Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium

'Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium: Klonierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Apoptose-Regulatoren der Porifera'. Auf der Suche nach der molekularbiologischen Grundlage der Apoptose in den Porifera, dem phylogenetisch ältesten Metazoen-Tierstamm, wurden Mitglieder der apoptoseregulatorischen Bcl?2 Familie unter Anwendung diverser Techniken im Schwamm G. cydonium identifiziert: GCBHP1 und GCBHP2. Detaillierte Analysen offenbarten Bcl-2-charakteristische Signaturen sowie eine durch apoptotische Stimuli induzierbare Expression. Die parallele HSP70-Induktion zeugte von der GCBHP2-Expression als Teil einer antiapoptotischen Streßantwort zum Schutz des Organismus'. Die kontinuierliche Transkription des im Rahmen dieser Arbeit gleichfalls klonierten Proliferationsmarkers SEP1 veranschaulichte zudem die Effektivität dieser Streßreaktion. Mit der Herstellung eines rekombinanten Proteins und der Gewinnung eines Antiserums konnte auch die streßinduzierte Proteinexpression des GCBHP2 verfolgt werden. Zum Zweck der Funktionsstudie wurden Säugetierzellen (HEK-293, NIH/3T3) mit einem GCBHP2-Konstrukt stabil transfiziert und auf die Expression des Schwammproteins untersucht. Diese Zellen unterschieden sich bereits phänotypisch von mock-transfizierten Zellen. Immunzytochemische Untersuchungen enthüllten eine für antiapoptotische Bcl-2 Proteine charakteristische Assoziation mit Mitochondrien. Unter dem Einfluß zweier apoptotischer Stimuli wurde für GCBHP2-transfizierte Zellen eine vierzehn-/sechsmal höhere Vitalität und eine reduzierte Aktivierung der Caspase-Kaskade registriert (im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen). Somit wurde der antiapoptotische Charakter des GCBHP2 und die Existenz apoptotischer Mechanismen in den Porifera bestätigt.

Untersuchungen von intrazellulären Signalwegen bei neuraler Determinierung und Differenzierung in vitro: Einfluß von GAP-43 und Bcl-2

Die PCC7-Mz1-Zellinie stellt ein geeignetes Modell dar, um frühe neurale Determinierungs- und Differenzierungsprozesse unter kontrollierten Bedingungen in vitro zu untersuchen. Aus pluripotenten Stammzellen entwickelt sich nach Behandlung mit dem Morphogen Retinsäure (RA) ein stabiles Muster aus Neuronen, Fibroblasten und Astroglia-Zellen. Parallel stirbt ein reproduzierbarer Anteil der Kultur apoptotisch. Zur näheren Aufklärung der molekularen Vorgänge während der neuralen Entwicklung wurde der Einfluß von zwei Schlüsselmolekülen - dem Proteinkinase C Substrat (PKC) GAP-43 sowie dem antiapoptotischen Bcl-2 Protein - auf die neurale Differenzierung und die damit assoziierten Apoptoseereignisse der PCC7-Mz1-Zellen untersucht. Dazu wurden stabile Zellinien, die eine Überexpression von GAP-43 bzw. von Bcl-2 aufwiesen, hergestellt. GAP-43In PCC7-Mz1-Zellen wurde die Expression von GAP-43 sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene innerhalb von 24 Stunden nach Zugabe von RA hochreguliert. GAP-43 war bereits in noch proliferierenden neuronalen Vorläuferzellen als Substrat für PKC und als Interaktionspartner von Calmodulin funktionell. Die Überexpression von GAP-43 in PCC7-Mz1-Zellen förderte die Ausprägung des neuronalen Phänotyps. Das Differenzierungspotential der Mz-GAP-43 Klone war eingeschränkt, da sich nach Induktion mit RA aus den Stammzellen nur noch Neurone, aber keine Fibroblasten und Astroglia-Zellen mehr entwickelten. Die Determinierung für das neuronale Entwicklungsschicksal war in den Mz-GAP-43 Klonen stärker fortgeschritten als in MzN-Klonen, die durch Subklonierung aus PCC7-Mz1-Zellen generiert wurden, da die GAP-43 überexprimierenden Zellen durch Wachstum auf Laminin nicht in den pluripotenten Phänotyp revertiert werden konnten. Aufgrund der Interaktion zwischen GAP-43 und Calmodulin in Stammzellen der Mz-GAP-43 Klone kann man vermuten, daß die neuronalen Determinierungsprozesse über Ca2+/Calmodulin-abhängige Signalwege verlaufen. Da das Gen für den Transkriptionsfaktor NCNF (

Untersuchungen zur Rolle des BH3-only-Proteins Bid bei der Stress-induzierten Apoptose in Karzinomzelllinien

