Der Carrier DcuB als zweiter Sensor des Zweikomponentensystems DcuSR in Escherichia coli

Escherichia coli kann C4-Dicarboxylate und andere Carbonsäuren als Substrate für den aeroben und anaeroben Stoffwechsel nutzen. Die Anwesenheit von C4-Dicarboxylaten im Außenmedium wird über das Zweikomponentensystem DcuSR, bestehend aus der membranständigen Sensorkinase DcuS und dem cytoplasmatischen Responseregulator DcuR, erkannt. Die Bindung von C4-Dicarboxylaten an die periplasmatische Domäne von DcuS führt zu einer Induktion der Zielgene. Hierzu zählen die Gene für den anaeroben Fumarat/Succinat-Antiporter DcuB (dcuB), die anaerobe Fumarase (fumB) und die Fumaratreduktase (frdABCD). Unter aeroben Bedingungen stimuliert DcuSR die Expression des dctA Gens, das für den aeroben C4-Dicarboxylat-Carrier DctA kodiert. Für den Carrier DcuB konnte eine regulatorische Funktion bei der Expression der DcuSR-regulierten Gene gezeigt werden. Die Inaktivierung des dcuB Gens führte bereits ohne Fumarat zu einer maximalen Expression einer dcuB´-´lacZ Reportergenfusion und anderer DcuSR-abhängiger Gene. Diese Stimulierung erfolgte nur in einem dcuS-positiven Hintergrund. DcuB unterscheidet sich damit von den alternativen Carriern DcuA und DcuC, die diesen Effekt nicht zeigten. Mithilfe ungerichteter Mutagenese wurden DcuB-Punktmutanten hergestellt (Thr394Ile und Asp398Asn), die eine Geninduktion verursachten, aber eine intakte Transportfunktion besaßen. Dies zeigt, dass der regulatorische Effekt von DcuB unabhängig von dessen Transportfunktion ist. Durch gerichtete Mutagenese wurde die Funktion einer Punktmutation (Thr394) näher charakterisiert. Es werden zwei Modelle zur Membrantopologie von DcuB und der Lage der Punktmutationen im Protein vorgestellt. Da DcuB seine regulatorische Funktion über eine Interaktion mit DcuS vermitteln könnte, wurden mögliche Wechselwirkungen zwischen DcuB und DcuS als auch DcuR mithilfe von Two-Hybrid-Systemen untersucht. Für biochemische Untersuchungen von DcuB wurde außerdem die Expression des Proteins in vivo und in vitro versucht. Unter aeroben Bedingungen beeinflusst der C4-Dicarboxylat-Carrier DctA die Expression der DcuSR-abhängigen Gene. Eine Mutation des dctA Gens bewirkte eine stärkere Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion im Vergleich zum Wildtyp. Diese Expression nahm in einem dcuS-negativen Hintergrund ab, die Succinat-abhängige Induktion blieb jedoch erhalten. Unter anaeroben Bedingungen kann das dctA Gen auch durch Inaktivierung von DcuB induziert werden. Es wird ein Modell vorgestellt, das die Beteiligung beider Carrier an der DcuSR-abhängigen Regulation erklärt.

Surface-plasmon optical and electrochemical characterization of biofunctional surface architectures

