Bedeutung der viralen IE4-Region für die Genexpression und Replikation des humanen Cytomegalovirus

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein fakultativ-pathogener Erreger, der bei Patienten mit geschwächter oder unausgereifter Immunabwehr schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen kann. Wie alle Herpesviren zeigt das HCMV eine streng koordinierte Expression viraler Gene, die in eine „sehr frühe-“ (IE), „frühe “ (E) und „späte-“ (L) Phase unterteilt werden kann. Die Produkte der IE-Gene IE1 und IE2 sind für die Expression der frühen Gene und somit für die Initiation der viralen DNA-Replikation entscheidend. Sie greifen gleichzeitig in den zellulären Stoffwechsel ein und schaffen damit optimale Vorraussetzungen für die virale Vermehrung. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass HCMV in lytisch infizierten Zellen ein abundantes IE-Transkript von 5 kb (IE4-RNA) exprimierte, dessen Funktion bislang unklar war. Ältere Publikationen deuteten darauf hin, dass die IE4-Genregion an der Transformation eukaryonter Zellen beteiligt sein könnte. Neuere Arbeiten zeigten, dass es sich bei diesem IE4-Transkript um ein metabolisch stabiles Intron handelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst geklärt werden, ob die IE4-Genregion ein Protein kodiert. In der Folge sollten mit viralen Deletionsmutanten Hinweise auf die biologische Funktion des IE4-Bereichs erarbeitet werden. Durch Northern Blot Analysen und cDNA-Klonierungsexperimente konnte eine Reihe neuer Spleiß-Varianten der IE4-RNA identifiziert werden. Durch Sequenzanalysen wurde gezeigt, dass diese Transkripte keine längeren offenen Leserahmen enthalten. Zusammen mit bereits publizierten Erkenntnissen, kann aus diesen Ergebnissen mit hoher Wahrscheinlichkeit geschlossen werden, dass die IE4 Region nicht für ein Protein kodiert. Zur Analyse der biologischen Funktion der IE4-Region wurde das DNA-Genom des HCMV gezielt mutagenisiert. Eine phänotypische Analyse der entsprechenden Viren mittels Reportergen-Tests und quantitativer RealTime RT-PCR zeigte, dass einige der Mutanten eine verringerte Expression früher Gene aufwiesen, die mit einer Beeinträchtigung ihrer Replikationsfähigkeit in Fibroblastenkulturen korrelierte. Dabei war die Ausbildung eines Phänotyps jedoch von dem genetischen Hintergrund des verwendeten viralen Ausgangsstammes abhängig. Auffällig war, dass phänotypische Veränderungen nur bei solchen Mutanten sichtbar wurden, die auf der Grundlage des Laborstammes Ad169 des HCMV generiert worden waren. Die nachfolgende Analyse der Ausgangsstämme ergab deutliche Unterschiede in der IE-Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen somit, dass die IE4-RNA mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht für ein Protein kodiert, aber bei limitierender Expression der essentiellen Regulatoren IE1 und IE2 die frühe lytische Genexpression stimuliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage für nachfolgende Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Funktion der IE4-RNA im Rahmen der lytischen Infektion des HCMV dar.

Molecular cloning, heterologous expression and characterization of Strictosidine Glucosidase from Rauvolfia serpentina cell suspension cultures

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die enzymatische Deglucosylierung von Strictosidin in Zellsuspensionskulturen von Rauvolfia serpentina zu charakterisieren.Ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Strictosidin aus pflanzlicher Zellkulturen wurde entwickelt. Zwei somatische Hybridzellkulturen zwischen R. serpentina und Rhazya stricta wurden als potenzielle Quelle dieses Glucoalkaloides untersucht. Der Sekundärstoffwechsel der pflanzlichen Zellen wurde mit Methyljasmonat induziert und 15 Stoffe wurden identifiziert, u. a. das neue Indolalkaloid 3-Oxo-rhazinilam. Die Gehaltsänderung von 7 Indolalkaloiden nach Behandlung mit Methyljasmonat wurde untersucht.Deglucosylierung von Strictisidin bei in E. coli exprimierter Raucaffricin Glucosidase wurde detektiert.Die Strictosidin Glucosidase kodierende cDNA wurde aus R. serpentina Zellsuspensionskulturen cloniert und in E. coli exprimiert. Das Enzyme wurde mit Hilfe des Inteintages gereinigt und seine Eigenschaften wurden untersucht, u. a. optimale Temperatur und pH Wert und Substratspezifität.Die Produkte von der enzymatischen Strictosidinhydrolyse wurden als Cathenamin (unter normalen Bedingungen) und Sitsirikin und Isositsirikin (im Gegenwart von Reduktoren) identifiziert. Das neue Indolalkaloid 3-Isocorreantin A wurde nach der enzymatischen Deglucosylierung von Dolichantosid (Nß-Methylstrictosidin) gebildet.

