER-2/neu—-Zellen. Mittels Mutagenese-PCR und Gelretardationsanalysen konnte die Bindung eines Komplexes an zwei E2F- und einer P300-Bindungsstelle im Tapasin-Promotor identifiziert werden, die für die HER-2/neu-vermittelte Hemmung der Tapasin-Promotor­aktivität essentiell ist. Eine Inaktivierung der E2F- und P300-Motve in den TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren hatte dagegen keinen Einfluss auf die HER-2/neu-vermittelte Blockade der Promotoraktivität. Ein Vergleich der Promotoraktivitäten der HER-2/neu+- mit Ras-transformierten Zellen ergab, dass die TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren in beiden Zellen supprimiert werden, während der Tapasin-Promotor bei Ras-Transformation nicht beein­trächtigt ist. Der Einsatz von Inhibitoren zeigte, dass die Suppression des Tapasin-Promotors vermutlich über die PLC-g-PKC-Kaskade erfolgt. Dagegen konnte mit Inhibitoren gegen MAPK und PI3Kinase kein vergleichbarer Effekt erzielt werden. Aufgrund dieser Daten wird postuliert, dass HER-2/neu über die Signalkaskade PLC-g–PKC–E2F/P300 die Tapasin-Promotoraktivität supprimiert, wohingegen noch bisher unbekannte Signalkaskaden von HER-2/neu und Ras zu einer Hemmung der TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoraktivität führen. Da die Komplexbildung von E2F und P300 auch im Zellzyklus eine Rolle spielt, wird eine negative Korrelation zwischen Zell-Proliferation und MHC Klasse I-Antigenpräsentation postuliert, die Gegenstand künftiger Studien sein wird.

Reinigung und Coexpression von Enzymen der Raubasin-Biosynthese

Die vorgestellten Arbeiten bezüglich der Biosynthese von pflanzlichen Indolalkaloiden können in einen molekularbiologischen und einen proteinche-mischen Teil aufgegliedert werden. Im molekularbiologischen Abschnitt stand die Entwicklung eines Vektorsystems im Vordergrund, das die gleichzeitige Expression mehrerer Enzyme in bakteriellen Kulturen erlaubte. Hierfür konnte zunächst die cDNA der Strictosidin-Synthase aus Rauvolfia serpentina in den Expressionsvektor pQE-70 einkloniert und das Protein aktiv exprimiert werden. Bevor es zum Einbau des Strictosidin-β-D-Glucosidase-Gens –ebenfalls aus Rauvolfia serpentina– kam, musste dessen Aktivität mit einer vorgeschalteten Ribosomenbindestelle sichergestellt werden. Diese zusätzliche Binderegion wurde an das 5’-Ende der cDNA angefügt, um die ungestörte Expression des Enzyms im späteren Coexpressions-System zu gewährleisten. Im Hinblick auf weiterführende Arbeiten in Bezug auf die komplette in vitro-Synthese bereits bekannter Alkaloide, wie z.B. das antiarrhythmisch wirkende Ajmalin oder das antihypertensiv wirkende Heteroyohimbin-Alkaloid Raubasin, wurde die ursprüngliche multiple-clonig-site des verwendeten Expressionsvektors pQE-70 um 27 zusätzliche Restriktionsschnittstellen (verteilt auf 253 bp) erweitert. Nach erfolgreicher Ligation der Strictosidin-β-D-Glucosidase-cDNA mit vorgeschalteter Ribosomenbindestelle an das 3’-Ende des Strictosidin-Synthase-Gens gelang die heterologe Coexpression beider Enzyme in einer homogenen Suspensionskultur des E. coli-Expressionsstamms M15. Dafür wurde das Vektorkonstrukt pQE-70bh-STR-RBS-SG entwickelt. Das Endprodukt der anschließenden enzymatischen Umsetzung von Tryptamin und Secologanin wurde über das Zwischenrodukt Strictosidin gebildet und konnte als Cathenamin identifiziert werden. Im proteinchemischen Teil der Dissertation wurde die Reinigung einer Cathenamin-Reduktase aus Zellsuspensionskulturen von Catharanthus roseus RC mit dem Ziel der partiellen Bestimmung der Aminosäuresequenz bearbeitet. Das gesuchte Enzym wandelte in einer NADPH-abhängigen Reaktion das Edukt Cathenamin in Raubasin um. Des weiteren wurde untersucht, wie viele Enzyme insgesamt an der Umwandlung von Cathenamin zu Raubasin und den eng verwandten Produkten Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin beteiligt waren. Unter Anwendung eines hierfür entwickelten säulenchromatographischen Protokolls gelang die Reinigung einer Raubasin-bildenden Reduktase, deren Teilsequenz jedoch noch nicht bestimmt werden konnte. Die Anzahl der beteiligten Enzyme bei der Ausbildung von Raubasin, Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin konnte auf mindestens zwei beziffert werden.

