Biochemical analysis of the phosphatase domain of the human soluble epoxide hydrolase (sEH)

Die lösliche Epoxidhydrolase (sEH) gehört zur Familie der Epoxidhydrolase-Enzyme. Die Rolle der sEH besteht klassischerweise in der Detoxifikation, durch Umwandlung potenziell schädlicher Epoxide in deren unschädliche Diol-Form. Hauptsächlich setzt die sEH endogene, der Arachidonsäure verwandte Signalmoleküle, wie beispielsweise die Epoxyeicosatrienoic acid, zu den entsprechenden Diolen um. Daher könnte die sEH als ein Zielenzym in der Therapie von Bluthochdruck und Entzündungen sowie diverser anderer Erkrankungen eingesetzt werden. rnDie sEH ist ein Homodimer, in dem jede Untereinheit aus zwei Domänen aufgebaut ist. Das katalytische Zentrum der Epoxidhydrolaseaktivität befindet sich in der 35 kD großen C-terminalen Domäne. Dieser Bereich der sEH s wurde bereits im Detail untersucht und nahezu alle katalytischen Eigenschaften des Enzyms sowie deren dazugehörige Funktionen sind in Zusammenhang mit dieser Domäne bekannt. Im Gegensatz dazu ist über die 25 kD große N-terminale Domäne wenig bekannt. Die N-terminale Domäne der sEH wird zur Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen gezählt, jedoch war die Funktion dieses N-terminal Domäne lange ungeklärt. Wir haben in unserer Arbeitsgruppe zum ersten Mal zeigen können, dass die sEH in Säugern ein bifunktionelles Enzym ist, welches zusätzlich zur allgemein bekannten Enzymaktivität im C-terminalen Bereich eine weitere enzymatische Funktion mit Mg2+-abhängiger Phosphataseaktivität in der N-terminalen Domäne aufweist. Aufgrund der Homologie der N-terminalen Domäne mit anderen Enzymen der HAD Familie wird für die Ausübung der Phosphatasefunktion (Dephosphorylierung) eine Reaktion in zwei Schritten angenommen.rnUm den katalytischen Mechanismus der Dephosphorylierung weiter aufzuklären, wurden biochemische Analysen der humanen sEH Phosphatase durch Generierung von Mutationen im aktiven Zentrum mittels ortsspezifischer Mutagenese durchgeführt. Hiermit sollten die an der katalytischen Aktivität beteiligten Aminosäurereste im aktiven Zentrum identifiziert und deren Rolle bei der Dephosphorylierung spezifiziert werden. rnrnAuf Basis der strukturellen und möglichen funktionellen Ähnlichkeiten der sEH und anderen Mitgliedern der HAD Superfamilie wurden Aminosäuren (konservierte und teilweise konservierte Aminosäuren) im aktiven Zentrum der sEH Phosphatase-Domäne als Kandidaten ausgewählt.rnVon den Phosphatase-Domäne bildenden Aminosäuren wurden acht ausgewählt (Asp9 (D9), Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124), Lys160 (K160), Asp184 (D184), Asp185 (D185), Asn189 (N189)), die mittels ortsspezifischer Mutagenese durch nicht funktionelle Aminosäuren ausgetauscht werden sollten. Dazu wurde jede der ausgewählten Aminosäuren durch mindestens zwei alternative Aminosäuren ersetzt: entweder durch Alanin oder durch eine Aminosäure ähnlich der im Wildtyp-Enzym. Insgesamt wurden 18 verschiedene rekombinante Klone generiert, die für eine mutante sEH Phosphatase Domäne kodieren, in dem lediglich eine Aminosäure gegenüber dem Wildtyp-Enzym ersetzt wurde. Die 18 Mutanten sowie das Wildtyp (Sequenz der N-terminalen Domäne ohne Mutation) wurden in einem Expressionsvektor in E.coli kloniert und die Nukleotidsequenz durch Restriktionsverdau sowie Sequenzierung bestätigt. Die so generierte N-terminale Domäne der sEH (25kD Untereinheit) wurde dann mittels Metallaffinitätschromatographie erfolgreich aufgereinigt und auf Phosphataseaktivität