Strukturelle und molekulare Charakterisierung des Asialoglykoprotein-Rezeptors aus humaner Leber

Der Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR) vermittelt als integraler Bestandteil der Leberzellmembran die Endozytose von zirkulierenden Asialoglykoproteinen. Ziele dieser Arbeit waren proteinchemische Untersuchungen von funktionellem ASGPR aus humaner Leber aufgrund einer verbesserten Präparationsmethode und die rekombinante Darstellung der beiden Untereinheiten H1 und H2. In der denaturierenden SDS-PAGE erschienen H1 und H2 überwiegend als Monomere bei 46 und 50kD; nach Deglykosylierung ergaben sich Banden bei 34 und 32kD, wonach der Glykosidanteil etwa 28% beträgt. In der nicht-denaturierenden Größenausschluß-Chromatographie wurden im nativen ASGPR ausschließlich Trimere und Dimere gefunden. In Gegenwart von 2-Mercaptoethanol konnten funktionell eine aktive von einer nicht-aktiven Fraktion getrennt werden, wobei H2 in der nicht-aktiven Fraktion angereichert war, während sich H1 zu etwa gleichen Teilen in beiden Fraktionen befand. Durch zweidimensionale Auftrennung des deglykosylierten Rezeptors wurden auf Proteinebene vier Isoformen von H1 und zwei von H2 mit unterschiedlichen pI-Werten identifiziert. Der Vergleich von funktionellem ASGPR aus normaler Leber und den hepatischen Tumorzellinien HepG2 und Huh7 in der SDS-PAGE brachte Größenunterschiede von etwa sechs und vier Kilodalton hervor. Bei H1 konnte dies auf einen höheren Glykosylierungsgrad zurückgeführt werden, während H2 auch nach Behandlung mit N-GlykosidaseF ein größeres Molekulargewicht aufwies. Ein Antikörper gegen das Insertionspeptid im cytoplasmatischen Bereich einer Splice-Variante von H2 zeigte eine deutlich erhöhte Expression von H2 mit Insertion in Huh7-Zellen gegenüber natürlichem ASGPR. Da bisherige Kenntnisse über den humanen ASGPR vorwiegend aus kultivierten Hepatomzelllinien stammen, scheinen sie nicht ohne weiteres auf die Situation in normaler Leber übertragbar. Die Präparation von funktionellem H1 aus transfizierten cos7- und 293-Zellen führte zum gleichen Bandenmuster wie beim natürlichen ASGPR. Mit einem Enzymimmunoassay wurde die Eignung von rekombinantem H1 zur Detektion von Antikörpern gegen ASGPR in 177 von 178 Patientenseren gezeigt. Da durch Präinkubation mit rekombinantem Antigen die Reaktivität mit natürlichem Rezeptor inhibiert werden konnte, trägt H1 hauptsächlich die antigenen Stellen des ASGPR.

The asialoglycoprotein-receptor (asgpr) mediates the endocytosis of circulating asialoglycoproteins as an integral part of the liver-cell membrane. Aims of this study were proteinchemical experiments of functional asgpr based on an improved preparation-method and recombinant expression of the subunits H1 and H2. In denaturing SDS-PAGE H1 and H2 appeared predominantly as monomers at 46 and 50kD, after deglycosylation bands at 34 and 32kD were observed giving a glycoside-content of about 28%. By non-denaturing size-exclusion chromatography in native asgpr exclusively trimers and dimers were found. In the presence of 2-mercaptoethanol a functionally active from a non-active fraction could be separated, showing H2 enriched in the non-active fraction, while H1 was divided with nearly equal parts in both fractions. After two-dimensional separation of deglycosylated receptor four isoforms of H1 and two of H2 with different pI-values were identified on the protein-level. The comparison of functional asgpr from normal liver and the hepatic tumor cell-lines HepG2 and Huh7 in SDS-PAGE brought out differences in size of about six and four kilodaltons. Concerning H1 this was due to a higher degree of glycosylation whereas H2 after treatment with N-glycosidaseF still showed a higher molecular weight. An antibody against the insertion-peptide in the cytoplasmic area of a splice-variant of H2 revealed a markly increased expression of H2 with insertion in Huh7-cells compared to natural asgpr. Since findings of the human asgpr were grounded preponderantly on cultured hepatoma cell-lines, these could not be transferred readily to the situation in normal liver. The preparation of functional H1 from transfected cos7- and 293-cells gave the same band-pattern as natural asgpr. By an enzymeimmunoassay the suitability of recombinant H1 for detection of antibodies against asgpr in 177 of 178 patients-sera was worked out. Since the reactivity with natural receptor could be inhibited by preincubation with recombinant antigen, H1 mainly carries the antigenic sites of the asgpr.