Genomische Struktur und Promotorcharakterisierung des humanen ADAM10-Gens

Das ADAM10-Gen kodiert für eine membrangebundene Disintegrin-Metalloproteinase, die das Amyloidvorläuferprotein spaltet. Im Mausmodell konnte bewiesen werden, dass die Überexpression von ADAM10 die Plaquebildung vermindern und das Langzeitgedächtnis verbessert. Aus diesem Grund ist es für einen möglichen Therapieansatz für die Alzheimer’sche Erkrankung erforderlich, die Organisation des humanen ADAM10-Gens und seines Promotors aufzuklären. Beim Vergleich der genomischen Sequenzen von humanem und murinem ADAM10 zeigte sich eine hohe Übereinstimmung. Beide Gene umfassen 160 kbp und bestehen aus 16 Exons. Die ersten 500 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt zwischen dem Menschen, der Maus und der Ratte sind hoch konserviert. Diese Region beinhaltet spezifische regulatorische Elemente, die die ADAM10-Transkription modulieren. In den ersten 2179 bp stromaufwärts vom humanen ADAM10-Translationsstartpunkt fanden sich einige potentiellen Transkriptionsfaktor-bindungsstellen (Brn-2, SREBP, Oct-1, Creb1/cJun, USF, Maz, MZF-1, NFkB und CDPCR3HD). Es wurde eine charakteristische GC-Box und eine CAAT-Box, aber keine TATA-Box identifiziert. Nach Klonierung dieser 2179 bp großen Region wurde eine starke Promotoraktivität, insbesondere in neuronalen Zelllinien, gefunden. Bei der Analyse von Deletionskonstrukten wurde die Region zwischen -508 und -300 als essentiell für die Transkriptionsaktivierung bestimmt. Die Promotoraktivität wird zudem streng herunterreguliert, wenn in die Region 317 bp stromaufwärts vom Startpunkt der Translation eine Punktmutation eingeführt wird. Diese per Computeranalyse als USF-Bindungsstelle deklarierte Region spielt eine zentrale Rolle bei der ADAM10-Transkription. Im EMSA wurde eine Protein-DNA-Interaktion für diese Region gezeigt. Durch transienten Transfektionen in Schneider Drosophila Insektenzellen konnte nachgewiesen werden, dass die Überexpression von Sp1 und USp3 für die ADAM10-Promotoraktivität entscheidend ist. In EMSA-Studien bestätigte sich eine Protein-DNA-Interaktion für die Region -366 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Die Punktmutation in der CAAT-Box veränderte die die Promotoraktivität nicht. Da weiterhin für diese potentielle Bindungsstelle kein Bindungsfaktor vorausgesagt wurde, scheint die CAAT-Box keine Bedeutung bei der Promotorregulation zu spielen. Schließlich fand sich im EMSA eine Protein-DNA-Interaktion für die Bindungsstelle 203 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Diese in Computeranalysen als RXR-Bindungsstelle identifizierte Region ist ebenfalls von Bedeutung in der Promotorregulation. Auf der Suche nach Substanzen, die die ADAM10-Promotoraktivität beeinflussen, wurde ein negativer Effekt durch die apoptoseauslösende Substanz Camptothecin und ein positiver Effekt durch die zelldifferenzierungsauslösende Substanz all-trans Retinsäure festgestellt. Mit dieser Arbeit wurde die genomische Organisation des ADAM10-Gens zusammen mit dem zugehörigen Promotor aufgeklärt und ein neuer Regulationsmechanismus für die Hochregulation der Expression der alpha-Sekretase ADAM10 gefunden. Im Weiteren sollen nun die genauen Mechanismen bei der Hochregulation der alpha-Sekretase ADAM10 durch Retinsäure untersucht und durch Mikroarray-Analysen an RNA-Proben transgener Mäuse, welche ADAM10 überexpremieren, neue therapeutische Ansätze zur Behandlung der Alzheimer´schen Erkrankung identifiziert werden.

