Cannabinoid CB1 receptor in the regulation of sociability, stress coping, and its interaction with the serotonergic system

Cannabinerge Substanzen können das Verhalten in einer dosisabhängigen, aber biphasischen Weise beeinflussen. Eine Erklärung für diese Art der Effekte könnte die Verteilung des CB1 Rezeptors auf verschiedenen Neuronentypen sein. CB1 Rezeptoren in glutamatergen und GABAergen Neuronen sind hier besonders wichtig, da die entsprechenden Neurotransmitter als Gegenspieler die neuronale Erregung kontrollieren. Spezifische Deletion des CB1 Rezeptor-Gens von einer der beiden Populationen führte zu gegensätzlichen Phenotypen, genauer gesagt, einem erniedrigten, bzw. einem gesteigerten Interaktiondrang. Tiere, bei denen der CB1 Rezeptor ausschließlich in striatalen, GABAergen „Medium Spiny“ Neuronen deletiert wurde, zeigten keinen veränderten Phänotyp. Dies legt nahe, dass der CB1 Rezeptor in kortikalen glutamatergen und GABAergen Neuronen für einen ausgeglichenen Interaktionsdrang entscheidend ist (siehe Kapitel 3).rnDiese dosisabhängigen, biphasischen Effekte auf das Verhalten können auch im „Forced Swim Test“ (FST) beobachtet werden. Ein möglicher Mechanismus, durch den Cannabinoide das Stressverhalten beeinflussen können, wäre die Regulierung der Monoaminausschüttung. Um die Abhängigkeit der Cannabinoideffekte von der Serotonintransmission zu untersuchen, wurden Dosen von CB1 Rezeptoragonisten und –antagonisten mit antidepressiv-induzierenden Eigenschaften bei gleichzeitiger Inhibition der Serotonintransmission im FST getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass lediglich der Agonisteffekt durch die Inhibition der Serotoninauschüttung beeinflusst wird. Zusätzlich konnte die Abhängigkeit des Antagonisteneffekts von funktionsfähigen GABAergen CB1 Rezeptoren nachweisen werden. Interessanter Weise konnte der durch die Deletion von glutamatergen CB1 Rezeptoren induzierte Phänotyp durch Inhibition der Serotoninausschüttung blockiert werden (siehe Kapitel 4).rnEin indirekter Einfluss auf Serotoninausschüttung scheint also wahrscheinlich zu sein. Bis jetzt blieb jedoch unklar, inwieweit cannabinerge Substanzen direkt auf serotonerge Neuronen wirken können. Im Jahr 2007 konnte unsere Gruppe die Expression des CB1 Rezeptors in serotonergen Neuronen auf mRNA- und Proteinebene nachweisen. Die Züchtung und Analyse einer mutanten Mauslinie, in welcher der CB1-Rezeptor spezifisch in serotonergen Neuronen ausgeschaltet wurde, zeigte bei männlichen Tieren eine schwache, aber signifikante Verhaltensänderungen, die durch soziale Stimuli und lebensbedrohlichen Situationen ausgelöst wurde. So ist es erstmals gelungen nachzuweisen, dass serotonerge CB1-Rezeptoren eine physiologische Relevanz besitzen (siehe Kapitel 5).rn

Transgenic mice as a tool for depression research: examples from the endocannabinoid and the corticotropin-releasing hormone system

Major depression belongs to the most serious and widespread psychiatric disorders in today’s society. There is a great need for the delineation of the underlying molecular mechanisms as well as for the identification of novel targets for its treatment. In this thesis, transgenic mice of the endocannabinoid and the corticotropin-releasing hormone (CRH) system were investigated to determine the putative role of these systems for depression-like phenotypes in mice. In the first part of the thesis, we found that the endocannabinoid system was prominently involved in a brain region-specific and temporally controlled manner in acute as well as in chronic stress processing. Genetic deletion in combination with pharmacological intervention revealed the importance of a fully functional endocannabinoid system for efficient neuroendocrine and behavioral stress coping. Accordingly, cannabinoid type 1 (CB1) receptor-deficient mice displayed several depression-like symptoms and molecular alterations, including “behavioral despair”, stress hormone hypersecretion and decreased glucocorticoid receptor and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. However, the endocannabinoid system was dispensable for the efficacy of currently used antidepressant drugs. To facilitate future endocannabinoid research, a transgenic mouse was generated, which overexpressed the CB1 receptor protein fused to a fluorescent protein. In the second part of the thesis, conditional brain region-specific CRH overexpressing mice were evaluated as a model for pathological chronic CRH hyperactivation. Mutant mice showed aberrant neuroendocrine and behavioral stress coping and hyperarousal due to CRH-induced activation of the noradrenergic system in the brain. Mutant mice appeared to share similarities with naturally occurring endogenous CRH activation in wild-type mice and were sensitive to acute pharmacological blockade of CRH receptor type 1 (CRH-R1). Thus, CRH overexpressing mice serve as an ideal in vivo tool to evaluate the efficacy of novel CRH-R1 antagonists. Together, these findings highlight the potential of transgenic mice for the understanding of certain endo-phenotypes (isolated symptoms) of depression and their molecular correlates.