gegenüber des allgemeinen Substrats 4-Nitophenylphosphat getestet. Diejenigen Mutanten, die Phosphataseaktivität zeigten, wurden anschließend kinetischen Tests unterzogen. Basiered auf den Ergebnissen dieser Untersuchungen wurden kinetische Parameter mittels vier gut etablierter Methoden berechnet und die Ergebnisse mit der „direct linear blot“ Methode interpretiert. rnDie Ergebnisse zeigten, dass die meisten der 18 generierten Mutanten inaktiv waren oder einen Großteil der Enzymaktivität (Vmax) gegenüber dem Wildtyp verloren (WT: Vmax=77.34 nmol-1 mg-1 min). Dieser Verlust an Enzymaktivität ließ sich nicht durch einen Verlust an struktureller Integrität erklären, da der Wildtyp und die mutanten Proteine in der Chromatographie das gleiche Verhalten zeigten. Alle Aminosäureaustausche Asp9 (D9), Lys160 (K160), Asp184 (D184) und Asn189 (N189) führten zum kompletten Verlust der Phosphataseaktivität, was auf deren katalytische Funktion im N-terminalen Bereich der sEH hindeutet. Bei einem Teil der Aminosäureaustausche die für Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124) und Asn185 (D185) durchgeführt wurden, kam es, verglichen mit dem Wildtyp, zu einer starken Reduktion der Phosphataseaktivität, die aber dennoch für die einzelnen Proteinmutanten in unterschiedlichem Ausmaß zu messen war (2 -10% and 40% of the WT enzyme activity). Zudem zeigten die Mutanten dieser Gruppe veränderte kinetische Eigenschaften (Vmax allein oder Vmax und Km). Dabei war die kinetische Analyse des Mutanten Asp11  Asn aufgrund der nur bei dieser Mutanten detektierbaren starken Vmax Reduktion (8.1 nmol-1 mg-1 min) und einer signifikanten Reduktion der Km (Asp11: Km=0.54 mM, WT: Km=1.3 mM), von besonderem Interesse und impliziert eine Rolle von Asp11 (D11) im zweiten Schritt der Hydrolyse des katalytischen Zyklus.rnZusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass alle in dieser Arbeit untersuchten Aminosäuren für die Phosphataseaktivität der sEH nötig sind und das aktive Zentrum der sEH Phosphatase im N-terminalen Bereich des Enzyms bilden. Weiterhin tragen diese Ergebnisse zur Aufklärung der potenziellen Rolle der untersuchten Aminosäuren bei und unterstützen die Hypothese, dass die Dephosphorylierungsreaktion in zwei Schritten abläuft. Somit ist ein kombinierter Reaktionsmechanismus, ähnlich denen anderer Enzyme der HAD Familie, für die Ausübung der Dephosphorylierungsfunktion denkbar. Diese Annahme wird gestützt durch die 3D-Struktur der N-terminalen Domäne, den Ergebnissen dieser Arbeit sowie Resultaten weiterer biochemischer Analysen. Der zweistufige Mechanismus der Dephosphorylierung beinhaltet einen nukleophilen Angriff des Substratphosphors durch das Nukleophil Asp9 (D9) des aktiven Zentrums unter Bildung eines Acylphosphat-Enzym-Zwischenprodukts, gefolgt von der anschließenden Freisetzung des dephosphorylierten Substrats. Im zweiten Schritt erfolgt die Hydrolyse des Enzym-Phosphat-Zwischenprodukts unterstützt durch Asp11 (D11), und die Freisetzung der Phosphatgruppe findet statt. Die anderen untersuchten Aminosäuren sind an der Bindung von Mg 2+ und/oder Substrat beteiligt. rnMit Hilfe dieser Arbeit konnte der katalytischen Mechanismus der sEH Phosphatase weiter aufgeklärt werden und wichtige noch zu untersuchende Fragestellungen, wie die physiologische Rolle der sEH Phosphatase, deren endogene physiologische Substrate und der genaue Funktionsmechanismus als bifunktionelles Enzym (die Kommunikation der zwei katalytischen Einheiten des Enzyms) wurden aufgezeigt und diskutiert.rn