Post-transkriptionelle Regulation der Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase

Die Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase (iNOS) wird sowohl über transkriptionelle als auch über post-transkriptionelle Mechanismen reguliert. Dabei spielt die Modulation der iNOS-mRNA-Stabilität durch RNA-bindende Proteine eine bedeutende Rolle. In dieser Arbeit konnte eine Beteiligung des p38-MAPK-Signaltransduktionsweges sowie der RNA-bindenden Proteine TTP, KSRP, HuR und PTB an der Regulation der iNOS-Expression dargestellt werden. Hemmung der p38-MAPK führte zu einer Reduktion der iNOS-mRNA-Expression, hatte aber keinen Effekt auf die iNOS-Promotoraktivität. Das RNA-bindende Protein Tristetraprolin (TTP) erhöhte die Stabilität der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation, ohne jedoch mit ihr zu interagieren. Die Proteinexpression von TTP war unter dem Einfluss von Zytokinen erhöht; Inhibition der p38-MAPK verursachte eine Verminderung der Zytokin-stimulierten TTP-Expression. Das „KH-type splicing regulatory protein" (KSRP) übte einen destabilisierenden Effekt auf die iNOS-mRNA aus. Der Abbau der mRNA wird dabei wahrscheinlich durch eine Zytokin-unabhängige Interaktion von KSRP mit dem Exosom vermittelt. Ebenso konnte zwischen KSRP und TTP eine Wechselwirkung beobachtet werden, die nach Induktion der iNOS-Expression mit Zytokinen verstärkt und durch p38-MAPK-Inhibitoren hemmbar war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA-3’-UTR für die Vermittlung des destabilisierenden Effekts essentiell ist. Eine genaue Lokalisierung der KSRP-Bindungsstelle ergab, dass KSRP ebenso wie HuR mit dem AU-reichen Element am 3’-Ende der 3’-UTR interagiert. KSRP und HuR sind in der Lage, um diese Bindungsstelle zu konkurrieren. Nach Zytokin-Stimulation war dementsprechend die endogene Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA vermindert, während die endogene Bindung von HuR an die iNOS-mRNA verstärkt war. Die Stabilisierung der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation ergibt sich demnach aus einer Verminderung der Bindung des KSRP-Exosom-Komplexes an die iNOS-mRNA als Folge der verstärkten Interaktion von TTP und KSRP. Dies ermöglicht parallel eine vermehrte Bindung von HuR an die iNOS-3’-UTR und führt damit zu einer Stabilisierung der iNOS-mRNA und so letztendlich auch zu einer Erhöhung der iNOS-Expression. Außerdem konnte eine Beteiligung des Polypyrimidin-Trakt-bindenden Proteins (PTB) an der Regulation der humanen iNOS-Expression gezeigt werden. PTB erhöhte die Expression der iNOS und interagierte Zytokin-unabhängig mit KSRP. Zusammenfassend lässt sich schließen, dass ein Zusammenspiel verschiedener Proteine in einem komplexen Netzwerk für die fein abgestimmte Regulation der humanen iNOS-Expression auf post-transkriptioneller Ebene verantwortlich.

Synthese, 18 F-Markierung, 11 C-Markierung und Evaluierung Hydantoin-substituierter Indolcarbonsäuren zur Visualisierung des NMDA-Rezeptorstatus mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)

Der N-methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA), als Vertreter ionotroper Glutamat-Rezeptoren, ist essentiell für physiologische Lern- und Gedächtnisvorgänge und eine krankhafte Überaktivierung wird als potentielle Ursache für eine Reihe von akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen angesehen. Hierbei sind für die akuten Erkrankungen vor allem der Schlaganfall und für die chronischen Erkrankungen Morbus Parkinson sowie die Alzheimer´sche Demenz zu nennen. Durch seine einzigartige spannungsabhängige Mg2+-Blockade und der Notwendigkeit der gleichzeitigen Anwesenheit der endogenen Liganden Glutamat und Glycin zur Rezeptoraktivierung, stellt dieser Rezeptorkomplex daher ein sehr interessantes molekulares Target dar. NMDA-Rezeptor-Antagonisten der Glycin-Bindungsstelle und der verschiedenen allosterischen Bindungsstellen könnten als Neuroprotektiva bei den verschiedenen Krankheiten eine symptomatische Verbesserung bewirken und zur Therapie eingesetzt werden. Eine visuelle Darstellung des Rezeptors im Rahmen von Vorsorgeuntersuchungen ist jedoch derzeit nicht möglich. Zur Visualisierung dieser Prozesse mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wurden basierend auf einer Hydantoin-substituierten Indol-2-carbonsäure als Leitstruktur, im Rahmen dieser Arbeit Fluorethoxy- und Methoxy-substituierte Derivate dargestellt und in pharmazeutischen und radiopharmazeutischen Studien evaluiert. Dazu wurde die Affinität und Spezifität zum Rezeptor in einem [3H]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassay und die Lipophilie als Parameter für die Hirngängigkeit ermittelt. Anhand dieser Resultate wurden geeignete Markierungsvorläufer synthetisiert, welche eine phenolische Hydroxylfunktion besitzen und eine radioaktive Markierung mit den sekundären Markierungsvorläufern 2-[18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [11C]Methyliodid ([11C]CH3I) ermöglichen. Unter Verwendung von 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure wurde in einer Einstufenreaktion mit [18F]FETos die Zielverbindung 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure in radiochemischen Ausbeuten von 6 % erhalten. Daher wurde eine alternative Markierung des Ethylester-geschützten Derivates 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäureethylester in einer Zweistufensynthese mit [18F]FETos und [11C]CH3I untersucht. Unter Verwendung dieser Strategie wurden unter optimierten Bedingungen 4,6-Dichlor-3-((3-4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäureethylester und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxy-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)-methyl)-indol-2-carbonsäureethylester in radiochemischen Ausbeuten von 27 – 38 % erhalten. Die anschließende Entfernung der Schutzgruppe führte unter Bildung von Neben- und Zersetzungsreaktionen zu 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure in radiochemischen Gesamtausbeuten von 5 – 7 %. Die Überprüfung des biochemischen Konzepts in vivo durch µ-PET-Studien und durch autoradiographische Experimente an Rattenhirnschnitten, deuten auf eine niedrige in vivo-Aktivität hin, welche sich auf eine nicht ausreichende Passage der Blut-Hirn-Schranke zurückführen lässt.