Die Identifizierung und Charakterisierung von HLA-Klasse-I-restringierten Minorhistokompatibilitätsantigenen und Leukämie-assoziierten Antigenen mittels cDNA-Expressionsklonierung

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HSCT) bietet bei einem hohen Anteil akuter Leukämien die einzige kurative Behandlungsmöglichkeit. Um die mit ihr assoziierte Morbidität und Mortalität zu senken und ihre Effektivität zu steigern, soll die GvL (graft-versus-leukemia)-Reaktion als eigentliches Therapieziel gegenüber der unerwünschten GvHD (graft-versus-host disease) möglichst selektiv verstärkt werden. Wesentliche Mediatoren beider Effekte sind alloreaktive T-Zellen. Bei HLA-Übereinstimmung zwischen Spender und Empfänger sind so genannte Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) und Leukämie-assoziierte Antigene (LAA) die mutmaßlichen Zielstrukturen beider Reaktionen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in dem Leukämie-Modell der Patientin MZ201 [akute myeloische Leukämie (AML) vom Subtyp FAB M5] mittels T-Zell-basierter cDNA-Expressionsklonierung zwei neue Antigene identifiziert, die von allogenen, AML-reaktiven CD8+ T-Lymphozyten aus Blut eines HLA-passenden gesunden Spenders erkannt wurden. Es handelt sich zum einen um das HLA-B*5601-restringierte mHAg PLAUR-317P, das aus einem Polymorphismus des Gens PLAUR (plasminogen activator, urokinase receptor) resultiert. Das von den T-Zellen am Besten erkannte Peptid enthält die Aminosäuren 316 - 327. PLAUR wird in lymphohämatopoetischen Zellen und in verschiedenen Malignomen überexprimiert und ist dabei mit schlechterer Prognose und vermehrter Gewebeinvasivität assoziiert. Etwa 30% getesteter Individuen tragen das Allel PLAUR-317P. Zum anderen handelt es sich um ein Epitop aus der Signalregion des Chemokins CXCL3 [chemokine (C-X-C motif) ligand 3], das von CD8+ T-Zellen des gleichen Spenders auf Leukämiezellen der Patientin MZ201 in Assoziation mit HLA-A*0201 erkannt wurde. Auch CXCL3 wird vorwiegend in Zellen der Myelopoese exprimiert. Aufgrund ihres Expressionsmusters sind beide Antigene potentielle Zielstrukturen für die Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss der Leukämieblasten im Rahmen der allo-HSCT. Weiterführende Untersuchungen müssen zeigen, ob diese Antigene tatsächlich in vivo GvL-Reaktionen hervorrufen. Die Kenntnis eines repräsentativen Spektrums solcher Antigene würde verbesserte Spenderselektionen erlauben und neue Wege des adoptiven T-Zelltransfers erschließen helfen.

Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium

'Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium: Klonierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Apoptose-Regulatoren der Porifera'. Auf der Suche nach der molekularbiologischen Grundlage der Apoptose in den Porifera, dem phylogenetisch ältesten Metazoen-Tierstamm, wurden Mitglieder der apoptoseregulatorischen Bcl?2 Familie unter Anwendung diverser Techniken im Schwamm G. cydonium identifiziert: GCBHP1 und GCBHP2. Detaillierte Analysen offenbarten Bcl-2-charakteristische Signaturen sowie eine durch apoptotische Stimuli induzierbare Expression. Die parallele HSP70-Induktion zeugte von der GCBHP2-Expression als Teil einer antiapoptotischen Streßantwort zum Schutz des Organismus'. Die kontinuierliche Transkription des im Rahmen dieser Arbeit gleichfalls klonierten Proliferationsmarkers SEP1 veranschaulichte zudem die Effektivität dieser Streßreaktion. Mit der Herstellung eines rekombinanten Proteins und der Gewinnung eines Antiserums konnte auch die streßinduzierte Proteinexpression des GCBHP2 verfolgt werden. Zum Zweck der Funktionsstudie wurden Säugetierzellen (HEK-293, NIH/3T3) mit einem GCBHP2-Konstrukt stabil transfiziert und auf die Expression des Schwammproteins untersucht. Diese Zellen unterschieden sich bereits phänotypisch von mock-transfizierten Zellen. Immunzytochemische Untersuchungen enthüllten eine für antiapoptotische Bcl-2 Proteine charakteristische Assoziation mit Mitochondrien. Unter dem Einfluß zweier apoptotischer Stimuli wurde für GCBHP2-transfizierte Zellen eine vierzehn-/sechsmal höhere Vitalität und eine reduzierte Aktivierung der Caspase-Kaskade registriert (im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen). Somit wurde der antiapoptotische Charakter des GCBHP2 und die Existenz apoptotischer Mechanismen in den Porifera bestätigt.