Strukturelle und molekulare Charakterisierung des Asialoglykoprotein-Rezeptors aus humaner Leber

Der Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR) vermittelt als integraler Bestandteil der Leberzellmembran die Endozytose von zirkulierenden Asialoglykoproteinen. Ziele dieser Arbeit waren proteinchemische Untersuchungen von funktionellem ASGPR aus humaner Leber aufgrund einer verbesserten Präparationsmethode und die rekombinante Darstellung der beiden Untereinheiten H1 und H2. In der denaturierenden SDS-PAGE erschienen H1 und H2 überwiegend als Monomere bei 46 und 50kD; nach Deglykosylierung ergaben sich Banden bei 34 und 32kD, wonach der Glykosidanteil etwa 28% beträgt. In der nicht-denaturierenden Größenausschluß-Chromatographie wurden im nativen ASGPR ausschließlich Trimere und Dimere gefunden. In Gegenwart von 2-Mercaptoethanol konnten funktionell eine aktive von einer nicht-aktiven Fraktion getrennt werden, wobei H2 in der nicht-aktiven Fraktion angereichert war, während sich H1 zu etwa gleichen Teilen in beiden Fraktionen befand. Durch zweidimensionale Auftrennung des deglykosylierten Rezeptors wurden auf Proteinebene vier Isoformen von H1 und zwei von H2 mit unterschiedlichen pI-Werten identifiziert. Der Vergleich von funktionellem ASGPR aus normaler Leber und den hepatischen Tumorzellinien HepG2 und Huh7 in der SDS-PAGE brachte Größenunterschiede von etwa sechs und vier Kilodalton hervor. Bei H1 konnte dies auf einen höheren Glykosylierungsgrad zurückgeführt werden, während H2 auch nach Behandlung mit N-GlykosidaseF ein größeres Molekulargewicht aufwies. Ein Antikörper gegen das Insertionspeptid im cytoplasmatischen Bereich einer Splice-Variante von H2 zeigte eine deutlich erhöhte Expression von H2 mit Insertion in Huh7-Zellen gegenüber natürlichem ASGPR. Da bisherige Kenntnisse über den humanen ASGPR vorwiegend aus kultivierten Hepatomzelllinien stammen, scheinen sie nicht ohne weiteres auf die Situation in normaler Leber übertragbar. Die Präparation von funktionellem H1 aus transfizierten cos7- und 293-Zellen führte zum gleichen Bandenmuster wie beim natürlichen ASGPR. Mit einem Enzymimmunoassay wurde die Eignung von rekombinantem H1 zur Detektion von Antikörpern gegen ASGPR in 177 von 178 Patientenseren gezeigt. Da durch Präinkubation mit rekombinantem Antigen die Reaktivität mit natürlichem Rezeptor inhibiert werden konnte, trägt H1 hauptsächlich die antigenen Stellen des ASGPR.

Mikrosomale Biotransformation von Benzo[ghi]perylen, einem mutagenen polyaromatischen Kohlenwasserstoff ohne das Strukturelement der Bay-Region des kanzerogenen Benzo[a]pyrens