Untersuchungen zur Interaktion von Cholesterin mit cholesterinbindenden Proteinen

Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Biosynthese von Steroidhormonen ist der Transport von Cholesterin von der äußeren zur inneren Mitochondrienmembran, wo es zu dem Steroid Pregnenolon umgewandelt wird. Für diesen Transport ist das StAR-Protein (Steroidogenic Acute Regulatory Protein) notwendig. Ein weiteres an der Bildung von Steroidhormonen beteiligtes Protein ist das MLN64-Protein. Beide Proteine besitzen so genannte START-Domänen (StAR related Lipid Transfer-Domänen), die Cholesterin binden können. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die START-Domänen von StAR und MLN64 Cholesterin auf unterschiedliche Weise binden. Es ist noch nicht geklärt, auf welche Weise das StAR-Protein den Cholesterintransport in die Mitochondrien bewirkt. Das StAR-Protein könnte Cholesterin binden und als Cholesterintransporter zwischen äußerer und innerer Mitochondrienmembran fungieren. Nach einer anderen Hypothese wirkt das StAR-Protein ausschließlich an der äußeren Mitochondrienmembran. Es wird auch postuliert, dass das StAR-Protein in einem teilweise entfalteten Zustand vorliegen muss, um seine Funktion erfüllen zu können. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass StAR ein fotoreaktives Cholesterinderivat bindet. Die Cholesterinbindungsstelle des StAR-Proteins konnte eingegrenzt werden. Es wurden Experimente durchgeführt, um zu überprüfen, ob das Protein tatsächlich nur in teilweise entfaltetem Zustand aktiv ist. Die Cholesterinbindung des MLN64-Proteins wurde ebenfalls mit dem fotoreaktiven Cholesterinderivat untersucht. Dabei zeigte sich, dass MLN64 offenbar mehrere Bindungsstellen für Cholesterin besitzt. Weitere Experimente beschäftigten sich mit der Charakterisierung der Cholesterinbindungsstelle des humanen Oxytocinrezeptors, eines G-Protein gekoppelten Hormonrezeptors, der durch Cholesterin reguliert wird. Dabei kam auch wieder das fotoreaktive Cholesterinderivat zum Einsatz. Außerdem wurden in dieser Arbeit Experimente durchgeführt, die sich mit der Regulation der Cholesterinbiosynthese befassten. Die Biosynthese des Cholesterins wird reguliert, indem in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums verankerte Transkriptionsfaktoren proteolytisch freigesetzt werden. Das passiert nur dann, wenn der zelluläre Cholesterinspiegel niedrig ist. Bei diesem Regulationsmechanismus spielt das Protein SCAP eine zentrale Rolle (Sterol responsive element binding protein Cleavage Activating Protein). SCAP bindet Cholesterin spezifisch und wird dadurch reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der Bereich von SCAP eingegrenzt werden, der Cholesterin bindet. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Interaktion von SCAP mit einem anderen, als Insig bezeichneten Protein indirekt durch das Cholesterinderivat 25-Hydroxycholesterin reguliert wird.

Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina

Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Kristallisation und der strukturellen Auswertung der Arbutin-Synthase (AS) und der Strictosidin Glukosidase (SG). Beide Enzyme stammen aus der Medizinalpflanze Rauvolfia serpentina. Für die Kristallisation der Arbutin-Synthase wurden ca. 2500 verschiedene Beding-ungen experimentell untersucht. Für einige dieser Experimente wurde das Enzym molekularbiologisch und chemisch verändert. Trotzdem konnten keine Kristalle erhalten werden. Die bei diesen Veränderungen erhaltenen Ergebnisse wurden anhand von Vergleichen mit Strukturen anderer Glykosyltransferasen der gleichen Familie analysiert. Bei der Reinigung der AS konnte mit verschiedenen Trennsystemen nie eine homogene Lösung produziert werden. Der wahrscheinliche Grund für diese schlechte Isolierbarkeit, und damit der wahrscheinliche Grund für die schwierige Kris-tallisation, liegt in der überdurchschnittlich hohen Anzahl an Cysteinen in der Proteinsequenz. Mit den Aminosäuren Cys171, Cys253 und Cys461 wurden drei Cysteine gefunden, die einem Strukturvergleich nach an der Proteinoberfläche liegen und möglicherweise durch Quervernetzungen mit anderen Proteinmolekülen ein heterogenes Gemisch bilden, das nicht geordnet kristallisieren kann. Durch gezielte Mutationen dieser drei Aminosäuren könnte die Kristallisation zukünftig ermöglicht werden. Für die SG waren bereits Bedingungen bekannt bei denen nicht vermessbare Enzymkristalle (Nadeln) wuchsen. In weit gefächerten Versuchen konnten diese Kristalle jedoch nicht zu 3D-Wachstum angeregt werden. Es wurden mit einem HTS-Screening neue Bedingungen zur Kristallisation gefunden. Anschließend konnten die native Struktur und der Strictosidin/Enzym-Komplex vermessen und aufgeklärt werden. Die SG gehört zur Familie 1 der Glukosidasen (GH-1) und besitzt die in dieser Familie konservierte (beta/alpha)8-Barrel-Faltung. Im Vergleich mit 16 bekannten Glykosidasen der Familie GH-1 wurde die Substratbindung untersucht. Dabei wurde die in der Familie konservierte Zuckerbindung vorgefunden, jedoch große Unterschiede in der Aglykonbindung entdeckt. Es wurden Bedingungen für die Konformationsänderung des Trp388 erkannt. Diese Konformationsänderung dirigiert den Aglykonteil des Substrates auf verschiedene Seiten der Substratbindungstasche und teilt so die Familie GH-1 in zwei Gruppen.

3D-Cryo-Elektronenmikroskopie des 4x6-Hämocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum unter Oxy- und Deoxybedingungen

Arthropodenhämocyanine und Molluskenhämocyanine, die extrazellulären Atmungsproteine der Arthropoden und Mollusken, unterscheiden sich grundsätzlich im Aufbau, besitzen aber ähnliche aktive Zentren, welche in ihrer oxydierten Form für die Blaufärbung der Hämocyanine verantwortlich sind. Sauerstoff wird im Bindungszentrum zwischen zwei, von sechs Histidinen ligandierten, Kupfer(I)Ionen gebunden. Arthropodenhämocyanine bauen sich artspezifisch aus 1, 2, 4, 6, oder 8 Hexameren mit D3-Symmetrie auf. Die Untereinheiten von je ca. 75 kDa falten sich in drei Domänen unterschiedlicher Funktionen. Der komplexe, hierarchische Zusammenbau der Arthropodenhämocyanine hängt von der Heterogenität der Untereinheiten ab. Die 7 verschieden Sequenzen des 4x6-Hämocyanins von Eurypelma californicum (EcHc) sind biochemisch in der Quartärstruktur lokalisiert. Bislang fehlte noch ein unabhängig erstelltes 3D-Modell der geometrischen Gesamtstruktur welche die hexamere und monomere Topographie eindeutig zeigt. Dessen Erstellung war Gegenstand dieser Arbeit, in Verbindung mit der Zielsetzung, die 3D-Rekonstruktion in den beiden extremen physiologischen Zuständen, mit und ohne gebundenen Sauerstoff, zu erzeugen. Dazu wurden in einer eigens entwickelten Atmosphären-Präparationskammer die Proteine in Lösung schockgefrorenen und mittels Cryo-3D-Elektronenmikroskopie gemessen. Aus den daraus gewonnen Projektionsbildern ließen sich mit der ”Single Particle Analyse“ die 3D-Informationen zurückberechnen. Die 3D-Rekonstruktionen wurden mit der publizierten Röntgenkristallstruktur des hexameren Referenz-Hämocyanins der Languste Panulirus interruptus verifiziert. Die Rekonstruktionen erlaubten die eindeutige Messung diverser in der Literatur diskutierter Parameter der Architektur des 4x6-EcHc und darüber hinaus weiterer geometrischer Parameter, welche hier erstmals veröffentlicht werden. SAXS-Daten sagen extreme Translationen und Rotationen von Teilquartärstrukturen zwischen oxy- und deoxy-EcHc voraus, was von den 3D-Rekonstruktionen der beiden Zustände nicht bestätigt werden konnte: Die 16 Å Rekonstruktion der Deoxyform weicht geometrisch nicht von der 21 Å Rekonstruktion der Oxyform ab. Die Einpassung der publizierten Röntgenstruktur der Untereinheit II des Hämocyanin des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus in die Rekonstruktionen unterstützt eine auf der hexameren Hierarchieebene lokalisierte Dynamik der Oxygenierung. Mittels Einpassung modellierter molekularer Strukturen der EcHc-Sequenzen konnte eine erste Vermutung zur Lokalisation der beiden zentralen Linker-Untereinheiten b und c des 4x6-Moleküls gemacht werden: Demnach würde Untereinheit b in den exponierten Hexameren des Moleküls liegen. Aussagen über die Quartärstrukturbindungen auf molekularer Ebene aufgrund der Einpassung modellierter molekularer Daten in die Rekonstruktionen sind als spekulativ einzustufen: a) Die Auflösung der Rekonstruktion ist verbesserungswürdig. b) Es gibt keine adäquate Vorlage für eine verlässliche Strukturvorhersage; die verschiedenen EcHc-Sequenzen liegen nur als Modellierung vor. c) Es wäre eine flexible Einpassung notwendig, um Ungenauigkeiten in den modellierten Strukturen durch Sekundärstrukturanpassung zu minimieren.