Identifikation transkriptioneller Alterationen menschlicher Tumoren und Entwicklung eines neuen auf RNA-Transfer basierenden Verfahrens zur Bestimmung der Genfunktion

Zielvorgaben der vorliegenden Arbeit war die Identifikation neuer selektiv in Tumoren aktivierter Gene sowie die Entwicklung eines methodischen Prozesses, um die molekularen Effekte der fehlerhaften Aktivierung solcher Gene zu untersuchen. Für die erste Fragestellung haben wir zwei komplementäre Methoden entwickelt. Zum einen haben wir nach neuen Mitglieder der Cancer/Germline (CG) Familie von Genen gesucht, die bereits attraktive Zielstrukturen laufender Phase I/IIa Studien sind. Zu diesem Zweck wurde ein bioinformatischer Data Mining Ansatz generiert. Dieser führte zur erfolgreichen in silico Klonierung neuer CG Gene. Zur Identifikation von in Tumorzellen überexprimierten Genen nutzten wir einen cDNA Mikroarray mit 1152 ausgewählten Genen mit direkter oder indirekter tumorimmunologischer oder tumorbiologischer Relevanz. Die komparative transkriptionelle Untersuchung von humanen Tumor- und Normalgeweben mit diesem Array führte zur Wiederentdeckung bereits bekannter, aber auch zur Aufdeckung bisher nicht beschriebener tumor-assoziierter Transkriptionsveränderungen. Der zweite große Schwerpunkt dieser Arbeit war die Technologieentwicklung eines versatilen Prozesses zur Untersuchung von molekularen Effekten eines aberrant in Zellen exprimierten Gens. Zur Simulation dieser Situation stellten wir in vitro transkribierte RNA dieses Gens her und elektroporierten diese in Zielzellen. Transkriptionsanalysen solcher Transfektanden mit Affymetrix Oligonukleotid Mikroarray deckten auf gesamt-genomischer Ebene ganze Kaskaden konsekutiver, transkriptioneller Alterationen auf.