Kanzerogene polyaromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs), wie Benzo[a]pyren, besitzen eine Bay-Region mit ortho-kondensiertem Benzoring. Dadurch ist die enzymatische Bildung von Bay-Region-Dihydrodiolepoxiden (Oxiranylring in der sterisch abgeschirmten Molekülbucht) möglich, die als ultimal kanzerogene Metaboliten der PAKs gelten. Diese lösen durch DNA-Modifikation Primärläsionen aus, die, sofern sie nicht enzymatisch repariert werden, bei der DNA-Replikation Fehler verursachen (Mu-tationen). Der Mehrstufenprozeß der Kanzerogenese (Promotion und Progression) führt schließlich zur neoplastischen Entartung der Zelle. Benzo[ghi]perylen (BghiP) repräsentiert eine Gruppe von PAKs, die keine „klassische“ Bay-Region besitzen und daher keine vicinalen Dihydrodiolepoxiden bilden können. Trotzdem ist BghiP mutagen, z. B. in den Stämmen TA98 und TA100 von Salmonella typhimurium (1,3- bzw. 4,3 his+-Revertanten/nmol) nach metabolischer Aktivierung mit der postmitochondrialen Fraktion von Ratten nach Behandlung mit 3-Methylcholanthren. Hemmung der mikrosomalen Epoxidhydrolase (mEH) mit 1,1,1-Trichlor-2-propenoxid (TCPO) steigert die bakterielle Mutagenität von BghiP im Stamm TA98 um das 4-fache, was Arenoxide als ultimale Mutagene wahrscheinlich macht. Dieses Ergebnis wird au-ßerdem durch Untersuchung der DNA-Bindung mit dem Verfahren des 32P-Postlabelings bestätigt (Dr. Fickler, Institut für Toxikologie, Universität Mainz). Danach bildete mikrosomal aktiviertes BghiP drei Addukte (ein Hauptaddukt, zwei Nebenaddukte), die durch Hemmung der mEH mit TCPO verstärkt wurden (das Hauptaddukt um 29%). Um den für die bakterielle Mutagenität von BghiP verantwortlichen Metaboliten zu identifizieren, wurde die mikrosomale Biotransformaton von BghiP aufgeklärt. Umsetzung von BghiP mit Lebermikrosomen von Ratten nach Behandlung mit Aroclor 1254 lieferte 17 mit Ethylacetat extrahierbare Metaboliten. Zwölf dieser Metaboliten konnten durch eine Kombination von chromatographischen, spektroskopi-schen und biochemischen Methoden identifiziert werden. Daraus ergeben sich zwei Biotransformati-onswege: Weg I beginnt mit einem Angriff von Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen an Position 7 und der Bildung des 7-Phenols. Dieses wird dann in das 7,8- bzw. 7,10-Diphenol überführt, die schließlich zu den mehrkernigen Chinonen an der 7,8- bzw. 7,10-Position oxidiert werden. Im Bio-transformationsweg II werden die K-Regionen von BghiP durch Cytochrom P450 funktionalisiert. Zu-nächst entstehen das auf indirektem Weg identifizierte 3,4-Oxid und das 3,4,11,12-Bisoxid, die in mikrosomalen Umsetzungen von BghiP nur nach Hemmung der mEH gebildet werden. Enzymatische Hydrolyse des 3,4-Oxides ergibt das trans-3,4-Dihydrodiol, das zum 3,4-Chinon oxidiert wird. Ebenso entsteht aus dem 3,4,11,12-Bisoxid das trans-3,4-trans-11,12-Bisdihydrodiol, aus dem durch Oxidati-on das trans-3,4-Dihydrodiol-11,12-Chinon hervorgeht. Untersuchung der stereoselektiven enzymati-schen Bildung der K-Region-trans-Di¬hydrodiole ergaben eine präferentielle Entstehung der 3R,4R- bzw. 3R,4R,11R,12R-Enantiomere. Untersuchungen der bakteriellen Mutagenität der Hauptmetaboliten 3,4-Dihydrodiol und dem 7-Phenol machte deutlich, dass beide Biotransformationswege I und II von BghiP zur bakteriellen Mutagenität beitragen. Das 7-Phenol aus Weg I ist ein proximales Mutagen, was auch von Phenolen anderer PAKs bekannt ist. Das 3,4-Dihydrodiol aus Weg II wird so schwach zu Mutagenen aktiviert, dass dem vermutlich gebildete 3,4-Dihydrodiol-11,12-oxid keine große Bedeutung als ultimales Mutagen von BghiP zukommt. Die Bestimmung der direkten mutagenen Aktivität (ohne metabolische Aktivierung) der mutmaßlich ultimal mutagenen Arenoxide von BghiP ergab, dass die des 3,4,11,12-Bisarenoxides sehr gering war (1,3 his+-Revertanten/nmol im Stamm TA98). Das 3,4-Oxid hingegen bewirkte einen deutlichen gentoxischen Effekt in den Stämmen TA98 und TA100 (5,5 bzw. 10 his+-Revertanten/nmol). Dies wurde durch die Bestimmung der DNA-Bindung mit dem 32P-Postlabeling, in dem das 3,4-Oxid für das Hauptaddukt von BghiP verantwortlich gemacht werden konnte, bestätigt. Daher kommt dem 3,4-Oxid als ultimales Mutagen die größte Bedeutung für die Gentoxizität von BghiP zu. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen bei PAKs ohne Bay-Region auf Arenoxide schließen, die eine notwendige Voraussetzung für DNA-Bindung und Mutagenität sind.

Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina

Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Kristallisation und der strukturellen Auswertung der Arbutin-Synthase (AS) und der Strictosidin Glukosidase (SG). Beide Enzyme stammen aus der Medizinalpflanze Rauvolfia serpentina. Für die Kristallisation der Arbutin-Synthase wurden ca. 2500 verschiedene Beding-ungen experimentell untersucht. Für einige dieser Experimente wurde das Enzym molekularbiologisch und chemisch verändert. Trotzdem konnten keine Kristalle erhalten werden. Die bei diesen Veränderungen erhaltenen Ergebnisse wurden anhand von Vergleichen mit Strukturen anderer Glykosyltransferasen der gleichen Familie analysiert. Bei der Reinigung der AS konnte mit verschiedenen Trennsystemen nie eine homogene Lösung produziert werden. Der wahrscheinliche Grund für diese schlechte Isolierbarkeit, und damit der wahrscheinliche Grund für die schwierige Kris-tallisation, liegt in der überdurchschnittlich hohen Anzahl an Cysteinen in der Proteinsequenz. Mit den Aminosäuren Cys171, Cys253 und Cys461 wurden drei Cysteine gefunden, die einem Strukturvergleich nach an der Proteinoberfläche liegen und möglicherweise durch Quervernetzungen mit anderen Proteinmolekülen ein heterogenes Gemisch bilden, das nicht geordnet kristallisieren kann. Durch gezielte Mutationen dieser drei Aminosäuren könnte die Kristallisation zukünftig ermöglicht werden. Für die SG waren bereits Bedingungen bekannt bei denen nicht vermessbare Enzymkristalle (Nadeln) wuchsen. In weit gefächerten Versuchen konnten diese Kristalle jedoch nicht zu 3D-Wachstum angeregt werden. Es wurden mit einem HTS-Screening neue Bedingungen zur Kristallisation gefunden. Anschließend konnten die native Struktur und der Strictosidin/Enzym-Komplex vermessen und aufgeklärt werden. Die SG gehört zur Familie 1 der Glukosidasen (GH-1) und besitzt die in dieser Familie konservierte (beta/alpha)8-Barrel-Faltung. Im Vergleich mit 16 bekannten Glykosidasen der Familie GH-1 wurde die Substratbindung untersucht. Dabei wurde die in der Familie konservierte Zuckerbindung vorgefunden, jedoch große Unterschiede in der Aglykonbindung entdeckt. Es wurden Bedingungen für die Konformationsänderung des Trp388 erkannt. Diese Konformationsänderung dirigiert den Aglykonteil des Substrates auf verschiedene Seiten der Substratbindungstasche und teilt so die Familie GH-1 in zwei Gruppen.

Charakterisierung zentraler Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus Rauvolfia serpentina

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina charakterisiert. Dabei handelt es sich einerseits um die Vomilenin-Reduktase und die 2β-(R)-1.2-Dihydrovomilenin-Reduktase. Es wurden Versuche unternommen, diese Enzyme heterolog zu exprimieren. Eine aktive Expression konnte nicht durchgeführt werden, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf Modifikationen in der Ursprungspflanze zurückzuführen ist. Allerdings bestehen auch Zweifel, ob es sich bei den Volllängenklonen um die cDNAs der Reduktasen handelte. Zum anderen sollte eine Strukturaufklärung der Vinorin-Synthase im Komplex mit Liganden vorgenommen werden. Die erhaltenen Proteinkristalle stellten sich als derart empfindlich gegenüber Schwankungen ihrer Umgebung und dem Eindringen von Liganden in den Kristall dar, dass eine erfolgreiche Komplexierung und strukturelle Beschreibung durch Röntgenstrukturanalyse nicht möglich war. Weiterhin wurden Mutagenesestudien mit der Vinorin-Synthase durchgeführt. Eine Asparaginsäure bildet eine Salzbrücke mit einem Arginin. Alle durchgeführten Mutationen dieser Asparaginsäure führten zu einem absoluten Aktivitätsverlust. Eine Funktion des Asparagins 277, als mitverantwortliche Aminosäure zur Bindung des Co-Substrats Acetyl-CoA, konnte anhand der Mutagenesestudien ausgeschlossen werden. Weiterhin ist es erstmals gelungen die Polyneuridinaldehyd-Esterase aus Rauvolfia serpentina zu kristallisieren. Schließlich konnte die dreidimensionale Struktur der Polyneuridinaldehyd-Esterase aufgeklärt werden. Es folgte eine Beschreibung struktureller Eigenschaften der Polyneuridinaldehyd-Esterase im Vergleich zu einem Modell, welches durch ein „Molecular Modelling“ erstellt wurde.

Synthese von Sialyl-Lewis-X-Mimetika durch stereoselektive ortho-C-Glycosylierung von Phenolen