The development and characterization of biomolecule sensor formats based on the optical technique Surface Plasmon Resonance (SPR) Spectroscopy and electrochemical methods were investigated. The study can be divided into two parts of different scope. In the first part new novel detection schemes for labeled targets were developed on the basis of the investigations in Surface-plamon Field Enhanced Spectroscopy (SPFS). The first one is SPR fluorescence imaging formats, Surface-plamon Field Enhanced Fluorescence Microscopy (SPFM). Patterned self assembled monolayers (SAMs) were prepared and used to direct the spatial distribution of biomolecules immobilized on surfaces. Here the patterned monolayers would serve as molecular templates to secure different biomolecules to known locations on a surface. The binding processed of labeled target biomolecules from solution to sensor surface were visually and kinetically recorded by the fluorescence microscope, in which fluorescence was excited by the evanescent field of propagating plasmon surface polaritons. The second format which also originates from SPFS technique, Surface-plamon Field Enhanced Fluorescence Spectrometry (SPFSm), concerns the coupling of a fluorometry to normal SPR setup. A spectrograph mounted in place of photomultiplier or microscope can provide the information of fluorescence spectrum as well as fluorescence intensity. This study also firstly demonstrated the analytical combination of surface plasmon enhanced fluorescence detection with analyte tagged by semiconducting nano- crystals (QDs). Electrochemically addressable fabrication of DNA biosensor arrays in aqueous environment was also developed. An electrochemical method was introduced for the directed in-situ assembly of various specific oligonucleotide catcher probes onto different sensing elements of a multi-electrode array in the aqueous environment of a flow cell. Surface plasmon microscopy (SPM) is utilized for the on-line recording of the various functionalization steps. Hybridization reactions between targets from solution to the different surface-bound complementary probes are monitored by surface-plasmon field-enhanced fluorescence microscopy (SPFM) using targets that are either labeled with organic dyes or with semiconducting quantum dots for color-multiplexing. This study provides a new approach for the fabrication of (small) DNA arrays and the recording and quantitative evaluation of parallel hybridization reactions. In the second part of this work, the ideas of combining the SP optical and electrochemical characterization were extended to tethered bilayer lipid membrane (tBLM) format. Tethered bilayer lipid membranes provide a versatile model platform for the study of many membrane related processes. The thiolipids were firstly self-assembled on ultraflat gold substrates. Fusion of the monolayers with small unilamellar vesicles (SUVs) formed the distal layer and the membranes thus obtained have the sealing properties comparable to those of natural membranes. The fusion could be monitored optically by SPR as an increase in reflectivity (thickness) upon formation of the outer leaflet of the bilayer. With EIS, a drop in capacitance and a steady increase in resistance could be observed leading to a tightly sealing membrane with low leakage currents. The assembly of tBLMs and the subsequent incorporation of membrane proteins were investigated with respect to their potential use as a biosensing system. In the case of valinomycin the potassium transport mediated by the ion carrier could be shown by a decrease in resistance upon increasing potassium concentration. Potential mediation of membrane pores could be shown for the ion channel forming peptide alamethicin (Alm). It was shown that at high positive dc bias (cis negative) Alm channels stay at relatively low conductance levels and show higher permeability to potassium than to tetramethylammonium. The addition of inhibitor amiloride can partially block the Alm channels and results in increase of membrane resistance. tBLMs are robust and versatile model membrane architectures that can mimic certain properties of biological membranes. tBLMs with incorporated lipopolysaccharide (LPS) and lipid A mimicking bacteria membranes were used to probe the interactions of antibodies against LPS and to investigate the binding and incorporation of the small antimicrobial peptide V4. The influence of membrane composition and charge on the behavior of V4 was also probed. This study displays the possibility of using tBLM platform to record and valuate the efficiency or potency of numerous synthesized antimicrobial peptides as potential drug candidates.

Evaporation of sessile microdrops studied with microcantilevers

The aim of this work is to investigate the evaporation dynamics of water microdrops deposited on atomic force microscope cantilevers, which were employed as sensitive stress, mass and temperature sensors with high time resolution. The technique has some advantages with respect to video-microscope imaging and ultra-precision weighting with electronic microbalances or quartz crystal microbalances, since it allows to measure more drop parameters simultaneously for smaller drop sizes. On hydrophobic surfaces a single measurement with a silicon cantilever provides data for the drop mass, contact angle and radius until very close to complete evaporation. On hydrophilic surfaces, it is as well possible to measure drop mass and inclination of the cantilever. The technique further allows to detect differences between water microdrops evaporating from clean hydrophilic and hydrophobic surfaces. On hydrophilic surfaces the cantilever inclination is negative at the end of the evaporation process. Negative inclination mostly occurs when drops are pinned. This effect can not be detected with any of the other well-established methods. The evidence arises that on the hydrophilic surface a thin water film forms, while this is not the case for the hydrophobic surface. Metal coated cantilevers can be used as thermometers, and allow to precisely measure the temperature of an evaporating microdrop. This can be relevant for further applications of cantilevers as calorimetric sensors for chemical reactions taking place in drops on their surface. The applicability of Young’s equation was verified for microdrops. It was shown that Young’s equation can not be applied to microscopic drops due to their fast evaporation. A study on evaporation of microdrops in saturated vapor atmosphere was performed to estimate evaporation times and compare them with a theory developed, which relates the initial drop volume with the overall evaporation time.