Reinigung und Coexpression von Enzymen der Raubasin-Biosynthese

Die vorgestellten Arbeiten bezüglich der Biosynthese von pflanzlichen Indolalkaloiden können in einen molekularbiologischen und einen proteinche-mischen Teil aufgegliedert werden. Im molekularbiologischen Abschnitt stand die Entwicklung eines Vektorsystems im Vordergrund, das die gleichzeitige Expression mehrerer Enzyme in bakteriellen Kulturen erlaubte. Hierfür konnte zunächst die cDNA der Strictosidin-Synthase aus Rauvolfia serpentina in den Expressionsvektor pQE-70 einkloniert und das Protein aktiv exprimiert werden. Bevor es zum Einbau des Strictosidin-β-D-Glucosidase-Gens –ebenfalls aus Rauvolfia serpentina– kam, musste dessen Aktivität mit einer vorgeschalteten Ribosomenbindestelle sichergestellt werden. Diese zusätzliche Binderegion wurde an das 5’-Ende der cDNA angefügt, um die ungestörte Expression des Enzyms im späteren Coexpressions-System zu gewährleisten. Im Hinblick auf weiterführende Arbeiten in Bezug auf die komplette in vitro-Synthese bereits bekannter Alkaloide, wie z.B. das antiarrhythmisch wirkende Ajmalin oder das antihypertensiv wirkende Heteroyohimbin-Alkaloid Raubasin, wurde die ursprüngliche multiple-clonig-site des verwendeten Expressionsvektors pQE-70 um 27 zusätzliche Restriktionsschnittstellen (verteilt auf 253 bp) erweitert. Nach erfolgreicher Ligation der Strictosidin-β-D-Glucosidase-cDNA mit vorgeschalteter Ribosomenbindestelle an das 3’-Ende des Strictosidin-Synthase-Gens gelang die heterologe Coexpression beider Enzyme in einer homogenen Suspensionskultur des E. coli-Expressionsstamms M15. Dafür wurde das Vektorkonstrukt pQE-70bh-STR-RBS-SG entwickelt. Das Endprodukt der anschließenden enzymatischen Umsetzung von Tryptamin und Secologanin wurde über das Zwischenrodukt Strictosidin gebildet und konnte als Cathenamin identifiziert werden. Im proteinchemischen Teil der Dissertation wurde die Reinigung einer Cathenamin-Reduktase aus Zellsuspensionskulturen von Catharanthus roseus RC mit dem Ziel der partiellen Bestimmung der Aminosäuresequenz bearbeitet. Das gesuchte Enzym wandelte in einer NADPH-abhängigen Reaktion das Edukt Cathenamin in Raubasin um. Des weiteren wurde untersucht, wie viele Enzyme insgesamt an der Umwandlung von Cathenamin zu Raubasin und den eng verwandten Produkten Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin beteiligt waren. Unter Anwendung eines hierfür entwickelten säulenchromatographischen Protokolls gelang die Reinigung einer Raubasin-bildenden Reduktase, deren Teilsequenz jedoch noch nicht bestimmt werden konnte. Die Anzahl der beteiligten Enzyme bei der Ausbildung von Raubasin, Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin konnte auf mindestens zwei beziffert werden.

Charakterisierung von T-Zell-Antworten gegen humane Nierenzellkarzinome sowie Identifizierung von HLA-G als tumorassoziiertes Antigen und Immunevasionsmechanismus des Nierenzellkarzinoms

Humane Nierenzellkarzinom-(NZK)-Zelllinien wurden etabliert, um sie zur Generierung von autologen zytotoxischen T-Zelllinien einzusetzen. Erst nach Modifikation mit dem kostimulierenden B7-1-Molekül wurden mit der NZK-Zelllinie MZ1257RC autologe, tumorspezifische T-Zelllinien generiert und charakterisiert. Die Aufklärung eines T-Zell-definierten TAA eines autologen, zytotoxischen T Zellklons wurde mittels Expressionsklonierung einer hergestellten cDNS-Expressionsbank begonnen. Nach in vitro-Sensibilisierung von peripheren Blutmonozyten mit der autologen NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde die HLA-Klasse I-restringierte T Zelllinie XIE6 generiert, die die autologe und verschiedene allogene NZK- sowie Zervixkarzinom-Zelllinien, jedoch nicht autologe Nierenzellen lysiert. Die T Zellen exprimieren TZR Vβ13.6-Ketten und sezernieren GM-CSF und IL-10 nach Antigenstimulation. Jedoch ist die NZK-Zelllinie MZ2733RC wenig sensitiv gegenüber autologen und allogenen Effektorzellen. Erst die Blockade ihrer HLA Klasse I-Moleküle auf der Zelloberfläche erhöht ihre Sensitivität gegenüber allogenen lymphokin-aktivierten Killer-Zellen. Verantwortlich dafür können nicht-klassische HLA Klasse Ib-Moleküle, insbesondere HLA-G sein, dessen Transkripte in der RNS der NZK-Zellen, jedoch nicht in Nierenzellen detektiert wurden. In einer detaillierten Studie wurden HLA-G-Transkripte in NZK-Zelllinien (58%), in NZK-Biopsien (80%), und nur in wenigen Nierenepithelbiopsien (10%) nachgewiesen. In der NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde eine konstitutive HLA-G1-Proteinexpression beobachtet, die durch eine IFN-γ-Behandlung induzierbar ist.