Als BH3-only Protein gehört Bid zu den proapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2 Familie, die während der Apoptose die Freisetzung Caspase-aktivierender Proteine aus den Mitochondrien kontrollieren. Bid zählt zu den potentesten BH3-only Proteinen und wird von vielen transformierten und nichttransformierten Zellen konstitutiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, Bid durch RNA-Interferenz stabil zu depletieren, um Bid-abhängige Apoptosewege in HeLa Zervixkarzinomzellen zu identifizieren, die von intrinsischen Stressstimuli sowie von konventionellen und neuartigen Chemotherapeutika induziert werden. Da Bid im Todesrezeptor-vermittelten Signalweg der Apoptose durch Caspase-8 gespalten und aktiviert wird, waren die Bid-depletierten Zellen signifikant vor der Fas/CD95-, TRAIL- oder TNF-α-induzierten Apoptose geschützt und zeigten nach Exposition mit allen drei Todesrezeptorliganden eine drastisch reduzierte Effektorcaspase-Aktivität und eine höhere Proliferationsrate als die Kontrollzellen. Eine ektopische Bidexpression in Bid knock down (kd) Zellen hob die Protektion vor der Fas- und TRAIL-induzierten Apoptose auf. Der Proteasominhibitor Epoxomicin, der Proteinkinase-Inhibitor Staurosporin oder die ER Stress-induzierenden Agenzien Tunicamycin, Thapsigargin und Brefeldin A lösten hingegen einen Bid-unabhängigen Zelltod aus. Allerdings konnten subletale Tunicamycin- oder Thapsigarginkonzentrationen HeLa Zellen für die TRAIL-induzierte Apoptose sensitivieren. Da der Synergieeffekt auf einer ER Stress-vermittelten Amplifizierung des Todesrezeptorwegs beruhte, zu der eine Tunicamycin-induzierte Steigerung der Expression des Todesrezeptors DR5 signifikant beitrug, erfolgte diese Sensitivierung nur in Bid-profizienten Zellen. Bid war in HeLa Zellen außerdem an der apoptotischen Signalkaskade beteiligt, die von den DNA-schädigenden Agenzien Etoposid, Doxorubicin und Oxaliplatin (Oxa) ausgelöst wird. Nach Behandlung mit Oxa zeigten die Bid kd Zellen eine verzögerte Caspase-2, -3, -8 und -9 Aktivierung, einen geringeren Verlust des mitochondrialen Membranpotentials sowie eine reduzierte Apoptose- und eine höhere Proliferationsrate als Bid-profiziente Zellen. Neben Bid war ein weiteres BH3-only Protein, Puma, an der Oxa-induzierten Effektorcaspase-Aktivierung beteiligt, da eine Puma-spezifische siRNA unabhängig vom Bidstatus der Zellen antiapoptotisch wirkte. Im letzten Teil der Arbeit wurde untersucht, welche Proteasen für die durch gentoxische Agenzien induzierte Spaltung und Aktivierung von Bid verantwortlich sind. Obwohl Caspasen für die Exekutionphase der Oxa-induzierten Apoptose notwendig waren, trugen sie weder zur initialen Bidaktivierung noch zur mitochondrialen Depolarisierung bei, da sie erst postmitochondrial aktiviert wurden. Konventionelle Calpaine hingegen wurden nach DNA-Schädigung bereits stromaufwärts der Mitochondrien aktiviert und der Calpaininhibitor Calpeptin reduzierte nicht nur die Bid- und Caspasespaltung, sondern auch die mitochondriale Depolarisierung signifikant. Diese Protektion durch Calpeptin fiel in Bid-depletierten Zellen signifikant geringer als in Bid-profizienten Kontrollzellen aus. Auch war in Oxa-behandelten Bid kd Zellen, die eine durch Caspase-2, -3 und -8 nicht spaltbare Bidmutante exprimierten, trunkiertes Bid nachweisbar, dessen Generierung durch Calpain-, aber nicht durch Caspaseinhibierung verhindert werden konnte. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine Calpain-abhängige Bidaktivierung stromaufwärts der Mitochondrien hin und zeigen, dass die BH3-only Proteine Bid und Puma wichtige Vermittler der Oxa-induzierten Apoptose in HeLa Zellen darstellen.

Study of 3 Lambda H and 4 Lambda H in the reaction of 6 Li + 12 C at 2 A GeV

Die Produktion von Hyperkernen wurde in peripheren Schwerionenreaktionen untersucht, bei denen eine Kohlenstofffolie mit $^6$Li Projektilen mit einer Strahlenergie von $2 A$~GeV bestrahlt wurde. Es konnten klare Signale f{"{u}}r $Lambda$, $^3_{Lambda}$H, $^4_{Lambda}$H in deren jeweiligen invarianten Massenverteilungen aus Mesonenzerfall beobachtet werden.rnrnIn dieser Arbeit wird eine unabh{"{a}}ngige Datenauswertung vorgelegt, die eine Verifizierung fr"{u}herer Ergebnisse der HypHI Kollaboration zum Ziel hatte. Zu diesem Zweck wurde eine neue Track-Rekonstruktion, basierend auf einem Kalman-Filter-Ansatz, und zwei unterschiedliche Algorithmen zur Rekonstruktion sekund"{a}rer Vertices entwickelt.rn%-Rekonstruktionsalgorithmen .rnrnDie invarianten Massen des $Lambda$-Hyperon und der $^3_{Lambda}$H- und $^4_{Lambda}$H-Hyperkerne wurden mit $1109.6 pm 0.4$, $2981.0 pm 0.3$ und $3898.1 pm 0.7$~MeV$/c^2$ und statistischen Signifikanzen von $9.8sigma$, $12.8sigma$ beziehungsweise $7.3sigma$ bestimmt. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse stimmen mit der fr{"{u}}heren Auswertung {"{u}}berein.rnrnDas Ausbeutenverh{"{a}}ltnis der beiden Hyperkerne wurde als $N(^3_{Lambda}$H)/$N(^4_{Lambda}$H)$ sim 3$ bestimmt. Das deutet darauf hin, dass der Produktionsmechanismus f{"{u}}r Hyperkerne in Schwerionen-induzierten Reaktionen im Projektil-Rapidit{"{a}}tsbereich nicht allein durch einen Koaleszenzmechanismus beschrieben werden kann, sondern dass auch sekund{"{a}}re Pion-/Kaon-induzierte Reaktionen und Fermi-Aufbruch involviert sind.rn