Functional polymer coatings — My-Patterning and My-Analysis

In dieser Arbeit werden Strukturen beschrieben, die mit Polymeren auf Oberflächen erzeugt wurden. Die Anwendungen reichen von PMMA und PNIPAM Polymerbürsten, über die Restrukturierung von Polystyrol durch Lösemittel bis zu 3D-Strukturen, die aus PAH/ PSS Polyelektrolytmultischichten bestehen. Im ersten Teil werden Polymethylmethacrylat (PMMA) Bürsten in der ionischen Flüssigkeit 1-Butyl-3-Methylimidazolium Hexafluorophospat ([Bmim][PF6]) durch kontrollierte radikalische Polymerisation (ATRP) hergestellt. Kinetische Untersuchungen zeigten ein lineares und dichtes Bürstenwachstum mit einer Wachstumsrate von 4600 g/mol pro nm. Die durchschnittliche Pfropfdichte betrug 0.36 µmol/m2. Als Anwendung wurden Mikrotropfen bestehend aus der ionischen Flüssigkeit, Dimethylformamid und dem ATRP-Katalysator benutzt, um in einer definierten Geometrie Polymerbürsten auf Silizium aufzubringen. Auf diese Weise lässt sich eine bis zu 13 nm dicke Beschichtung erzeugen. Dieses Konzept ist durch die Verdampfung des Monomers Methylmethacrylat (MMA) limitiert. Aus einem 1 µl großen Tropfen aus ionischer Flüssigkeit und MMA (1:1) verdampft MMA innerhalb von 100 s. Daher wurde das Monomer sequentiell zugegeben. Der zweite Teil konzentriert sich auf die Strukturierung von Oberflächen mit Hilfe einer neuen Methode: Tintendruck. Ein piezoelektrisch betriebenes „Drop-on-Demand“ Drucksystem wurde verwendet, um Polystyrol mit 0,4 nl Tropfen aus Toluol zu strukturieren. Die auf diese Art und Weise gebildeten Mikrokrater können Anwendung als Mikrolinsen finden. Die Brennweite der Mikrolinsen kann über die Anzahl an Tropfen, die für die Strukturierung verwendet werden, eingestellt werden. Theoretisch und experimentell wurde die Brennweite im Bereich von 4,5 mm bis 0,21 mm ermittelt. Der zweite Strukturierungsprozess nutzt die Polyelektrolyte Polyvinylamin-Hydrochlorid (PAH) und Polystyrolsulfonat (PSS), um 3D-Strukturen wie z.B. Linien, Schachbretter, Ringe, Stapel mit einer Schicht für Schicht Methode herzustellen. Die Schichtdicke für eine Doppelschicht (DS) liegt im Bereich von 0.6 bis 1.1 nm, wenn NaCl als Elektrolyt mit einer Konzentration von 0,5 mol/l eingesetzt wird. Die Breite der Strukturen beträgt im Mittel 230 µm. Der Prozess wurde erweitert, um Nanomechanische Cantilever Sensoren (NCS) zu beschichten. Auf einem Array bestehend aus acht Cantilevern wurden je zwei Cantilever mit fünf Doppelschichten PAH/ PSS und je zwei Cantilever mit zehn Doppelschichten PAH/ PSS schnell und reproduzierbar beschichtet. Die Massenänderung für die individuellen Cantilever war 0,55 ng für fünf Doppelschichten und 1,08 ng für zehn Doppelschichten. Der daraus resultierende Sensor wurde einer Umgebung mit definierter Luftfeuchtigkeit ausgesetzt. Die Cantilever verbiegen sich durch die Ausdehnung der Beschichtung, da Wasser in das Polymer diffundiert. Eine maximale Verbiegung von 442 nm bei 80% Luftfeuchtigkeit wurde für die mit zehn Doppelschichten beschichteten Cantilever gefunden. Dies entspricht einer Wasseraufnahme von 35%. Zusätzlich konnte aus den Verbiegungsdaten geschlossen werden, dass die Elastizität der Polyelektrolytmultischichten zunimmt, wenn das Polymer gequollen ist. Das thermische Verhalten in Wasser wurde im nächsten Teil an nanomechanischen Cantilever Sensoren, die mit Poly(N-isopropylacrylamid)bürsten (PNIPAM) und plasmapolymerisiertem N,N-Diethylacrylamid beschichtet waren, untersucht. Die Verbiegung des Cantilevers zeigte zwei Bereiche: Bei Temperaturen kleiner der niedrigsten kritischen Temperatur (LCST) ist die Verbiegung durch die Dehydration der Polymerschicht dominiert und bei Temperaturen größer der niedrigsten kritischen Temperatur (LCST) reagiert der Cantilever Sensor überwiegend auf Relaxationsprozesse innerhalb der kollabierten Polymerschicht. Es wurde gefunden, dass das Minimum in der differentiellen Verbiegung mit der niedrigsten kritischen Temperatur von 32°C und 44°C der ausgewählten Polymeren übereinstimmt. Im letzten Teil der Arbeit wurden µ-Reflektivitäts- und µ-GISAXS Experimente eingeführt als neue Methoden, um mikrostrukturierte Proben wie NCS oder PEM Linien mit Röntgenstreuung zu untersuchen. Die Dicke von jedem individuell mit PMMA Bürsten beschichtetem NCS ist im Bereich von 32,9 bis 35,2 nm, was mit Hilfe von µ-Reflektivitätsmessungen bestimmt wurde. Dieses Ergebnis kann mit abbildender Ellipsometrie als komplementäre Methode mit einer maximalen Abweichung von 7% bestätigt werden. Als zweites Beispiel wurde eine gedruckte Polyelektrolytmultischicht aus PAH/PSS untersucht. Die Herstellungsprozedur wurde so modifiziert, dass Goldnanopartikel in die Schichtstruktur eingebracht wurden. Durch Auswertung eines µ-GISAXS Experiments konnte der Einbau der Partikel identifiziert werden. Durch eine Anpassung mit einem Unified Fit Modell wurde herausgefunden, dass die Partikel nicht agglomeriert sind und von einer Polymermatrix umgeben sind.