Klonierung und Charakterisierung der Luziferase und des Luziferin regenerierenden Enzyms aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula

Bereits 1971 erkannte Reiswig bei einigen Schwämmen in der Kontraktion des Osculums eine Reaktion auf Licht. Nachfolgend konnte für eine Reihe von Schwämmen die Existenz von Lichtreaktionen beobachtet werden (Wapstra & van Soest, 1987). In dieser Arbeit sollten Gene eines Luziferin/Luziferase Systems im marinen Schwamm Suberites domuncula identifiziert werden, die eine Rolle bei der Bio¬lumineszenz spielen. Mit Hilfe der PCR-Technik konnten die in der cDNA-Bank identifizierten Fragmente einer Luziferase und eines Luziferin regenerierenden Enzyms erfolgreich vervollständigt, kloniert und analysiert werden. Datenbank¬analysen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergeben sowohl für die Luziferase als auch für das Luziferin regenerierende Enzym Ähnlichkeiten zu den entsprechenden Proteinen aus Leuchtkäfern, wie z. B. Photinus pyralis. Ausgehend von der cDNA wurden zunächst beide Enzyme in E. coli rekombinant exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Für die Luziferase gelang es, spezifische Antikörper herzustellen, die im Anschluss an den im Western Blot durchgeführten Nachweis eine Identifizierung in histologischen Schwamm¬schnitten ermöglichte. Weitere Analysen konnten für Suberites domuncula sowohl im Schwammgewebe, im Proteinextrakt als auch für das rekombinante Protein die Licht-generierende Fähigkeit nachweisen. Das ermittelte in vitro Biolumineszenz-Emissionsspektrum der rekombinanten Luziferase weist eine Lichtemission im gelb-grünen Bereich des Spektrums mit einem Maximum bei 548 nm und einer Schulter bei 590 nm auf. Ausserdem bestätigte die Funktionanalyse des rekombinanten Enzyms die für Luziferasen bekannte ATP- und Temperatur¬abhängigkeit sowie den stimulierenden Effekt von Coenzym A. Die Existenz einer bioaktiven Luziferase in einem der ältesten, rezent vertretenen Metazoa deutet darauf hin, dass sich die Oxygenasefunktion der Luziferasen bereits früher entwickelte, als bisher von Viviani* vermutet. Die bisherigen Daten über die optischen Eigenschaften der Spiculae liefern gemeinsam mit den Ergebnissen dieser Arbeit – einer Licht-emittierenden Luziferase in S. domuncula – die Voraussetzungen für die mögliche Existenz eines Photorezeptionssystems in Schwämmen.

Evaluation von Nukleotidpolymorphismen für die Analyse des hämatopoetischen Spenderchimärismus auf Ebene der cDNA

Nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation spielt die Zuordnung hämatopoetischer Zellen zum Spender oder Empfänger für viele transplantationsbezogene Fragestellungen eine wichtige Rolle. Unter anderem ist das Persistieren von dendritischen Zellen des Empfängers, welche allogene T-Zellen des Spenders stimulieren, ein wichtiger Schritt bei der Entstehung der akuten GVHD. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Weiterentwicklung einer Methode angestrebt, die es uns erlaubt, die Zugehörigkeit isolierter hämatopoetischer Zellen dem Spender oder dem Empfänger zuzuordnen (Chimärismusbestimmung) und gleichzeitig Aussagen über das Ursprungsgewebe und den Aktivierungszustand der Zellen machen zu können. Hierfür nutzten wir Einzelbasenpolymorphismen (SNPs). Ziel dieser Arbeit war es, einen Pool von cDNA-kodierten SNPs zu definieren, mit dem auch HLA-identische Geschwister eindeutig unteschieden werden können. rnHierfür wurden zunächst aus publizierten Datenbanken solche SNPs ausgewählt, die in kodierenden Genabschnitten konstitutiv und gewebeunabhängig auf expremierten Genen lagen und zugleich eine hohe Heterozygotenfrequenz in der europäischen Population aufwiesen. Anhand dieser Kriterien wurden mittels der NCBI-Datenbank insgesamt eine Anzahl von 208 Polymorphismen auf 150 Genen identifiziert. Anschließend erfolgte die Gestaltung von Primerpaaren zur Amplifikation der SNP-kodierenden cDNA-Abschnitte. Diese mussten mindestens eine Intron/Exon-Grenze überspannen, um genomische DNA in der PCR ausschließen zu können. Mit Hilfe der etablierten PCR-Reaktion wurden die Gene in unterschiedlichen Geweben auf ihre Expression hin überprüft. Für 45 Gene ließ sich sowohl eine entsprechende PCR etablieren als auch deren konstitutive Expression in verschiedenen hämatopoetischen Zellen nachweisen. Zur Detektion der einzelnen SNPs in der Minisequenzierung wurden Minisequenzierungs-Sonden generiert und geprüft. Im Folgenden wurden für PCR und Minisequezierung Multiplex-Reaktionen aus vier bis sechs Reaktionen zusammengestellt. Zu diesem Zweck wurden die jeweiligen Primerinteraktionen und die unterschiedlichen Basenlängen des PCR-Produktes berücksichtigt.rnVon den 45 etablierten Einzelreaktionen waren 30 für den Multiplexansatz geeignet. Unter Anwendung dieser Multiplex-Reaktionen wurden 24 HLA-identische Geschwisterpaare (Spender und Empfänger) getestet. Zur Kontrolle erfolgte zusätzlich eine konventionelle Sequenzierung der SNP-kodierenden Bereiche auf der cDNA der jeweiligen Proben. Mit Hilfe der SNP-Kombinationen und der etablierten Methodik waren wir in der Lage alle 24 untersuchten Geschwisterpaare in zwischen sechs und 18 SNP-Systemen zu unterscheiden. rnDie Möglichkeiten, die die Analysen des Chimärismus mittels SNPs auf kodierenden Bereichen der DNA mit sich bringen, liegen nicht nur in der gleichzeitigen Bestimmung der Gewebszugehörigkeit und der Detektion des bestehenden Chimärismus sowie dessen Quantifizierung unter Anwendung einer Real-time-PCR. Vielmehr ermöglicht sie auch eine Aussage über die Genexpression der untersuchten Zelle zu machen. Dies ist insbesondere dann von Interesse, wenn geringe Zellzahlen von aus Gewebe isolierten Zellen zur Verfügung stehen. Die in dieser Arbeit etablierten Ansätze werden derzeit für eine Quantifizierung mittels real-time RCR weiterentwickelt und sollen mittelfristig insbesondere für Untersuchungen des Chimärismus von dermalen und epidermalen dendritischen Zellen der Haut und anderer Zielgewebe der GvHD verwendet werden.rn