Ziel der Arbeit war es, Sialyl-LewisX-Mimetika auf Basis ortho-C-glycosylierter Phenole als Inhibitoren für die Selektin-Ligand-Wechselwirkungen zu synthetisieren. Dazu wurde zunächst die Stereoselektivität der ortho-C-Mannosylierung untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass bei der Umsetzung von Phenolen mit dem benzylgeschützten Mannosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf selektiv das β-C-Mannosid erhalten wurde. Gleichzeitig konnte anhand der NMR-spektroskopischen Untersuchungen nachgewiesen werden, dass die in der Literatur beschriebenen α-C-Mannoside von Phenolen tatsächlich β-konfiguriert sind. Wenn Naphthole als Glycosylakzeptoren verwendet wurden, konnten durch Modifikation des Promotors auch die für die Synthese der Mimetika benötigten α-C-Mannoside erhalten werden, wobei ZnCl2 als Promotor die besten Ergebnisse lieferte. Allerdings zeigten die synthetisierten α-C-Mannoside und α-C-Galactoside eine Inversion des Pyranoseringes und lagen in der ungewöhnlichen 1C4-Konformation vor.rnAnschließend konnte auf diese Weise das durch Docking-Studien gefundene Mimetikum (2S)-3-Cyclohexyl-2-[7-hydroxy-8-(α-D-mannosyl)naphthalin-2-yloxy]propionsäure syntheti-siert werden. Es besaß jedoch in Zelladhäsionstests keine ausreichende Aktivität bei der Inhibierung der Selektin-Ligand-Wechselwirkung. Bei den ursprünglichen Dockingstudien war allerdings von der gewohnten 4C1-Konformation ausgegangen worden. Spätere NMR-Experimente und DFT-Berechnungen zeigten, dass das Mimetikum tatsächlich in der 1C4-Konformation vorlag und es deshalb nicht aktiv war. Die synthetisierten Stereo- und Regioisomere zeigten in Zelladhäsionstests ebenfalls keine Aktivität.rnVersuche, die α-1-C-Mannosylnaphthole zu den benötigten 1-C-2-O-Diglycosyl-naphthalinen umzusetzen waren nicht erfolgreich, da die phenolische OH-Gruppe sterisch zu sehr abgeschirmt war, um unter milden Reaktionsbedingungen glycosyliert zu werden, bzw. die α-1-C-Mannosylnaphthaline unter drastischeren Reaktionsbedingungen nicht stabil waren. Daher wurde 1-(2′,3′,4′,6′-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-2-naphthol mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf zum ersten synthetischen 1-C-2-O-Diglycosyl-phenol umgesetzt. Nach Abspaltung der Schutzgruppen sollte das erhaltene 1-Galactosyl-2-O-mannosyl-naphthalin enzymatisch zum Sialyl-LewisX-Mimetikum verlängert werden. Es wurde vom Enzym jedoch nicht als Substrat erkannt. Versuche zur chemischen Anbindung des Säurebausteins stehen noch aus.rn

Diglycosylierte Heterocyclen als potentielle Selektinliganden

In der vorliegenden Arbeit sollten diglycosylierte Heterozyklen als Grundbausteine zur Darstellung eines Mimetikums des Tetrasaccharids Sialyl LewisX verwendet werden. Dabei standen die pharmakokinetische Stabilität sowie der möglichst einfache Zugang zu den Strukturen im Vordergrund. Außerdem sollte die nachträgliche Anbindung an eine ESL-1 Partialsequenz zum Aufbau von Glycopeptiden und deren Verknüpfung zu dendrimeren Strukturen möglich sein. rnIn einem ersten Ansatz sollten C,N-diglycosylierte Isoindolone bzw. Isochinolone aufgebaut werden. Es konnte anhand mehrerer Beispiele gezeigt werden, dass die elektrophile Cyclisierung von o-Alkinylbenzamiden mit Iod nicht die wie in der Literatur beschriebenen Lactame liefert, sondern ein Angriff des Carbonylsauerstoffs zu den entsprechenden Isobenzofuran-1(3H)-iminen bzw. 1H-Isochromen-1-iminen führt. Die Lactame können jedoch durch Reaktion der o-Alkinylbenzamide mit Tetrabutylammoniumfluorid erhalten werden.rnDie zweite Route führte durch 1,3-dipolare Cycloaddition zu 1,4 disubstituierten 1,2,3-Triazolen. Hier gelang der Aufbau eines vollständig deblockierten, mit einem Azid funktionalisierten Trisaccharid Analogons, welches durch enzymatische Sialylierung zum Sialyl LewisX Mimetikum verlängert wurde. Diese Struktur konnte in einer weiteren 1,3-dipolaren Cycloaddition mit einer ebenfalls synthetisierten, leicht abgewandelten Partialsequenz des ESL-1 zu einem Glycokonjugat umgesetzt werden. Des Weiteren gelang der Aufbau zweier teilweise deblockierter Tetrasaccharid Mimetika, wiederum durch enzymatische Elongation.rnAußerdem wurden Versuche unternommen di C-Glycoside durch samariumvermittelte Kupplung zu synthetisieren.rn