Oligomerisation, localisation and interaction of the sensor histidine kinases DcuS and CitA in Escherichia coli

The two-component system DcuSR of Escherichia coli regulates gene expression of anaerobic fumarate respiration and aerobic C4-dicarboxylate uptake. C4-dicarboxylates and citrate are perceived by the periplasmic domain of the membrane-integral sensor histidine kinase DcuS. The signal is transduced across the membrane by phosphorylation of DcuS and of the response regulator DcuR, resulting in activation of DcuR and transcription of the target genes.rnIn this work, the oligomerisation of full-length DcuS was studied in vivo and in vitro. DcuS was genetically fused to derivatives of the green fluorescent protein (GFP), enabling fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements to detect protein-protein interactions in vivo. FRET measurements were also performed with purified His6-DcuS after labelling with fluorescent dyes and reconstitution into liposomes to study oligomerisation of DcuS in vitro. In vitro and in vivo fluorescence resonance energy transfer showed the presence of oligomeric DcuS in the membrane, which was independent of the presence of effector. Chemical crosslinking experiments allowed clear-cut evaluation of the oligomeric state of DcuS. The results showed that detergent-solubilised His6-DcuS was mainly monomeric and demonstrated the presence of tetrameric DcuS in proteoliposomes and in bacterial membranes.rnThe sensor histidine kinase CitA is part of the two-component system CitAB of E. coli, which is structurally related to DcuSR. CitAB regulates gene expression of citrate fermentation in response to external citrate. The sensor kinases DcuS and CitA were fused with an enhanced variant of the yellow fluorescent protein (YFP) and expressed in E. coli under the control of an arabinose-inducible promoter. The subcellular localisation of DcuS-YFP and CitA-YFP within the cell membrane was studied by means of confocal laser fluorescence microscopy. Both fusion proteins were found to accumulate at the cell poles. The polar accumulation was slightly increased in the presence of the stimulus fumarate or citrate, respectively, but independent of the expression level of the fusion proteins. Cell fractionation demonstrated that polar accumulation was not related to inclusion bodies formation. The degree of polar localisation of DcuS-YFP was similar to that of the well-characterised methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs), but independent of their presence. To enable further investigations on the function of the polar localisation of DcuS under physiological conditions, the sensor kinase was genetically fused to the flavin-based fluorescent protein Bs2 which shows fluorescence under aerobic and anaerobic conditions. The resulting dcuS-bs2 gene fusion was inserted into the chromosome of various E. coli strains.rnFurthermore, a protein-protein interaction between the related sensor histidine kinases DcuS and CitA, regulating common metabolic pathways, was detected via expression studies under anaerobic conditions in the presence of citrate and by in vivo FRET measurements.