Untersuchungen zum Mechanismus der Zytotoxizität von alkylierenden Agenzien in malignen Melanomzellen

Maligne Melanome sind gegenüber Chemotherapeutika relativ resistent. Das methylierende Alkylanz Temozolomid sowie das chlorethylierende und DNA-Interstrand Crosslink (ICL) bildende Alkylanz Fotemustin kommen bei der Behandlung des malignen Melanoms als Mittel erster Wahl zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal nachgewiesen werden, dass die zytotoxische Wirkung von Temozolomid und Fotemustin in Melanomzellen durch Apoptose vermittelt wird. Unter Verwendung klinisch relevanter Dosen der beiden Alkylantien konnte die Induktion von Apoptose durch vier unabhängige Methoden (Bestimmung der SubG1-Fraktion und der Apoptose- / Nekrose-Frequenz, Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 sowie Spaltung von PARP-1) nachgewiesen werden. Die Alkylierungen an der O6-Position des Guanins, welche durch beide Agenzien induziert werden, sind auch in Melanomzellen die wichtigsten Zytotoxizität-bewirkenden Läsionen in der DNA, und die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist folglich ein herausragender Resistenzmarker. Eine der verwendeten Zelllinien (D05) exprimierte p53-Wildtypprotein. Diese Zelllinie war resistenter als alle anderen Zelllinien gegenüber Temozolomid und Fotemustin. Dies weist darauf hin, dass p53 nicht die Apoptoseinduktion in Melanomzellen verstärkt. Die Prozessierung des O6MeG erfolgt über die Mismatch-Reparatur (MMR) unter Generierung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs). Die Untersuchung der durch Temozolomid induzierten DSBs, nachgewiesen durch gammaH2AX-Induktion, korrelierte direkt mit der apoptotischen Antwort von Melanomzelllinien und DSBs können somit als eine entscheidende apoptoseauslösende Größe angesehen werden. Eine Resistenz gegenüber dem methylierenden Temozolomid in der Zelllinie MZ7 konnte auf einen Defekt in der MMR-Schadenserkennung auf der Ebene des MutSalpha-Komplexes zurückgeführt werden. Dieser Defekt hatte keinen Einfluss auf die Fotemustin-vermittelte Apoptoseinduktion. Neben MGMT konnte somit die MMR als Resistenzfaktor gegenüber methylierenden Agenzien in Melanomen identifiziert werden. Die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde in Melanomzelllinien im Detail untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Fotemustin-bedingte ICLs in Zellen einen G2/M-Arrest im Behandlungszyklus induzieren. Wie anhand G1-arretierter Zellen nachgewiesen werden konnte, war das Durchlaufen der DNA-Replikation vor Erreichen des Arrests für die Induktion der Apoptose notwendig. Die Prozessierung von ICLs ist im Vergleich zu Methylierungen der DNA deutlich komplexer. Dies könnte erklären, warum in Melanomzellen die durch gammaH2AX-Induktion repräsentierten DSBs nicht mit der Sensitivität der einzelnen Zelllinien korreliert. Die Untersuchung unterschiedlich sensitiver Zelllinien zeigte ein vergleichbares Schadensniveau an ICLs und eine ebenso vergleichbare initiale Prozessierung derselben unter Generierung von DSBs. Die Prozessierung dieser sekundären Läsionen, welche anhand der Abnahme von gammaH2AX-Foci untersucht wurde, war hingegen in der sensitiveren Melanomzelllinie deutlich weniger effektiv. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass eine uneffektive Prozessierung der sekundären Läsionen einhergeht mit einer verstärkten und länger anhaltenden Aktivierung der in der DSB-Detektion beteiligten Kinase ATM und der Checkpoint Kinase 1. Es wäre daher denkbar, dass eine verstärkte Aktivität dieser Kinasen proapoptotische Signale vermittelt. Unterschiede in der Prozessierung der sekundären Läsionen könnten somit ein wichtiger Marker der ICL-induzierten Apoptose darstellen. Des weitern konnte nachgewiesen werden, dass nach Fotemustingabe die mitochondrial-vermittelte Apoptose einen effektiven Exekutionsweg in Melanomen darstellt. Während Cytochrom C-Freigabe, Bcl-2-Abnahme an den Mitochondrien, Bax-Rekrutierung und Caspase-9 Aktivität nachgewiesen werden konnten, wurden keine Hinweise auf eine Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose gefunden. Die Unfähigkeit, Rezeptor-vermittelte Apoptose zu unterlaufen, könnte die Bedeutungslosigkeit des p53-Gens in Melanomen begründen, da gerade dieser Weg in der Alkylantien-induzierten Apoptose in anderen Zellsystemen eine große Relevanz besitzt. Bei der Suche nach einem alternativen proapoptotischen Signalweg konnten Hinweise für die Beteiligung des Rb/E2F-1-Wegs, welcher über p73 agiert, in einer p53-mutierten Melanomzelllinie gefunden werden. Einen Einfluss der Proteine Survivin und XIAP als Resistenzfaktoren auf die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde hingegen nicht nachgewiesen.