Untersuchung der Bindung des humanen Papillomvirus HPV16 an Heparansulfate der Zelloberfläche

In 99,7% aller Zervixkarzinome kann die DNA humaner Papillomviren (HPV) nachgewiesen werden, die somit den Hauptauslöser für eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen weltweit darstellen. HPV16 ist verantwortlich für etwa 50% aller Zervixkarzinome. Für die Infektion von Zellen mit HPV16 ist die Interaktion mit Heparansulfatproteoglykanen der Zelloberfläche essentiell. Um Aminosäuren auf der Oberfläche des majoren Kapsidproteins L1 von HPV16 zu identifizieren, die zu dieser Interaktion beitragen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zahlreiche Punktmutanten hergestellt und analysiert. Der Austausch der drei Lysine K278, K356 und K361 zu Alaninen führte zu signifikant verminderter Zell-, Heparin- und Heparansulfatbindung, die noch weiter reduziert wurde, wenn zwei oder drei der Lysine gleichzeitig mutiert waren. Auch die Infektiosität der mutanten Pseudovirionen war stark beeinträchtigt, die Trippelmutante zeigte nur noch 5% Infektiosität. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die drei Lysine gemeinsam die Bindestelle für Heparansulfate bilden. Ihr Austausch zu Argininen beeinflusste die Infektiosität der Partikel hingegen nicht, was bestätigt, dass die Interaktion mit Heparansulfaten von der positiven Ladungsdichte abhängt und nicht sequenzspezifisch ist. Die drei Lysine befinden sich auf der Spitze des HPV16-Kapsomers in einer flachen Tasche, die aufgrund ihrer Struktur bereits früher als potentielle Rezeptorbindestelle vorgeschlagen wurde. Fab-Fragmente des bindungsneutralisierenden Antikörpers H16.56E, dessen Epitop in direkter Nachbarschaft der Lysine liegt, inhibierten die heparansulfatvermittelte Zellbindung viraler Partikel. Auch Epitope anderer bindungsneutralisierender Antikörper befinden sich in der Nähe. Dies untermauert die Hypothese, dass die Lysine K278, K356 und K361 die Heparansulfatbindestelle von HPV16 bilden. Der Austausch von Threoninen, die genau zwischen den Lysinen liegen, hatte keine Auswirkung auf Bindung der Partikel und Infektiosität. Sie könnten jedoch durch die Bildung von Wasserstoffbrücken die Bindung an Heparansulfat stabilisieren. Die Bedeutung der Lysine K278, K356 und K361 bei der primären Interaktion von HPV16 mit Heparansulfaten konnte durch die Computersimulation der Interaktion der Virusoberfläche mit einem Heparinmolekül bestätigt werden. Des Weiteren konnten Anforderungen ermittelt werden, die eine solche Interaktion an das Heparinmolekül stellt. Weiterhin zeigten die Ergebnisse dieser Arbeit, dass basische Aminosäuren in der interkapsomeren Grube nicht an der primären Zellbindung an Heparansulfate beteiligt zu sein scheinen, aber eine Rolle bei sekundären Interaktionen mit der Zelloberfläche spielen könnten.