Entwicklung und Charakterisierung eines Drop-on-Demand-Aerosolgenerators für die Probenzuführung kleinster Flüssigkeitsmengen in der analytischen Atomspektroskopie

Die pneumatische Zerstäubung ist die häufigste Methode der Probenzuführung von Flüssigkeiten in der Plasmaspektrometrie. Trotz der bekannten Limitierungen dieser Systeme, wie die hohen Probenverluste, finden diese Zerstäuber aufgrund ihrer guten Robustheit eine breite Anwendung. Die flussratenabhängige Aerosolcharakteristik und pumpenbasierte Signalschwankungen limitieren bisher Weiterentwicklungen. Diese Probleme werden umso gravierender, je weiter die notwendige Miniaturisierung dieser Systeme fortschreitet. Der neuartige Ansatz dieser Arbeit basiert auf dem Einsatz modifizierter Inkjet-Druckerpatronen für die Dosierung von pL-Tropfen. Ein selbst entwickelter Mikrokontroller ermöglicht den Betrieb von matrixkodierten Patronen des Typs HP45 mit vollem Zugriff auf alle essentiellen Betriebsparameter. Durch die neuartige Aerosoltransportkammer gelang die effiziente Kopplung des Tropfenerzeugungssystems an ein ICP-MS. Das so aufgebaute drop-on-demand-System (DOD) zeigt im Vergleich zu herkömmlichen und miniaturisierten Zerstäubern eine deutlich gesteigerte Empfindlichkeit (8 - 18x, elementabhängig) bei leicht erhöhtem, aber im Grunde vergleichbarem Signalrauschen. Darüber hinaus ist die Flexibilität durch die große Zahl an Freiheitsgraden des Systems überragend. So ist die Flussrate über einen großen Bereich variabel (5 nL - 12,5 µL min-1), ohne dabei die primäre Aerosolcharakteristik zu beeinflussen, welche vom Nutzer durch Wahl der elektrischen Parameter bestimmt wird. Das entwickelte Probenzuführungssystem ist verglichen mit dem pneumatischen Referenzsystem weniger anfällig gegenüber Matrixeffekten beim Einsatz von realen Proben mit hohen Anteilen gelöster Substanzen. So gelingt die richtige Quantifizierung von fünf Metallen im Spurenkonzentrationsbereich (Li, Sr, Mo, Sb und Cs) in nur 12 µL Urin-Referenzmaterial mittels externer Kalibrierung ohne Matrixanpassung. Wohingegen beim pneumatischen Referenzsystem die aufwändigere Standardadditionsmethode sowie über 250 µL Probenvolumen für eine akkurate Bestimmung der Analyten nötig sind. Darüber hinaus wird basierend auf der Dosierfrequenz eines dualen DOD-Systems eine neuartige Kalibrierstrategie vorgestellt. Bei diesem Ansatz werden nur eine Standard- und eine Blindlösung anstelle einer Reihe unterschiedlich konzentrierter Standards benötigt, um eine lineare Kalibrierfunktion zu erzeugen. Zusätzlich wurde mittels selbst entwickelter, zeitlich aufgelöster ICP-MS umfangreiche Rauschspektren aufgenommen. Aus diesen gelang die Ermittlung der Ursache des erhöhten Signalrauschens des DOD, welches maßgeblich durch das zeitlich nicht äquidistante Eintreffen der Tropfen am Detektor verursacht wird. Diese Messtechnik erlaubt auch die Detektion einzeln zugeführter Tropfen, wodurch ein Vergleich der Volumenverteilung der mittels ICP-MS detektierten, gegenüber den generierten und auf optischem Wege charakterisierten Tropfen möglich wurde. Dieses Werkzeug ist für diagnostische Untersuchungen äußerst hilfreich. So konnte aus diesen Studien neben der Aufklärung von Aerosoltransportprozessen die Transporteffizienz des DOD ermittelt werden, welche bis zu 94 Vol.-% beträgt.