Functional characterization of modified vaccinia virus Ankara-encoded anti-apoptotic proteins

Candidate vaccines based on the highly attenuated orthopoxvirus strain MVA are tested against various infectious and cancer diseases and, more profound, vaccines based on wildtype and recombinant viruses have been found safe and immunogenic in clinical trials. Compared to conventional vaccine strains, MVA lacks many functional genes for potentially important regulators of virus-host interactions. However, some gene functions responsible for counteraction of cellular antiviral pathways are still conserved in the genome of MVA and the inhibition of apoptosis seems to be one important mechanism, the virus is still able to interact with.rnrnVaccinia viruses encode several proteins which prevent the induction of virus-induced apoptosis. The vaccinia virus anti-apoptotic protein F1 was shown to counteract the activation of the mitochondrial pathway of apoptosis in a highly effective manner. Another vaccinia virus protein, N1, like F1 shows structural and functional similarity to members of the cellular anti-apoptotic bcl-2 family and was also shown to inhibit apoptosis. The vaccinia virus early protein E3 inhibits programmed cell death by binding to and sequestration of dsRNA molecules, normally inducing cellular antiviral pathways also driving the induction of apoptosis. All three anti-apoptotic genes were functionally analyzed during this work.rn

Control of protein degradation pathways by BAG proteins and changes during aging

Many age-related neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, amyotrophic lateral sclerosis and polyglutamine disorders, including Huntington’s disease, are associated with the aberrant formation of protein aggregates. These protein aggregates and/or their precursors are believed to be causally linked to the pathogenesis of such protein conformation disorders, also referred to as proteinopathies. The accumulation of protein aggregates, frequently under conditions of an age-related increase in oxidative stress, implies the failure of protein quality control and the resulting proteome instability as an upstream event of proteinopathies. As aging is a main risk factor of many proteinopathies, potential alterations of protein quality control pathways that accompany the biological aging process could be a crucial factor for the onset of these disorders.rnrnThe focus of this dissertation lies on age-related alterations of protein quality control mechanisms that are regulated by the co-chaperones of the BAG (Bcl-2-associated athanogene) family. BAG proteins are thought to promote nucleotide exchange on Hsc/Hsp70 and to couple the release of chaperone-bound substrates to distinct down-stream cellular processes. The present study demonstrates that BAG1 and BAG3 are reciprocally regulated during aging leading to an increased BAG3 to BAG1 ratio in cellular models of replicative senescence as well as in neurons of the aging rodent brain. Furthermore, BAG1 and BAG3 were identified as key regulators of protein degradation pathways. BAG1 was found to be essential for effective degradation of polyubiquitinated proteins by the ubiquitin/proteasome system, possibly by promoting Hsc/Hsp70 substrate transfer to the 26S proteasome. In contrast, BAG3 was identified to stimulate the turnover of polyubiquitinated proteins by macroautophagy, a catabolic process mediated by lysosomal hydrolases. BAG3-regulated protein degradation was found to depend on the function of the ubiquitin-receptor protein SQSTM1 which is known to sequester polyubiquitinated proteins for macroautophagic degradation. It could be further demonstrated that SQSTM1 expression is tightly coupled to BAG3 expression and that BAG3 can physically interact with SQSTM1. Moreover, immunofluorescence-based microscopic analyses revealed that BAG3 co-localizes with SQSTM1 in protein sequestration structures suggesting a direct role of BAG3 in substrate delivery to SQSTM1 for macroautophagic degradation. Consistent with these findings, the age-related switch from BAG1 to BAG3 was found to determine that aged cells use the macroautophagic system more intensely for the turnover of polyubiquitinated proteins, in particular of insoluble, aggregated quality control substrates. Finally, in vivo expression analysis of macroautophagy markers in young and old mice as well as analysis of the lysosomal enzymatic activity strongly indicated that the macroautophagy pathway is also recruited in the nervous system during the organismal aging process.rnrnTogether these findings suggest that protein turnover by macroautophagy is gaining importance during the aging process as insoluble quality control substrates are increasingly produced that cannot be degraded by the proteasomal system. For this reason, a switch from the proteasome regulator BAG1 to the macroautophagy stimulator BAG3 occurs during cell aging. Hence, it can be concluded that the BAG3-mediated recruitment of the macroauto-phagy pathway is an important adaptation of the protein quality control system to maintain protein homeostasis in the presence of an enhanced pro-oxidant and aggregation-prone milieu characteristic of aging. Future studies will explore whether an impairment of this adaptation process may contribute to age-related proteinopathies.

Die Rolle des anti-apoptotischen Proteins Mcl-1 für die Leber und das hepatozelluläre Karzinom

Myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) ist ein anti-apoptotisches Mitglied der Bcl-2-Proteinfamilie. Als solches ist es in der Lage, die mitochondriale Aktivierung während der Apoptose zu hemmen. Dadurch schützt es Zellen bei zellulärem Stress (wie z.B. Differenzierung, Proliferation oder Virusinfektion) vor Apoptoseinduktion. Aufgrund dieser Eigenschaft ist es unabkömmlich während der Embryogenese und in verschiedenen hämatopoetischen Zellpopulationen. Des Weiteren ist Mcl-1 als Protoonkogen in verschiedenen humanen Tumorentitäten verstärkt exprimiert und kann so zu einer verminderten Apoptosesensitivität von Tumorzellen beitragen. Auch primäre humane Hepatozyten können nach Mcl-1-Induktion durch Wachstumsfaktorbehandlung gegenüber CD95-vermittelter Apoptose geschützt werden. Daher sollte untersucht werden, welche Bedeutung Mcl-1 im hepatozellulären Karzinom (HCC) und in der gesunden Leber einnimmt. Hierzu wurde zunächst humanes HCC-Gewebe hinsichtlich der Expression von Mcl-1 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Mcl-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene in HCC-Gewebe verstärkt exprimiert ist im Vergleich zu benachbartem Normalgewebe. Auch in verschiedenen HCC-Zelllinien konnte eine starke Mcl-1-Expression nachgewiesen werden. Diese war vor allem über den PI3K/Akt-Signalweg reguliert. Eine Hemmung dieses Signalwegs führte zu einer Reduktion der Mcl-1-Expression und so zu einer Sensitivierung der Zellen gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika und zielgerichteten Therapien. Des Weiteren wurde die Mcl-1-Expression spezifisch durch RNA-Interferenz gehemmt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass Zellen mit unterdrückter Mcl-1-Expression deutlich sensitiver gegenüber verschiedenen Apoptose-induzierenden Substanzen reagierten. Eine kombinierte Hemmung der Mcl-1-Expression und der PI3-Kinase führte schließlich zu einer nochmals verstärkten Sensitivierung. Im Gegensatz dazu führte eine Überexpression von Mcl-1 zu einer Hemmung der Apoptoseinduktion. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine Mauslinie etabliert, welche spezifisch in Hepatozyten kein Mcl-1 exprimiert, um so die Bedeutung von Mcl-1 für die Leber in vivo zu untersuchen. Es zeigte sich, dass Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäuse bereits im Alter von acht Wochen eine verminderte Lebergröße aufweisen. Dies wurde verursacht durch spontane Apoptoseinduktion in den Mcl-1 negativen Hepatozyten. Hierdurch kam es zu einer Leberschädigung, ersichtlich durch erhöhte Transaminasenwerte, erhöhte Caspase-3-Aktivierung, und Schädigung der Gewebsstruktur. Zudem war als kompensatorischer Effekt die Zellproliferation erhöht, ohne dass sich jedoch das Lebergewicht an das von Kontrolltieren anglich. Interessanterweise kam es in Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäusen als Folge der chronischen Leberschädigung zur Entwicklung einer Leberfibrose, ersichtlich durch eine verstärkte Collageneinlagerung. Weiterhin reagierten Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäuse wesentlich empfindlicher gegenüber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose. Diese Daten zeigen zum einen, dass Mcl-1 zur Apoptoseresistenz von HCC-Zellen beitragen kann. Zielgerichtete Therapien, welche die Expression von Mcl-1 hemmen, könnten folglich für die Therapie des HCCs von Interesse sein. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Mcl-1 ein zentraler anti-apoptotischer Faktor für Hepatozyten in vivo ist.

DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität

DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Entstehung von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien sowie den zytotoxischen Auswirkungen, die DNA-Doppelstrangbrüche für die Säuger-Zelle haben. Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Mechanismen untersucht, die am O6-Methylguanin (O6-MeG)-DNA-Schaden, hervorgerufen durch alkylierende Agenzien, ablaufen. Dabei konnte gezeigt werden, das O6-Methylguanin DNA-Methyltransferase (MGMT) O6-MeG/C und O6-MeG/T in vitro mit gleicher Effizienz repariert und daß die Reparatur von O6-MeG nach dem ersten Zellzyklus protektive Auswirkung auf das zelluläre Überleben hat. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit stand die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien in Mausfibroblasten und CHO-Zellen im Mittelpunkt. Mit Hilfe der Einzelzellgelelektrophorese (SCGE, Comet Assay) wurde gezeigt, daß alkylierende Substanzen und die durch Elektroporation in Zellen hineingebrachten Restriktionsenzyme PvuII und EcoRI DNA-Doppelstrangbrüche zu induzieren vermögen. Die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen nach Elektroporation von PvuII war vom p53-Status der Zellen abhängig, da p53-defiziente Zellen im Gegensatz zu p53-profizienten Zellen höhere DNA-Doppelstrangbruchraten über einen längeren Zeitraum aufwiesen. Im dritten Teil wurden die physiologischen Auswirkungen einer Behandlung von Zellen mit Induktoren von DNA-Doppelstrangbrüchen untersucht. Es wurde gezeigt, daß Alkylanzien in Abhängigkeit vom Vorhandensein von MGMT Apoptose induzieren. Mit PvuII elektroporierte p53-knockout Mausfibroblasten zeigten infolgedessen und im Gegensatz zu p53-wildtyp Zellen hohe Apoptoseraten. Die Induktion der Apoptose nach Behandlung mit PvuII wie auch nach g-Bestrahlung ging einher mit einem Abfall der Proteinmenge des antiapoptotischen Bcl-2. Zusammengenommen weisen die Versuchsergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß nach Behandlung von Zellen mit O6-MeG-generierenden Agenzien wie auch nach g-Bestrahlung DNA-Doppelstrangbrüche das ultimative Signal darstellen können.

