Identifikation transkriptioneller Alterationen menschlicher Tumoren und Entwicklung eines neuen auf RNA-Transfer basierenden Verfahrens zur Bestimmung der Genfunktion

Zielvorgaben der vorliegenden Arbeit war die Identifikation neuer selektiv in Tumoren aktivierter Gene sowie die Entwicklung eines methodischen Prozesses, um die molekularen Effekte der fehlerhaften Aktivierung solcher Gene zu untersuchen. Für die erste Fragestellung haben wir zwei komplementäre Methoden entwickelt. Zum einen haben wir nach neuen Mitglieder der Cancer/Germline (CG) Familie von Genen gesucht, die bereits attraktive Zielstrukturen laufender Phase I/IIa Studien sind. Zu diesem Zweck wurde ein bioinformatischer Data Mining Ansatz generiert. Dieser führte zur erfolgreichen in silico Klonierung neuer CG Gene. Zur Identifikation von in Tumorzellen überexprimierten Genen nutzten wir einen cDNA Mikroarray mit 1152 ausgewählten Genen mit direkter oder indirekter tumorimmunologischer oder tumorbiologischer Relevanz. Die komparative transkriptionelle Untersuchung von humanen Tumor- und Normalgeweben mit diesem Array führte zur Wiederentdeckung bereits bekannter, aber auch zur Aufdeckung bisher nicht beschriebener tumor-assoziierter Transkriptionsveränderungen. Der zweite große Schwerpunkt dieser Arbeit war die Technologieentwicklung eines versatilen Prozesses zur Untersuchung von molekularen Effekten eines aberrant in Zellen exprimierten Gens. Zur Simulation dieser Situation stellten wir in vitro transkribierte RNA dieses Gens her und elektroporierten diese in Zielzellen. Transkriptionsanalysen solcher Transfektanden mit Affymetrix Oligonukleotid Mikroarray deckten auf gesamt-genomischer Ebene ganze Kaskaden konsekutiver, transkriptioneller Alterationen auf.

The objective of this doctoral thesis was the discovery of genes selectively activated in cancer cells, and the development of a technological process for the analysis of molecular effects of such an errateous gene activation. For the first objective two complementary methods were developed. For the one, we were interested in new members of the Cancer/Germline (CG) familie of genes, which are already attractive target candidates currently tested in Phase I/IIa studies. For this purpose we generated a bioinformatic data mining approach. This resulted in successful in silico cloning of novel CG genes. For the identification of genes overexpressed in tumor cells we resorted to a microarray representing 1152 genes, selected due to their direct or indirect tumorbiological or tumorimmunological relevance. The comparative transcriptional profiling of tumor and normal tissues with this array resulted not only in rediscover of known tumor-associated alterations but also in the identification of new ones. The second major objective of this project was the technological development of a versatile process for the analysis of molecular effects of such an aberrant expression of a defined gene. For simulation of this situation we generated in vitro transcribed RNA of this gene and electroporated it in cells. Transcriptional analysis of such transfectands with Affymetrix Oligonukleotid Mikroarray allowed mapping of entire cascades of consecutive transcriptional alterations.