The NreABC system of Staphylococcus carnosus combines nitrate and oxygen sensing by an NreA,NreB sensor complex

Staphylococcus carnosus is a facultative anaerobic bacterium which features the cytoplasmic NreABC system. It is necessary for regulation of nitrate respiration and the nitrate reductase gene narG in response to oxygen and nitrate availability. NreB is a sensor kinase of a two-component system and represents the oxygen sensor of the system. It binds an oxygen labile [4Fe-4S]2+ cluster under anaerobic conditions. NreB autophosphorylates and phosphoryl transfer activates the response regulator NreC which induces narG expression. The third component of the Nre system is the nitrate receptor NreA. In this study the role of the nitrate receptor protein NreA in nitrate regulation and its functional and physiological effect on oxygen regulation and interaction with the NreBC two-component system were detected. In vivo, a reporter gene assay for measuring expression of the NreABC regulated nitrate reductase gene narG was used for quantitative evaluation of NreA function. Maximal narG expression in wild type S. carnosus required anaerobic conditions and the presence of nitrate. Deletion of nreA allowed expression of narG under aerobic conditions, and under anaerobic conditions nitrate was no longer required for maximal induction. This indicates that NreA is a nitrate regulated inhibitor of narG expression. Purified NreA and variant NreA(Y95A) inhibited the autophosphorylation of anaerobic NreB in part and completely, respectively. Neither NreA nor NreA(Y95A) stimulated dephosphorylation of NreB-phosphate, however. Inhibition of phosphorylation was relieved completely when NreA with bound nitrate (NreA•[NO3-]) was used. The same effects of NreA were monitored with aerobically isolated Fe-S-less NreB, which indicates that NreA does not have an influence on the iron-sulfur cluster of NreB. In summary, the data of this study show that NreA interacts with the oxygen sensor NreB and controls its phosphorylation level in a nitrate dependent manner. This modulation of NreB-function by NreA and nitrate results in nitrate/oxygen co-sensing by an NreA/NreB sensory unit. It transmits the regulatory signal from oxygen and nitrate in a joint signal to target promoters. Therefore, nitrate and oxygen regulation of nitrate dissimilation follows a new mode of regulation not present in other facultative anaerobic bacteria.

Signalerkennung und Signaltransduktion im DctA,DcuS-Sensor-Regulatorkomplex von Escherichia coli.

E. coli ist in der Lage unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen C4-Dicarbonsäuren zur Energiekonservierung zu nutzen. Das DcuS/DcuR-Zweikomponentensystem detektiert diese und reguliert die Gene für den C4-Dicarboxylat-Transport und Metabolismus. Dabei hängt die Sensitivität der Sensorkinase DcuS für C4-Dicarbonsäuren von der Anwesenheit des aeroben Symporters DctA oder des anaeroben Antiporters DcuB ab. Diese bifunktionalen Transporter bilden mit DcuS über direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen Sensoreinheiten. In dieser Arbeit wurden die Funktionen von DctA und DcuS im DctA/DcuS-Sensorkomplex analysiert. Mit DctA(S380D) wurde eine Variante des Transporters identifiziert, in der die regulatorische Eigenschaft von der katalytischen Funktion entkoppelt ist. Stämme von E. coli, die den DctA(S380D)/DcuS-Sensorkomplex enthielten, waren in der Lage C4-Dicarbonsäuren wahrzunehmen, obwohl die Transportfunktion von DctA inaktiviert war. Zudem wurden Unterschiede in den Substratspektren von DctA und DcuS festgestellt. Citrat, ein guter Effektor des DctA/DcuS-Sensorkomplexes, wurde durch DctA nicht gebunden oder transportiert. Anhand von Titrationsexperimenten mit variierenden DctA-Mengen wurde außerdem nachgewiesen, dass die Sensitivität von DcuS für seine Effektoren von der DctA-Konzentration abhängig ist. Es konnte gezeigt werden, dass DctA im DctA/DcuS-Sensorkomplex nicht an der Erkennung von C4-Dicarbonsäuren beteiligt ist. DcuS stellt die Signaleingangsstelle des Komplexes dar, während DctA durch seine Anwesenheit die Sensorkinase in eine funktionsbereite oder sensitive Form überführt, die auf Effektoren reagieren kann. Darüber hinaus wurde die Rolle der Transmembranhelices TM1 und TM2 von DcuS für die Funktion und Dimerisierung der Sensorkinase untersucht. Durch Sequenzanalysen wurden „SmallxxxSmall“-Motive, deren Relevanz als Dimerisierungsschnittstellen bereits in Transmembranhelices anderer Proteine nachgewiesen wurde, in TM1 sowie TM2 identifiziert. Die Homodimerisierung beider Transmembrandomänen wurde im GALLEX Two-Hybrid System nachgewiesen, wobei die TM2-TM2-Interaktion stärker war. Die Substitution G190A/G194A im SxxxGxxxG-Tandemmotiv von TM2 rief zudem einen deutlichen Funktionsverlust der Sensorkinase hervor. Dieser Aktivitätsverlust korrelierte mit Störungen der Homodimerisierung von TM2(G190A/G194A) sowie DcuS(G190A/G194A) bei bakteriellen Two-Hybrid Messungen im GALLEX- bzw. BACTH-System. Demzufolge agiert Transmembranhelix 2 mit seinem SxxxGxxxG-Sequenzmotiv als wesentliche Homodimerisierungsstelle in DcuS. Die Dimerisierung von DcuS ist essentiell für die Funktion der Histidinkinase. Zusätzlich wurde bei fluoreszenzmikroskopischen Studien durch Koexpression von DcuS bzw. DctA die zelluläre Kolokalisierung von DctA und DcuR mit DcuS sowie DauA mit DctA nachgewiesen. Die DctA/DcuS-Sensoreinheit kann demnach zum DauA/DctA/DcuS/DcuR-Komplex erweitert werden.