Identifizierung und Charakterisierung von Zielantigenen alloreaktiver zytotoxischer T-Zellen mittels cDNA-Bank-Expressionsklonierung in akuten myeloischen Leukämien

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantationen (HSZTs) werden insbesondere zur Behandlung von Patienten mit Hochrisiko-Leukämien durchgeführt. Dabei bewirken T-Zellreaktionen gegen Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) sowohl den therapeutisch erwünschten graft-versus-leukemia (GvL)-Effekt als auch die schädigende graft-versus-host (GvH)-Erkrankung. Für die Identifizierung neuer mHAgs mittels des T-Zell-basierten cDNA-Expressionsscreenings waren leukämiereaktive T-Zellpopulationen durch Stimulation naïver CD8+-T-Lymphozyten gesunder HLA-Klasse I-identischer Buffy Coat-Spender mit Leukämiezellen von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) generiert worden (Albrecht et al., Cancer Immunol. Immunother. 60:235, 2011). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit diesen im AML-Modell des Patienten MZ529 das mHAg CYBA-72Y identifiziert. Es resultiert aus einem bekannten Einzelnukleotidpolymorphismus (rs4673: CYBA-242T/C) des Gens CYBA (kodierend für Cytochrom b-245 α-Polypeptid; syn.: p22phox), der zu einem Austausch von Tyrosin (Y) zu Histidin (H) an Aminosäureposition 72 führt. Das mHAg wurde von T-Lymphozyten sowohl in Assoziation mit HLA-B*15:01 als auch mit HLA-B*15:07 erkannt. Eine allogene T-Zellantwort gegen CYBA-72Y wurde in einem weiteren AML-Modell (MZ987) beobachtet, die ebenso wie in dem AML-Modell MZ529 polyklonal war. Insgesamt konnte bei drei von fünf getesteten HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern, die homozygot für CYBA-72H (H/H) waren, eine CYBA-72Y-spezifische T-Zellantwort generiert werden. Das von den T-Lymphozyten übereinstimmend in niedrigster Konzentration erkannte Peptid umfasste die Aminosäuren 69 - 77, wobei das homologe Peptid aus CYBA-72H auch in hohen Konzentrationen keine Reaktivität auslöste. Eine reziproke Immunogenität des mHAg ist bislang nicht belegt. T-Lymphozyten gegen CYBA-72Y erkannten Leukämiezellen bei acht von zwölf HLA-B*15:01-positiven Patienten (FAB-Subtypen: M1, M2, M4, M5). Da das Gen CYBA für eine Komponente des mikrobiziden Oxidasesystems von phagozytierenden Zellen kodiert, ist es überwiegend in Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert. Von Leukozytensubtypen, aufgereinigt aus HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern mit CYBA-242T-Allel, wurden Monozyten und daraus abgeleitete dendritische Zellen durch CYBA-72Y-reaktive T-Lymphozyten sehr stark, untransformierte B-Zellen in weit geringerem Maße und Granulozyten sowie T-Lymphozyten nicht erkannt. Das für CYBA-72Y kodierende Allel CYBA-242T wurde bei 56% aller getesteten gesunden Spender und Malignompatienten (n=481) nachgewiesen. Unter Berücksichtigung der Häufigkeit des präsentierenden HLA-Allels ist davon auszugehen, dass etwa 4,5% der Kaukasier das mHAg CYBA-72Y zusammen mit HLA-B*15:01 tragen. Nach bisherigen Beobachtungen führt ein immunogener CYBA-72Y-Mismatch bei allogenen HSZTs nicht notwendigerweise zu einer schweren GvH-Erkrankung. Das hier beschriebene mHAg CYBA-72Y erscheint potenziell geeignet, im Rahmen einer allogenen HSZT die präferenzielle Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss von myeloischen Leukämiezellen zu bewirken. Jedoch sind weiterführende Untersuchungen erforderlich, um die therapeutische Relevanz des Antigens zu belegen.

