Sedimentary environments and climate change: a case study (late Miocene, central Crete)

In this study, conditions of deposition and stratigraphical architecture of Neogene (Tortonian, 11-6,7Ma) sediments of southern central Crete were analysed. In order to improve resolution of paleoclimatic data, new methods were applied to quantify environmental parameters and to increase the chronostratigraphic resolution in shallow water sediments. A relationship between paleoenvironmental change observed on Crete and global processes was established and a depositional model was developed. Based on a detailed analysis of the distribution of non geniculate coralline red algae, index values for water temperature and water depth were established and tested with the distribution patterns of benthic foraminifera and symbiont-bearing corals. Calcite shelled bivalves were sampled from the Algarve coast (southern Portugal) and central Crete and then 87Sr/86Sr was measured. A high resolution chronostratigraphy was developed based on the correlation between fluctuations in Sr ratios in the measured sections and in a late Miocene global seawater Sr isotope reference curve. Applying this method, a time frame was established to compare paleoenvironmental data from southern central Crete with global information on climate change reflected in oxygen isotope data. The comparison between paleotemperature data based on red algae and global oxygen isotope data showed that the employed index values reflect global change in temperature. Data indicate a warm interval during earliest Tortonian, a second short warm interval between 10 and 9,5Ma, a longer climatic optimum between 9 and 8Ma and an interval of increasing temperatures in the latest Tortonian. The distribution of coral reefs and carpets shows that during the warm intervals, the depositional environment became tropical while temperate climates prevailed during the cold interval. Since relative tectonic movements after initial half-graben formation in the early Tortonian were low in southern central Crete, sedimentary successions strongly respond to global sea-level fluctuation. A characteristic sedimentary succession formed during a 3rd order sea-level cycle: It comprises mixed siliciclastic-limestone deposited during sea-level fall and lowstand, homogenous red algal deposits formed during sea-level rise and coral carpets formed during late rise and highstand. Individual beds in the succession reflect glacioeustatic fluctuations that are most prominent in the mixed siliciclastic-limestone interval. These results confirm the fact that sedimentary successions deposited at the critical threshold between temperate and tropical environments develop characteristic changes in depositional systems and biotic associations that can be used to assemble paleoclimatic datasets.

Entwicklung eines immunologischen Testsystems zur Detektion des marinen Biotoxins Domoinsäure