Signaltransduktion in der membranständigen Sensor-Histidinkinase DcuS von Escherichia coli

Escherichia coli kann unter aeroben und anaeroben Bedingungen mit C4-Dicarboxylaten wachsen, die Regulation des Stoffwechsels erfolgt durch das Zwei-Komponenten-System DcuSR. Die C4-Dicarboxylattransporter DctA (aerob) bzw. DcuB (anaerob) agieren als Co-Regulatoren und bilden gemeinsam mit der Sensor-Histidinkinase DcuS einen Sensorkomplex, in dem DcuS den Sensor darstellt und DctA bzw. DcuB diesen in seine rezeptive Form überführen. DcuS ist membranständig und verknüpft die Bindung von C4-Dicarboxylaten im Periplasma mit der Autophosphorylierung seiner Kinasedomäne im Cytoplasma. Dies stellt den Beginn einer Signalkaskade vom extrazellulären Reiz zum cytoplasmatischen Responseregulator DcuR dar.rnIn dieser Arbeit wurde die intramolekulare Signaltransduktion in DcuS und über die Membran untersucht. Der Fokus lag auf der Funktion der beiden Transmembranhelices TM1 und TM2 und der cytoplasmatischen PAS-Domäne, die die sensorische PASp- mit der effektorischen Kinasedomäne verbinden. Konformationsänderungen dieser Signalweiterleitung wurden durch Cysteinzugänglichkeitsstudien, oxidatives Cystein-Crosslinking und Mutageneseexperimente analysiert. rnTM2 wurde als der Überträger eines transmembranen Signals identifiziert, während TM1 als Membrananker fungiert. Der aktive Signalzustand von TM2 wird unabhängig von der Art der DcuS-Aktivierung (Effektorbindung, Deletion des Co-Regulators DctA oder PASc-ON-Mutationen) eingenommen. Der Signaltransduktion liegt eine Verschiebung von TM2 entlang ihrer Längsachse (Kolbenhub) in Richtung Periplasma zu Grunde. Cystein-Crosslinking offenbarte eine durchgehende Helix aus PASp-α6 und TM2, die im Dimer parallel mit ihrem Pendant verschoben wird. Die Amplitude des Kolbenhubs wurde anhand von Zugänglichkeitsveränderungen, der Lage verankernder Tryptophanreste, Strukturvergleichen und energetischen Berechnungen auf max. 4 - 6 Å festgelegt. Sie ist von der Effektorstärke abhängig und koppelt so die metabolische Bevorzugung einzelner Substrate an das Ausmaß des Kolbenhubs und der Genexpression. Für die cytoplasmatische PAS-Domäne wurde ein Zusammenhang zwischen lokaler Dimerisierung und Kontrolle der Sensorfunktion nachgewiesen. Schwächung der Dimerisierung führt zu einer Aktivierung der Sensorkinase. Es wurde eine hydrophobe Region identifiziert, deren strukturelle Integrität für diese Dimerisierung essentiell ist. Mit N248 wurde ein funktionell bedeutender Rest beschrieben, der auf Grund seiner Lage und seiner Eigenschaft mehrere Sekundärstrukturelemente zu verknüpfen, als Scharnier innerhalb der Domäne an der Umsetzung des Kolbenhubs in eine veränderte Quartärstruktur von PASc beteiligt sein könnte.