Synthesen von C-glycosylierten Aminosäuren und Peptiden unter Einsatz speziell konstruierter Mikroreaktoren

Die chemische Synthese definierter Glycopeptidstrukturen bildet die Basis einiger vielversprechender Ansätze zur Therapie verschiedener Krankheiten. Die Entwicklung hochaffiner Selektininhibitoren könnte der Behandlung chronischer Entzündungen und zur Unterdrückung der Metastasierung von Tumoren dienen. Vollsynthetische Vakzine auf Basis glycosylierter MUC1-Partialstrukturen sollen das Immunsystem zur Bekämpfung von krankem Gewebe anregen und so perspektivisch eine Impfung gegen Krebs ermöglichen. Da die natürlich vorkommenden O-Glycoside in vivo eine begrenzte Stabilität besitzen, wurde eine Methode entwickelt, welche die modulare Herstellung von stabilen rnC-Glycosylaminosäuren als Mimetika der natürlichen Serin-, Threonin- und Tyrosin-Glycoside ermöglicht. Dazu wurden passend geschützte Kohlenhydrat-Lactone synthetisiert, die in einer mikrowellengestützten Petasis-Olefinierung unter Durchflussbedingungen in die entsprechenden exo-Glycale überführt wurden. Die Reaktionszeit konnte durch diese spezielle Reaktionsführung auf weniger als drei Minuten verringert werden, während konventionell mehrere Stunden benötigt werden. Die C-glycosidische Verknüpfung mit den entsprechenden Aminosäurebausteinen gelang durch eine Hydroborierungs-Suzuki-Kupplungs-Kaskade. Nach umfangreicher Optimierung der Reaktionsparameter ließ sich neben mehreren Monosacchariden auch ein exo-Glycal der Lactose erfolgreich in der Kupplung einsetzen. Nach verschiedenen Schutzgruppenmanipulationen wurden einige der synthetisierten Bausteine zur Synthese C-glycosylierter Partialstrukturen des Mucins MUC1 an der festen Phase herangezogen. In ELISA-Experimenten wurden die C-Glycosylpeptide von an Brustkrebsgewebe bindenden Antikörpern erkannt, die durch Vakzinierung mit ähnlichen Strukturen erhalten worden waren. Zur Synthese zweier Bausteine potenzieller Selektin-Inhibitoren wurde ein Mimetikum des in natürlichen Liganden vorkommenden Tetrasaccharides Sialyl-Lewisx synthetisiert. Bei diesem wurde die terminale Sialinsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die bei der gewählten Syntheseroute notwendige regioselektive Öffnung eines Benzylidenacetals wurde in einem Mikroreaktor durchgeführt, wodurch eine einfache Reaktionsoptimierung mit geringen Substanzmengen möglich war. Die Reaktionszeit liegt mit unter 4 Minuten deutlich unter den üblichen Werten von einer bis mehreren Stunden. In einer Block-Glycosylierung konnte das Pseudotetrasaccharid sowohl an einen C-Lactosyl-Tyrosin-, als auch an einen C-Lactosyl-Serin-Akzeptor angefügt und somit die Synthese der Zielverbindungen abgeschlossen werden. Diese Bausteine können in Zukunft als Bestandteile synthetischer Glycopeptide zum Einsatz kommen, welche Mimetika der natürlichen Selektin-Liganden darstellen sollen.rn

Synthese C-glycosidischer und N-methylierter Glycosylaminosäuren für den Aufbau von Mimetika tumorassoziierter MUC1-Glycopeptidantigene unter Verwendung mikrostrukturierter Reaktoren