Domoinsäure ist ein von mehreren Arten mariner Kieselalgen der Gattung Pseudonitzschia produziertes Toxin, welches während einer Algenblüte in Molluscen wie z.B. der Miesmuschel Mytilus sp. akkumuliert werden kann. Beim Verzehr solch kontaminierter Muscheln können sowohl beim Menschen als auch bei Tieren erhebliche Vergiftungserscheinungen auftreten, die von Übelkeit, Kopfschmerzen und Orientierungsstörungen bis hin zum Verlust des Kurzzeitgedächtnisses (daher auch als amnesic shellfish poisoning bekannt) reichen und in einigen Fällen tödlich enden. rnDie heute gängigen Methoden zur Detektion von Domoinsäure in Muschelgewebe wie Flüssigkeitschromatographie und Maus-Bioassay sind zeit- und kostenintensiv bzw. in Anbetracht einer Verbesserung des Tierschutzes aus ethischer Sicht nicht zu vertreten. Immunologische Testsysteme stellen eine erstrebenswerte Alternative dar, da sie sich durch eine vergleichsweise einfache Handhabung, hohe Selektivität und Reproduzierbarkeit auszeichnen.rnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein solches immunologisches Testsystem zur Detektion von Domoinsäure zu entwickeln. Hierfür wurden zunächst Antikörper gegen Domoinsäure gewonnen, wofür das Toxin wiederum als erstes über die Carbodiimid-Methode an das Trägerprotein keyhole limpet hemocyanin (KLH) gekoppelt wurde, um eine Immunantwort auslösen zu können. Kaninchen und Mäuse wurden mit KLH-DO-Konjugaten nach vorgegebenen Immunisierungsschemata immunisiert. Nach vier Blutabnahmen zeigte das polyklonale Kaninchenantiserum eine ausreichend hohe Sensitivität zum Antigen; das nachfolgende Detektionssystem wurde mit Hilfe dieses polyklonalen Antikörpers aufgebaut. Zwar ist es gegen Ende der Arbeit auch gelungen, einen spezifischen monoklonalen Antikörper aus der Maus zu gewinnen, jedoch konnte dieser aus zeitlichen Gründen nicht mehr im Detektionssystem etabliert werden, was durchaus wünschenswert gewesen wäre. rnWeiterhin wurde Domoinsäure im Zuge der Entwicklung eines neuartigen Testsystems an die Trägerproteine Ovalbumin, Trypsininhibitor und Casein sowie an Biotin konjugiert. Die Kopplungserfolge wurden im ELISA, Western Blot bzw. Dot Blot nachgewiesen. Die Ovalbumin-gekoppelte sowie die biotinylierte Domoinsäure dienten im Folgenden als die zu messenden Größen in den Detektionsassays- die in einer zu untersuchenden Probe vorhandende, kompetitierende Domoinsäure wurde somit indirekt nachgewiesen. rnDer zulässige Höchstwert für Domoinsäure liegt bei 20 µg/g Muschelgewebe. Sowohl mit Biotin-DO als auch mit OVA-DO als den zu messenden Größen waren Domoinsäurekonzentrationen unterhalb dieses Grenzwertes nachweisbar; allerdings erwies sich der Aufbau mit Biotin-DO um das ca. 20-fache empfindlicher als jener mit OVA-DO. rnDie in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse könnten als Grundlage zur Etablierung eines kommerzialisierbaren immunologischen Testsystems zur Detektion von Domoinsäure und anderen Biotoxinen dienen. Nach erfolgreicher Validierung wäre ein solches Testsystem in seiner Handhabung einfacher als die gängige Flüssigkeitschromatographie und besser reproduzierbar als der Maus-Bioassay.rn

Nachweis und Charakterisierung der Ketocarotinoidakkumulation in Zygosporen des Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Ketocarotinoide sind in den Dauerstadien vieler Grünalgen anzutreffen und aufgrund ihres hohen antioxidativen Potentials vermutlich von großer Bedeutung für deren Überleben unter ungünstigen Umweltbedingungen. Daneben ist die Aufnahme von Ketocarotinoiden im Zuge der Nahrungskette für verschiedene Tiere lebensnotwendig. Trotz zahlreicher Untersuchungen des Biosynthesewegs der Ketocarotinoide, vorwiegend in der Grünalge Haematococcus pluvialis, sind viele grundlegende Aspekte der Synthese nicht verstanden. Dazu zählt neben dem genauen Reaktionsmechanismus des ketolierenden Enzyms ß-Carotin-Ketolase (BKT) vor allem der noch nicht aufgeklärte Zusammenhang zwischen Lipidsynthese und Ketocarotinoidakkumulation. Nach der Entdeckung eines zur BKT aus H. pluvialis homologen Gens in einer EST-Datenbank des Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii wurden im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit die als orange-rot beschrieben Zygosporen von C. reinhardtii als mögliches ketocarotinoidhaltiges Zellstadium untersucht. Dabei wurden für C. reinhardtii erstmals Ketocarotinoide in Konzentrationen bis zu einem Femtomol pro Zelle nachgewiesen und mittels HPLC-Analytik, chemischer Derivatisierung und Massenspektrometrie zweifelsfrei identifiziert. Es wurden, in aufsteigender Quantität, drei Ketocarotinoide detektiert: Canthaxanthin, Astaxanthin und 4-Ketolutein. Letzteres wurde bisher selten in anderen ketocarotinoidakkumulierenden Organismen beschrieben und stellt, im Gegensatz zu den vom ß-Carotin abgeleiteten Pigmenten Astaxanthin und Canthaxanthin, ein Pigment des α-Carotin-Zweiges dar. Astaxanthin und 4-Ketolutein wurden vor allem in Form von Pigment-Fettsäureestern nachgewiesen. Mit Hilfe von Paarungsansätzen mit der lor1-Mutante, die keine α-Carotinoide synthetisieren kann, und Vergleichen mit Ketocarotinoiden aus H. pluvialis konnte gezeigt werden, dass 4 Ketolutein nur als Monoacylester in der Alge vorliegt, während Astaxanthin sowohl als Monoacyl- wie auch als Diacylester anzutreffen ist. Ketocarotinoide wurden innerhalb der ersten 14 Tage der Zygotenreife gebildet. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der Zygoten dokumentierten, dass damit ein starker Umbau der Zelle einherging, der sich vor allem in der Reduktion des Chloroplasten und der Bildung von Lipidtröpfchen darstellte. Letztere nahmen bei reifen Zygosporen den größten Teil des Zelllumens ein und wurden mittels dünnschichtchromatografischer Analysen als Neutralfette identifiziert. Der sinkende Zellgehalt an Carotinoiden im Zuge der Zygosporenreifung und Inhibitorexperimente an reifenden Zygoten mittels Norflurazon zeigten, dass für die Ketocarotinoidakkumulation keine Neusynthese von Carotinoiden nötig ist und lassen die Hypothese zu, dass C. reinhardtii die im Zuge der Chloroplastenreduktion freigesetzten Photosynthese-Carotinoide als Substrate für die Ketocarotinoidsynthese verwendet. Physiologische Bedeutung könnte den Ketocarotinoiden vor allem beim Schutz der Speicherlipide vor Peroxidation durch reaktive Sauerstoffspezies zukommen. Diese Reservestoffe stellen die Energieversorgung während des Auskeimens der Zellen sicher. Durch den im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit dokumentierten Nachweis der Ketocarotinoidakkumulation in C. reinhardtii können die Ketocarotinoidsynthese und vor allem der Zusammenhang von Lipid- und Ketocarotinoidakkumulation zukünftig mit Hilfe der für diesen Modellorganismus vorliegenden umfangreichen molekulargenetischen Methoden detailliert untersucht werden.