Messung des Wirkungsquerschnitts der Reaktion d(e,e'p)n für fehlende Impulse bis 950 MeV/c und Trennung der longitudinalen und transversalen Reaktionsanteile für fehlende Impulse bis 350 MeV/c

Die Dreispektrometeranlage der A1-Kollaboration am MainzerElektronenbeschleuniger MAMI wurde im Rahmen dieser Arbeitverwendet, um die Elektrodisintegration des Deuteronsmit Hilfe der Reaktion d(e,e'p)n zu untersuchen. Im ersten Teil der Untersuchungen wurde die longitudinaleund transversale Strukturfunktion aus denWirkungsquerschnitten extrahiert. Die Zentralwerte derkinematischen Parameter waren dabei wie folgt eingestellt:1) Der Impulsübertrag wurde für alle Messungen auf 450 MeV/c festgelegt.2) Das Proton wurde in Richtung des Impulsübertrags nachgewiesen (parallele Kinematik).3) Vier Einstellungen des Energieübertrags, und damit korrespondierend des fehlenden Impulses, wurden gemessen: Energieübertrag / MeV : 128, 226, 289, 360. Fehlender Impuls / (MeV/c): 50, 200, 275, 350.4) Für jede dieser vier Kinematiken wurden mindestens drei verschiedene Einschußenergien bzw. Elektronenstreuwinkel eingestellt, um die Strukturfunktionen mit Hilfe der Rosenbluth-Separation zu bestimmen. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurde derWirkungsquerschnitt für hohe fehlende Impulse bestimmt.Dessen Zentralwerte wurden von 30 MeV/c bis 906 MeV/cvariiert, wobei für die hohen fehlenden Impulse das Protonweit außerhalb der Richtung des Impulsübertragesnachzuweisen war. Der Energieübertrag lag dabei zwischen180 MeV und 600 MeV und der Impulsübertrag zwischen608 MeV/c und 698 MeV/c.

Mechanismus der Apoptose, Gentoxizität und DNA-Reparatur in Herpesvirus-Thymidinkinase-exprimierenden Säugerzellen nach Behandlung mit Antiherpes-Virustatika vom Typ der Nukleosidanaloga

Um Cytotoxizität und Gentoxizität nukleosidischer Antiherpes-Virustatika zu untersuchen, wurden stabile CHO-Klone etabliert, die Thymidinkinase (TK) des Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-TK) oder des Varicella zoster-Virus (VZV-TK) exprimieren. In HSV-TK-exprimierenden Zellen wurde das Purinanalogon Ganciclovir (GCV) effizient in die genomische DNA eingebaut, worauf in den nächsten Replikationsrunden DNA-Strangbrüche und Aberrationen entstehen und Apoptose ausgelöst wird. GCV-induzierte Apoptose wird hauptsächlich über den mitochondrialen Weg vermittelt, wobei das anti-apoptotische Protein Bcl-2 im Mittelpunkt steht. Nach GCV-Behandlung konnte eine Caspase-9-vermittelte post-translationale Spaltung von Bcl-2 nachgewiesen werden. Das 23 kDa-großes Bcl-2-Fragment wirkt im Gegensatz zum intakten Bcl-2-Protein pro-apoptotisch und verstärkt die Cytochrom C-Freisetzung und damit die Aktivierung der Caspase-9, die Bcl-2 spaltet, was zu einem positiven 'Amplifikationsloop' des mitochondrialen apoptotischen Weges führt. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß in die DNA inkorporiertes GCV durch Basenexzisionsreparatur repariert wird, wobei die DNA-Polymerase ß eine entscheidende Rolle spielt. Diese Reparatur führte zu einer signifikanten Reduktion der Apoptose und Klastogenität und damit zur Resistenzsteigerung gegenüber GCV. In VZV-TK-exprimierenden Zellen wurde gezeigt, daß Brivudin (BVDU), gleichermaßen Apoptose und Nekrose induzierte. Für die BVDU-induzierte Cytotoxizität konnte die Hemmung der Thymidylatsynthetase als Ursache identifiziert werden. Im Gegensatz zur GCV-induzierten Apoptose war für die BVDU-induzierte Apoptose der Rezeptor (Fas/CD95/APO-1)-vermittelte Weg von vorrangiger Bedeutung.

Präparation, Charakterisierung und elektronische Eigenschaften von dünnen Schichten des Hochtemperatursupraleiters HgReBa 2 Ca n-1 Cu n O y