Zur Synthese hydrolysestabiler MUC1-Antitumorvakzine wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst ein Verfahren zur effizienten N Methylierung von Fmoc-Aminosäuren entwickelt. Die Synthese erfolgte in einer zweistufigen Umsetzung über Oxazolidinone unter Verwendung eines Tube-in-Tube-Durchflussreaktors mit einer semipermeablen Membran aus Teflon® AF 2400. In diesem Tube-in-Tube-Reaktor wurde in der ersten Stufe das Modellsubstrat Fmoc-Alanin bereits nach 2 h annähernd quantitativ in das entsprechende Oxazolidinon umgesetzt. In der zweiten Stufe wurde mit TFA erstmals eine Flüssigkeit durch eine solche Membran des Tube-in-Tube-Reaktors eingeleitet und lieferte innerhalb einer Stunde zahlreiche aliphatische, aromatische und funktionalisierte N-Methylaminosäuren in hohen Ausbeuten.rnDes Weiteren wurden erstmals sensible Glycosylaminosäuren, darunter auch TN Antigen-Strukturen, N-methyliert. Sie dienen als Bausteine für die Synthese von MUC1-Antitumorvakzinen. Neben Fmoc-N-Methyl-TN-Threonin konnten die Fmoc-geschützten N-Methyl-TN-Serin, N-Methyl-Sialyl-TN-Threonin sowie zwei N-Methyl-C Glycosylaminosäuren und in guten Ausbeuten erhalten werden. Anschließend wurde das N methylierte TN-Threonin gezielt in die tandem repeat-Sequenz des MUC1 in einer Festphasenpeptidsynthese eingebaut. Um einen direkten Vergleich bezüglich der N Methylierung im MUC1-Glycopeptide und dem darauf folgenden Einfluss auf die Tumorselektivität der resultierenden Vakzine erhalten zu können, wurde zudem ein Referenzpeptid aufgebaut. Zur Vollendung der Vakzinsynthese erfolgte die Konjugation beider Glycopeptidantigene an die jeweiligen BSA- und TTox-Proteine. rnEin alternativer Zugang zu hydrolysestabilen Glycopeptidbausteinen wurde im letzten Teil der Arbeit über die Synthese von α C Glycosylaminosäuren erarbeitet. Der entwickelte Syntheseweg basiert auf einer Ugi-Vier-Komponenten-Reaktion aus Aldehyd, Amin, Nitril und Carbonsäure. Als benötigte Aldehydkomponenten wurden ein einfaches Galactose- sowie ein Galactosamin-Derivat verwendet. Zum Aufbau des C-glycosidischen Grundgerüsts wurde eine Mikrowellen-unterstützte C-Allylierungsvariante im Durchfluss realisiert. Die Galactose- und Galactosaminaldehyde wurden danach mit chirale Glycosylaminen umgesetzt.

Veränderungen der DNA-Methylierung in Patienten mit AHCY-Defizienz

Die S-adenosyl-L-Homocysteinhydrolase (AHCY)-Defizienz ist eine seltene autosomal rezessive Erbkrankheit, bei der Mutationen im AHCY-Gen die Funktionsfähigkeit des kodierten Enzyms beeinträchtigen. Diese Krankheit führt zu Symptomen wie Entwicklungsverzögerungen, mentaler Retardierung und Myopathie. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der AHCY-Defizienz auf die Methylierung der DNA in Blutproben und Fibroblasten von Patienten mit AHCY-Defizienz, sowie in HEK293- und HepG2-Zelllinien mit AHCY-Knockdown untersucht. Der gesamtgenomische Methylierungsstatus wurde mit Hilfe des MethylFlash ™ Methylated DNA Quantification Kit (Epigentek) bei drei Patienten-Blutproben festgestellt. In den Blutproben von sieben Patienten und Fibroblasten von einem Patienten wurde die Methylierung von DMRs sieben geprägter Gene (GTL2, H19, LIT1, MEST, NESPAS, PEG3, SNRPN) und zwei repetitiver Elemente (Alu, LINE1) mittels Bisulfit-Pyrosequenzierung quantifiziert und durch High Resolution Melting-Analyse bestätigt. Zusätzlich wurde eine genomweite Methylierungsanalyse mit dem Infinium® HumanMethylation450 BeadChip (Illumina) für vier Patientenproben durchgeführt und die Expression von AHCY in Fibroblasten mittels Expressions-qPCR und QUASEP-Analyse untersucht. Die Methylierungsanalysen ergaben eine Hypermethylierung der gesamtgenomischen DNA und stochastische Hypermethylierungen von DMRs geprägter Gene bei einigen Patienten. Die HEK293- und HepG2-Zelllinien wiesen dagegen hauptsächlich stochastische Hypomethylierungen an einigen DMRs geprägter Gene und LINE1-Elementen auf. Die genomweite Methylierungsarray-Analyse konnte die Ergebnisse der Bisulfit-Pyrosequenzierung nicht bestätigen. Die Expressionsanalysen der AHCY-defizienten Fibroblasten zeigten eine verminderte Expression von AHCY, wobei beide Allele etwa gleich stark transkribiert wurden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AHCY-Defizienz eine gute Modellerkrankung für die Untersuchung biologischer Konsequenzen von Methylierungsstörungen im Rahmen der Epigenetik-Forschung sein könnte. Sie ist unseres Wissens die erste monogene Erkrankung mit symptomaler DNA-Hypermethylierung beim Menschen.