Expression der pronozizeptiven Vanilloidrezeptoren TRPV1 und TRPV2 und des antinozizeptiven Cannabinoidrezeptors CB1 in Spinalganglienneuronen der Ratte

Nozizeptive Spinalganglienneurone detektieren mit einer Vielzahl liganden- und spannungsgesteuerter Ionenkanäle noxische Reize, d.h. Reize, die eine Gewebeschädigung bewirken können, wandeln sie in Aktionspotenzialentladungen um und leiten sie über das Rückenmark zum Gehirn weiter, wo eine Schmerzempfindung ausgelöst wird. Die pronozizeptiven transienten Rezeptor-Potenzial-Kanäle der Vanilloidrezeptorfamilie, TRPV1 und TRPV2, sind die klassischen Transduktionsmoleküle für noxische Hitzereize in den Spinalganglien und werden von Reiztemperaturen über 43°C bzw. 52°C aktiviert. Daneben finden sich auch antinozizeptive Membranproteine, wie z.B. der metabotrope Cannabinoidrezeptor CB1. Er koppelt an spannungsgesteuerte Kaliumkanäle, die neben Natrium- und Kalziumkanälen ebenfalls an der neuronalen Erregbarkeit beteiligt sind. Von den spannungsgesteuerten Kaliumkanälen könnte der Kv1.4, der einen schnell inaktivierenden A-Strom vermittelt, an antinozizeptiven Signalwegen beteiligt sein. Um die molekulare Physiologie der Regulation von Nozizeption und Antinozizeption zu charakterisieren, wurde die Expression bzw. Ko-Expression dieser Membranproteine auf der einen als auch die funktionelle Charakterisierung von TRPV1 auf der anderen Seite im Soma der Spinalganglienneurone und im heterologen Expressionssystem untersucht. TRPV1 wurde in je einem Drittel und TRPV2 in je einem Zehntel aller Spinalganglienneurone nachgewiesen. Das Expressionsmuster veränderte sich nicht zwischen verschiedenen Präparationsmethoden, die zur Aufarbeitung der Zellen für unterschiedliche experimentelle Ansätze notwendig sind. Somit können die aus Expressionsanalysen und funktionellen Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse miteinander verglichen werden. Obwohl TRPV1 und TRPV2 in unterschiedlich großen Zellen exprimiert werden, überlappen dennoch ihre Größenverteilungen. Durch Ko-Expressionsanalysen konnten hier erstmalig TRPV1-TRPV2-ko-exprimierende Neurone detektiert werden. Mit dem neu entwickelten N-terminalen Antikörper gegen TRPV1 (3C11) konnte gezeigt werden, dass für TRPV1 verschiedene Splice-Varianten existieren. Neben den bereits bekannten Splice-Varianten wurde hier die neue Variante Vr.3’sv isoliert. Diese besitzt zwischen Exon 15 und 16 eine Insertion aus 104 Basen und exprimiert daher einen veränderten C-Terminus. Trotz dieser Veränderung bildeten sich im heterologen Expressionssystem funktionelle Kanäle aus, die im Gegensatz zu den anderen Varianten immer noch durch Capsaicin aktivierbar waren. Vr.3’sv könnte als Homo- oder Heterotetramer die Eigenschaften TRPV1-positiver Neurone beeinflussen. Bei der Bestimmung der Häufigkeit von TRPV1 in einem Gewebe ist somit die Wahl des Antikörpers von entscheidender Bedeutung. Für TRPV2 dagegen gibt es hier keine Hinweise auf Splice-Varianten. TRPV1 wird durch das Vanilloid Capsaicin aktiviert, wobei diese Substanz neurotoxisch ist und eine Degeneration von Neuronen und epidermalen Nervenfasern bewirkt. Hier wurde nun gezeigt, dass unabhängig von den Splice-Varianten nicht alle TRPV1-positiven Neurone bei langer Inkubationszeit absterben. Funktionelle Untersuchungen belegten, dass auch Capsaicin-sensitive Zellen unter dem Einfluss des Agonisten überleben können. Dieser Schutzmechanismus wird möglicherweise von den verschiedenen Splice-Varianten vermittelt. Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass der spannungsgesteuerte Kaliumkanal Kv1.4 in nahezu allen TRPV1- aber nicht TRPV2-positiven Neuronen exprimiert wird. Desweiteren ko-exprimierten nahezu alle TRPV1-positiven Neurone auch den Cannabinoidrezeptor CB1. Diese fast vollständige Ko-Lokalisation von CB1 und Kv1.4 in nozizeptiven Spinalganglienneuronen spricht für eine funktionell synergistische Aktivität. Der Kaliumkanal kann unter der regulativen Kontrolle von CB1 als Vermittler von A-Typ-Kaliumströmen an der Kontrolle der repetitiven Entladungen in der Peripherie und der Transmitterausschüttung zentral beteiligt sein. Es ergeben sich daraus Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Medikamente. Mit Kv1.4-Aktivatoren und/oder peripher wirkenden Cannabinoiden könnten die Nebenwirkungen der Cannabinoide im zentralen Nervensystem umgangen werden.