Identifizierung, Expression und Charakterisierung des Nanos-verwandten Proteins aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula

Im Rahmen dieser Arbeit konnte in dem marinen Schwamm Suberites domuncula ein Gen identifiziert werden, dessen C-terminale konservierte Domäne eine hohe Sequenzähnlichkeit zu den Zinkfingerdomänen der Nanos-Proteine aufweist. Weiter konnte ein N-terminales Sequenzmotiv identifiziert werden, das eine hohe Sequenzidentität zu den konservierten NIM Motiven (CNOT1-interagierendes-Motiv) von Nanos zeigt. Nach der Klonierung der cDNA erfolgte die Expression des als Sd_nrp bezeichneten Proteins in E. coli Bakterien, für dessen 231 Aminosäuren umfassende Polypeptidkette eine theoretische Molekülmasse von 25.8 kDa berechnet wurde. Anschließend gelang ein Nachweis des Proteins mithilfe eines polyklonalen, gegen Sd_nrp gerichteten Antikörpers in drei Gewebetypen, dem Pinacoderm, den Primmorphen (3D-Zellaggregate) und den Gemmulae (Dauerstadien der Schwämme). Dabei konnte die höchste Expression von Sd_nrp in den als totipotent geltenden Stammzellen der Schwämme, den Archaeocyten innerhalb der Gemmulae beobachtet werden. Die Identifizierung der Zellstrukturen, erfolgte dabei aufgrund morphologischer Vergleiche. Speziell die Merkmale der Zellen in den Gemmulae, der große Nukleus, die amöboide Form sowie die granulären Reservesubstanzen, entsprechen den typischen morphologischen Eigenschaften der Archaeocyten, und bestätigen die Interpretation der Ergebnisse. Weiter konnte mit Hilfe des Anti-Sd_nrp Antikörpers das native Protein in Proteinextrakten aus Gewebe adulter Tiere nachgewiesen werden. Die vergleichende Sequenzanalyse von Sd_nrp mit dem Nanos-verwandten Protein der Schwammspezies Ephydatia fluviatilis und die phylogenetische Stammbaum-Analyse mit Nanos-Homologen unterschiedlicher Invertebraten und Vertebraten lässt die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei dem hier identifizierten Protein Sd_nrp um ein Nanos-verwandtes Protein handelt. Darüber hinaus konnte anhand eines Homologiemodells bestätigt werden, dass es sich bei der konservierten C-terminalen Domäne des Proteins Sd_nrp um die für Nanos-Proteine spezifische Zinkfingerstruktur mit dem konservierten Sequenzmotiv CCHC handelt. Dieses Ergebnis konnte auch bei einem Vergleich der Zinkfingerdomäne von Sd_nrp mit den Zinkfingerdomänen der Nanos-Homologen unterschiedlicher Invertebraten- und Vertebratenspezies bestätigt werden.