Specific PET-ligands for selected 5-HT and GABA A-receptor subtypes = PET-Liganden mit Spezifität für definierte 5-HT und GABA A-Rezeptor-Subtypen

Für diese Arbeit wurden sechs neue Benzodiazepinderivate, TC07, TC08, TC09, TC10, TC11 und TC12, hergestellt. Diese wurden mittels Radioligandenbindungsassay sowohl auf ihre Bindungseigenschaften für Membranen des Cerebellum, des Hippo-campus und des Cortex der Ratte hin untersucht, als auch für Membranen von HEK293 Zellen, die transient rekombinante GABAA Rezeptoren exprimierten. Zusätz-lich wurden kompetitive in situ Rezeptorautoradiographien an Rattenhirnschnitten mit den Liganden [3H]Ro15-4513 und [3H]R015-1788 durchgeführt. Zusammen ergaben sich aus diesen Experimenten deutliche Hinweise auf eine Selektivität der Verbindun-gen TC07, TC11 und TC12 für a5-Untereinheiten enthaltende GABAA Rezeptoren mit a5-Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich. In vivo Bindungsexperimente in Ratten, mit [3H]Ro15-1788 als Tracer und TC07 als Kompetitor, ergaben, dass TC07 mehr [3H]Ro15-1788 im Vorderhirn als im Cerebellum verdrängt. Bezog man die regionale Verteilung der a5-Untereinheit des GABAA Rezep-tors im Rattenhirn mit ein – sehr wenige a5-Untereinheiten im Cerebellum, etwa 20 % der GABAA Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus – untermauerten diese Ergeb-nisse die Vermutung, TC07 könne a5-selektiv sein. Diese Daten bestätigten darü-berhinaus, dass TC07 die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Für elektrophysiologische Messungen mit TC07 und TC12 wurden die oben erwähnten transient transfizierten HEK293 Zellen verwendet, welche die GABAA Rezeptor Unte-reinheitenkombination a5b3g2 exprimierten. Das Dosis-Antwort Verhalten ergab keinen signifikanten Effekt für TC12. Die Daten von TC07 dagegen lassen auf einen schwach negativ modulatorischen Effekt schließen, was, zumindest theoretisch, die Möglichkeit eröffnet, TC07 auch als sogenannten cognitive enhancer einzusetzen. Der errechnete Ki-Wert lag in derselben Größenordnung wie der Ki-Wert, der anhand der Bindungsas-saydaten errechnet wurde. Insgesamt rechtfertigen die bisherigen Ergebnisse die radiochemische Markierung mit 18F von drei der sechs getesteten Verbindungen in der Reihenfolge TC07, TC12 und TC11. Des Weiteren wurde [18F]MHMZ, ein potentiell 5-HT2A selektiver Ligand und PET-Tracer einschließlich Vorläufer und Referenzverbindungen, mit hohen Ausbeuten syn-thetisiert (Herth, Debus et al. 2008). Autoradiographieexperimente mit Rattenhirn-schnitten zeigten hervorragende in situ Bindungseigenschaften der neuen Verbindung. Die Daten wiesen eine hohe Selektivität für 5-HT2A Rezeptoren in Verbindung mit einer niedrigen unspezifischen Bindung auf. [18F]MHMZ erfährt in vivo eine schnelle Metabo-lisierung, wobei ein polarer aktiver Metabolit entsteht, welcher vermutlich nicht die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Transversale, sagittale und coronale Kleintier-PET-Bilder des Rattenhirns zeigten eine hohe Anreicherung im frontalen Cortex und im Striatum, während im Cerebellum so gut wie keine Anreicherung festzustellen war. Diese Verteilung deckt sich mit der bekann-ten Verteilung der 5-HT2A Rezeptoren. Die in vivo Anreicherung scheint sich ebenfalls gut mit der Verteilung der in den Autoradiographieexperimenten gemessenen Bindung zu decken. Nach Berechnungen mit dem 4-Parameter Referenzgewebe Modell beträgt das Bindungspotential (BP) für den frontalen Cortex 1,45. Das Cortex zu Cerebellum Verhältnis wurde auf 2,7 nach 30 Minuten Messzeit bestimmt, was bemerkenswert nah an den von Lundkvist et al. für [11C]MDL 100907 publizierten Daten liegt. Abgesehen von der etwas niedrigeren Affinität waren die gemessenen in vitro, in situ und in vivo Daten denen von [3H]MDL 100907 und [11C]MDL 100907 sehr ähnlich, so dass wir ein [18F]Analogon in der Hand haben, das die bessere Selektivität von MDL 100907 verglichen mit Altanserin mit der längeren Halbwertszeit und den besse-ren Eigenschaften für die klinische Routine von 18F verglichen mit 11C verbindet. Die Ergebnisse von [18F]MHMZ rechtfertigenden weitere Experimente, um diesen Liganden für die klinische Routine am Menschen nutzbar zu machen.