Ziel dieser Arbeit war die Pr"{a}paration, Charakterisierung und Untersuchung der elektronischen Eigenschaften von d"{u}nnen Schichten des Hochtemperatursupraleiters HgReBa$_{2}$Ca$_{n-1}$Cu$_{n}$O$_{y}$, die mittels gepulster Laser-Deposition hergestellt wurden. Die HgRe1212-Filme zeigen in der AC-Suszeptibilit"{a}t einen scharfen "{U}bergang in die supraleitende Phase bei 124 K mit einer "{U}bergangsbreite von 2 K. Die resistiven "{U}berg"{a}nge der Proben wurden mit zunehmender St"{a}rke des externen Magnetfeldes breiter. Aus der Steigung der Arrheniusplots konnte die Aktivierungsenergie f"{u}r verschiedene Feldst"{a}rken bestimmt werden. Weiterhin wurde die Winkelabh"{a}ngigkeit des Depinning-Feldes $B_{dp}(theta)$ der Filme gemessen. Hieraus wurde ein Anisotropiewert von $gamma$ = 7.7 bei 105 K ermittelt. Dies ist relevant, um den f"{u}r Anwendungen wichtigen Bereich im $T$-$B$-$theta$-Phasenraum des Materials absch"{a}tzen zu k"{o}nnen. Die kritische Stromdichte $J_{c}$ der d"{u}nnen Filme aus HgRe-1212 wurde mit Hilfe eines SQUID-Magnetometers gemessen. Die entsprechenden $M$-$H$ Kurven bzw. das magnetische Moment dieser Filme wurde f"{u}r einen weiten Temperatur- und Feldbereich mit einem magnetischen Feld senkrecht zum Film aufgenommen. F"{u}r einen HgRe-1212-Film konnte bei 5 K eine kritische Stromdichte von 1.2 x 10$^{7}$ A/cm$^{2}$ und etwa 2 x 10$^{6}$ A/cm$^{2}$ bei 77 K ermittelt werden. Es wurde die Magnetfeld- und die Temperaturabh"{a}ngigkeit des Hall-Effekts im normalleitenden und im Mischzustand in Magnetfeldern senkrecht zur $ab$-Ebene bis zu 12 T gemessen. Oberhalb der kritischen Temperatur $T_{c}$ steigt der longitudinale spezifische Widerstand $rho_{xx}$ linear mit der Temperatur, w"{a}hrend der spezifische Hall-Widerstand $rho_{yx}$ sich umgekehrt proportional zur Temperatur "{a}ndert. In der N"{a}he von $T_{c}$ und in Feldern kleiner als 3 T wurde eine doppelte Vorzeichen"{a}nderung des spezifischen Hall-Widerstandes beobachtet. Der Hall-Winkel im Normalzustand, cot $theta_{H}= alpha T^{2} + beta$, folgt einer universellen $textit{T }^{2}$-Abh"{a}ngigkeit in allen magnetischen Feldern. In der N"{a}he des Nullwiderstand-Zustandes h"{a}ngt der spezifische Hall-Widerstand $rho_{yx}$ "{u}ber ein Potenzgesetz mit dem longitudinalen Widerstand $rho_{xx}$ zusammen. Das Skalenverhalten zwischen $rho_{yx}$ und $rho_{xx}$ weist eine starke Feld-Abh"{a}ngigkeit auf. Der Skalenexponent $beta$ in der Gleichung $rho_{yx}$ =A $rho_{xx}^{beta}$ steigt von 1.0 bis 1.7, w"{a}hrend das Feld von 1.0 bis 12 T zunimmt.

Der Einfluss der regulierten Expression der onkogenen Kinase PKB,Akt auf die T-Zell-vermittelte Tumorabstoßung

Eine wesentliche Voraussetzung für die maligne Transformation von Zellen ist die Inaktivierung des programmierten Zelltodes (Apoptose). Die dabei erworbenen Defekte der Apoptose-Signalwege führen häufig zu Resistenzen gegenüber Radio- und Chemotherapien. Immuntherapeutische Ansätze haben zum Ziel, solche resistenten Tumorzellen spezifisch zu entfernen. Resistenzen gegenüber Immuntherapien können wiederum in einer gestörten Immunerkennung der Tumorzellen oder deren Resistenz gegenüber Immuneffektormechanismen begründet sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu überprüfen, ob durch Proteinkinase B (PKB)/Akt Immunresistenz vermittelt werden kann. Hierbei zeigte sich, dass die Aktivierung des PKB/Akt-Signalweges in Tumorzellen einen deutlichen Schutz gegenüber verschiedenen Apoptosestimuli in vitro vermittelt. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt hemmte sowohl die pharmakologisch, als auch die durch ZTL induzierte Apoptose-Signalkaskade über eine posttranskriptionelle Stabilisierung des anti-apoptotischen Proteins MCL-1. Diese Beobachtung konnte auch in einem murinen Tumorimmuntherapiemodell in vivo bestätigt werden. Unstimulierte Splenozyten von C57Bl/6-Mäusen wurden adoptiv in NOD/SCID-Mäuse mit etablierten, PKB/Akt-exprimierenden, murinen Fibrosarkomen transferiert. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt inhibierte den tumorsuppressiven Effekt dieser transplantierten Splenozyten signifikant. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die PKB/Akt-abhängige Immunresistenz auch in vivo durch anti-apoptotisches MCL-1 vermittelt wird. PKB/Akt-exprimierende Fibrosarkome mit supprimierter endogener MCL-1-Expression verloren ihre Resistenz gegenüber der durch adoptiven Splenozytentransfer vermittelten Tumorsuppression. Dies bestätigte endogenes MCL-1 als entscheidenden Faktor der PKB/Akt-vermittelten Immunresistenz. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung der PKB/Akt-induzierten Signaltransduktion auf der Ebene der nachgeschalteten Kinase mTOR etablierte Fibrosarkome gegenüber adoptiver Lymphozytentherapie sensitiviert. Der mTOR-Inhibitor Rapamycin verhinderte die PKB/Akt-induzierte Aufregulation von MCL-1 und die damit einhergehende Resistenzentwicklung in vivo. Zusammengefasst wurde erstmalig gezeigt, dass eine Deregulation des PKB/Akt-Signalweges Resistenz gegenüber immunologischer Tumorsuppression vermitteln kann. PKB/Akt stellt somit ein entscheidendes Zielmolekül für die Verbesserung von Krebsimmuntherapien dar.