Nanoparticular iron complex drugs for parenteral administration - physicochemical characterization, biological distribution and pharmacological safety

Iron deficiency is the most common deficiency disease worldwide with many patients who require intravenous iron. Within the last years new kind of parenteral iron complexes as well as generic preparations entered the market. There is a high demand for methods clarifying benefit to risk profiles of old and new iron complexes. It is also necessary to disclose interchangeability between originator and intended copies to avoid severe anaphylactic and anaphylactoid side reaction and assure equivalence of therapeutic effect.rnrnThe investigations presented in this work include physicochemical characterization of nine different parenteral iron containing non-biological complex drugs. rnWe developed an in-vitro assay, which allows the quantification of labile iron in the different complexes and thus it is a useful tool to estimate the pharmaclogical safety regarding iron related adverse drug events. This assay additionally allowed the estimation of complex stability by evaluation of degradation kinetics at the applied conditions.rnrnAn in-ovo study was performed to additionally compare different complexes in respect to body distribution. This in combination with complex stability information allowed the risk estimation of potential local acute and chronic reactions to iron overload.rnrnInformation obtained by the combination of the methods within this work are helpful to estimate the safety and efficacy profile of different iron containing non-biological complex drugs. rnrnPhysicochemical differences between the complexes were demonstrated in respect to size of the inorganic fraction, size and size distribution of the complete particles, structure of the inorganic iron fraction, morphology of the complexes and charge of the complexes. And furthermore significant differences in the biological behavior of different complexes were demonstrated. rnrnThe combination of complex stability and biodistribution as well as the combination of structure, size and stability represent helpful tools for the physicochemical characterization of iron containing non-biological complex drugs and for the estimation of pharmacological safety. This work thus represents an up to date summary of some relevant methods for the characterization of intravenous iron complex drugs in respect to pharmaceutical quality, pharmacological safety and aspects of efficacy. rnrnProspectively, it is worthwhile that the methods within this work will contribute to the development and/or characterization of iron containing nanoparticular formulations with beneficial efficacy and safety profiles.rn

Nanoparticle preparation process using novel microjet reactor technology for enhancing dissolution rates of poorly water soluble drugs

In this study a novel method MicroJet reactor technology was developed to enable the custom preparation of nanoparticles. rnDanazol/HPMCP HP50 and Gliclazide/Eudragit S100 nanoparticles were used as model systems for the investigation of effects of process parameters and microjet reactor setup on the nanoparticle properties during the microjet reactor construction. rnFollowing the feasibility study of the microjet reactor system, three different nanoparticle formulations were prepared using fenofibrate as model drug. Fenofibrate nanoparticles stabilized with poloxamer 407 (FN), fenofibrate nanoparticles in hydroxypropyl methyl cellulose phthalate (HPMCP) matrix (FHN) and fenofibrate nanoparticles in HPMCP and chitosan matrix (FHCN) were prepared under controlled precipitation using MicroJet reactor technology. Particle sizes of all the nanoparticle formulations were adjusted to 200-250 nm. rnThe changes in the experimental parameters altered the system thermodynamics resulting in the production of nanoparticles between 20-1000 nm (PDI<0.2) with high drug loading efficiencies (96.5% in 20:1 polymer:drug ratio).rnDrug releases from all nanoparticle formulations were fast and complete after 15 minutes both in FaSSIF and FeSSIF medium whereas in mucodhesiveness tests, only FHCN formulation was found to be mucoadhesive. Results of the Caco-2 studies revealed that % dose absorbed values were significantly higher (p<0.01) for FHCN in both cases where FaSSIF and FeSSIF were used as transport buffer.rn