Identifizierung und Charakterisierung von Intermediärfilament-Organisatoren in Caenorhabditis elegans

Intermediärfilamente (IFs) sind neben Mikrotubuli und Aktinfilamenten die dritte filamentäre Komponente des Zytoskeletts. Sie wirken als mechanische Stabilisatoren, sind außerdem an Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose beteiligt und tragen zu Zellpolarität bei. IFs sind dynamische Strukturen, die zelltypspezifisch in unterschiedlichen Anordnungen und Abundanzen vorkommen und von Signalkaskaden beeinflusst werden. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser fein abgestimmten Prozesse sind weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit sollte deswegen ein Tiermodell entwickelt werden, um Regulatoren der IF-(Netzwerk)-Organisation in vivo zu untersuchen und zu identifizieren. Dazu wurde C. elegans ausgewählt, da es sich hierbei um einen genetisch gut charakterisierten und leicht manipulierbaren Organismus handelt, in dessen Genom elf Gene für zytoplasmatische IFs kodieren. Zunächst wurden stabil transgene C. elegans-Linien generiert, die fluoreszierende IFs exprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass das darmspezifische IFB-2::CFP im Bereich des apikalen Junktionskomplex verankert ist und nahezu vollständig im subapikalen Terminalgeflecht der Enterozyten lokalisiert, das als Teil der endotube besonders stabil und widerstandsfähig ist. Wenn diese Tiere mit dsRNA gegen das ebenfalls im Terminalgeflecht exprimierte IF ifc-2 behandelt wurden, entwickelten sich blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens, die auf eine Schwächung der rigiden und formgebenden endotube hinwiesen und damit einen direkten in vivo-Beweis für die stressprotektive Funktion des intestinalen IF-Netzwerks lieferten. Die leichte Detektierbarkeit des IFB-2::CFP-Musters wurde in einem optischen Screen ausgenutzt, bei dem nach chemischer Mutagenese nach Veränderungen im IF-Muster gefahndet wurde. Hierbei wurden drei Mutanten isoliert. In Komplementationsanalysen stellte sich heraus, dass es sich in zwei Fällen um Allele desselben Gens handelt. Die Identifizierung der betroffenen Gene gelang durch eine PCR-basierte Kartierung von single nucleotide polymorphisms nach Verpaarung mit dem Hawaii-Stamm (snp-mapping) und anschließender RNAi-Analyse der Einzelgene in den identifizierten Chromosomenabschnitten. Im einen Fall handelte es sich um das sma-5-Gen, einer Serin/Threonin-Kinase mit Homologie zu den MAP-Kinasen MAPK7/ERK5 der Säuger. Hier wurden, ebenso wie beim ifc-2 (RNAi)-Phänotyp, progressive blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens beobachtet. Die beiden anderen Allele tragen Mutationen in einem bisher nicht näher charakterisierten Gen. In diesen Würmern kommt es zu einem vollständigen Auflösung des IFB-2::CFP-Netzwerks mit prominenten Akkumulationen um die apikalen Junktionen. Das Darmlumen ist stellenweise geweitet und das elektronendichte Terminalgeflecht fehlt fast vollständig, die Integrität des Darmepithels ist jedoch nicht kompromittiert. Die anderen IFs des Terminalgeflechts sind ebenfalls fehlverteilt, und die intestinale Expression von Aktin ist stark reduziert. Expressionskonstrukte des Gens zeigten weiterhin, dass es darmspezifisch synthetisiert wird und mit den IFs im Terminalgeflecht kolokalisiert. Das Protein ist, ähnlich wie das IF-assoziierte Filaggrin der Säuger ausgesprochen histidinreich. Es enthält außerdem eine Prolin-reiche Domäne, die Teil einer potentiellen Aktin-Bindedomäne ist. Auf Grund all dieser Eigenschaften wird die Bezeichnung IFO-1 (intermediate filament organizer) für das neue Protein vorgeschlagen, das möglicherweise als struktureller Zytoskelett-Linker wirkt. Die vorgestellten Ergebnisse untermauern die Bedeutung von C. elegans für die Identifizierung von Faktoren, die IF-Netzwerke regulieren, und die Möglichkeit, Defekte im lebenden Gesamtorganismus zu bestimmen.