Using sulfur isotope fractionation to understand the atmospheric oxidation of SO 2

Sulfate aerosol plays an important but uncertain role in cloud formation and radiative forcing of the climate, and is also important for acid deposition and human health. The oxidation of SO2 to sulfate is a key reaction in determining the impact of sulfate in the environment through its effect on aerosol size distribution and composition. This thesis presents a laboratory investigation of sulfur isotope fractionation during SO2 oxidation by the most important gas-phase and heterogeneous pathways occurring in the atmosphere. The fractionation factors are then used to examine the role of sulfate formation in cloud processing of aerosol particles during the HCCT campaign in Thuringia, central Germany. The fractionation factor for the oxidation of SO2 by ·OH radicals was measured by reacting SO2 gas, with a known initial isotopic composition, with ·OH radicals generated from the photolysis of water at -25, 0, 19 and 40°C (Chapter 2). The product sulfate and the residual SO2 were collected as BaSO4 and the sulfur isotopic compositions measured with the Cameca NanoSIMS 50. The measured fractionation factor for 34S/32S during gas phase oxidation is αOH = (1.0089 ± 0.0007) − ((4 ± 5) × 10−5 )T (°C). Fractionation during oxidation by major aqueous pathways was measured by bubbling the SO2 gas through a solution of H2 O2

Rolle der FOS-Proteine und des MAPK-Signallings in der Regulation der zellulären Antwort auf genotoxischen Stress

Die mittlere Überlebenszeit nach Erkennung eines Glioblastoms ohne Behandlung liegt bei 3 Monaten und kann durch die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) auf etwa 15 Monate gesteigert werden. Neben TMZ sind die chlorethylierenden Nitrosoharnstoffe die meistversprechendsten und am häufigsten eingesetzten Chemotherapeutika in der Gliomtherapie. Hier liegt die mittlere Überlebenszeit bei 17,3 Monaten. Um die Therapie des Glioblastoms noch effektiver zu gestalten und Resistenzen zu begegnen, werden unterschiedlichste Ansätze untersucht. Eine zentrale Rolle spielen hierbei das activator protein 1 (AP-1) und die mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK), deren Funktion in bisherigen Arbeiten noch unzureichend beleuchtet wurde.rnBesonders mit der Rolle des AP-1-bildenden Proteins FRA-1 in der Therapie des Glioblastoms haben sich bisher nur wenige Arbeiten beschäftigt, weshalb im ersten Teil der vorliegenden Arbeit dessen Funktion in der Regulation der Chemosensitivität gegenüber dem chlorethylierenden Agenz ACNU genauer untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die FRA 1-Expression durch Behandlung mit ACNU induziert wird. Die Induktion erfolgte über die beiden MAPKs ERK1/2 und p38K. JNK hatte keinen Einfluss auf die Induktion. Durch die Herunterregulation der FRA-1-Expression mit Hilfe von siRNA und eines shRNA exprimierenden Plasmids kam es zu einer signifikanten Sensitivierung gegenüber ACNU. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulation der FRA-1-Expression in einer verminderten AP 1-Bildung, bedingt durch eine reduzierte Menge an FRA-1 im AP-1-Komplex resultiert. Die Sensitivierung gegenüber ACNU ist weder durch eine Veränderung in der DNA-Reparatur, noch in der Modulation der FAS-Ligand- bzw. FAS-Rezeptor-Expression bedingt. Auch die hier untersuchten BCL 2-Familienmitglieder wiesen keine Unterschiede in der Expression durch Modulation der FRA 1-Expression auf. Allerdings kam es durch die verminderte FRA-1-Expression zu einer Reduktion der Zellzahl in der G2/M-Phase nach Behandlung mit ACNU. Diese ging einher mit einer reduzierten Menge an phosphoryliertem und unphosphoryliertem CHK1, weshalb davon auszugehen ist, dass FRA 1 nach ACNU-Behandlung in Gliomzellen vor der Apoptose schützt, indem es modulierend auf die Zellzykluskontrolle einwirkt.rnIm zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Regulation der apoptotischen Antwort nach Behandlung mit ACNU und TMZ genauer beleuchtet, wobei ein spezielles Augen¬merk auf AP 1 und die MAPKs gelegt wurde. Hier konnte gezeigt werden, dass die Apoptose nach Behandlung mit ACNU bzw. TMZ sowohl durch Spaltung von Pro-Caspase 8, als auch Pro-Caspase 9 eingeleitet wird. Dabei akkumulierte in beiden Fällen p53 vermehrt im Zellkern. Eine Inhibierung der transkriptionellen Aktivität von p53 führte nach ACNU-Behandlung zu einer Sensitivierung der Zellen, nach TMZ-Behandlung kam es zu einem leichten Anstieg in der Vitälität. Der FAS-Rezeptor wurde nach ACNU- und nach TMZ-Behandlung aktiviert und auch die DNA-Reparaturproteine DDB2 und XPC wurden in beiden Fällen vermehrt exprimiert. Für die MAPKs JNK und ERK1/2 konnte gezeigt werden, dass diese pro-apoptotisch wirken. Die AP-1-Bildung nach ACNU-Behandlung erfolgte bereits nach 24 h und war von langer Dauer, wohingegen nach TMZ-Behandlung nur eine transiente AP 1-Bildung zu relativ späten Zeitpunkten detektiert werden konnte. Ebenso konnte für das AP-1-Zielgen FAS-Ligand nach ACNU-Behandlung eine relativ schnelle, lang anhaltende Aktivierung detektiert werden, wohingegen nach TMZ-Behandlung zu einem späten Zeitpunkt ein kurzer Anstieg im Signal zu verzeichnen war. In späteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass das BCL-2-Familienmitglied BIM eine zentrale Rolle in der Regulation des intrinsischen Apoptosesignalweges nach Behandlung mit ACNU und TMZ spielt. Die hier entstanden Ergebnisse tragen entscheidend zum Verständnis der durch diese beiden Agenzien gesteuerten, apoptotischen Signalwege bei und bieten eine fundierte Grundlage für weitere Untersuchungen.rn