Identifizierung und Quantifizierung der Ketocarotinoide in Dauerstadien von Grünalgen und Ketocarotinoidbiosynthese im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Grünalgen bilden zur Überdauerung schlechter Umweltbedingungen Ruhestadien, die sich durch Ausbildung einer festen Zellwand, die Reduktion des Plastiden und die starke Akkumulation von Speicherfetten und Ketocarotinoiden im Zytosol auszeichnen. Obwohl Ketocarotinoide in Grünalgen seit über vierzig Jahren beforscht werden, gab es hierzu noch wenige molekularbiologische Untersuchungen. Im Vorfeld meiner Promotion wurde durch unsere Arbeitsgruppe entdeckt, dass auch der molekular gut zugängliche Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii im Zygotenstadium große Mengen an Ketocarotinoiden bildet. Neben dem zu erwartenden Ketocarotinoid Astaxanthin fanden wir große Mengen des bisher nur in einer Grünalge beschriebenen 4-Ketoluteins. Vorversuche ließen die Vermutung aufkommen, dass dieses Pigment bei der Untersuchung der Pigmentausstattung in Dauerstadien von vielen Grünalgen bisher übersehen wurde. rnIn der vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst die Pigmentzusammensetzung von Dauerstadien der bereits gut untersuchten Grünalgen Muriella zofingiensis und Scenedesmus rubescens durch Vergleich mit dem Ketocarotinoidmuster aus Dauerstadien von C. reinhardtii und Fritschiella tuberosa reevaluiert und dabei erstmals das Vorkommen signifikanter Mengen an 4-Ketolutein nachgewiesen. Außerdem zeigte sich, dass die als bisheriger Modellorganismus der Ketocarotinoidbiosynthese in Grünalgen sehr gut untersuchte Alge Haematococcus pluvialis eher eine Ausnahme darstellt, da ihre Dauerstadien als einzige der hier untersuchten Algen nur minimale Mengen von 4 Ketolutein aufwiesen. Diese Beobachtungen machen es sehr wahrscheinlich, dass die Fähigkeit zur Bildung von 4-Ketolutein unter den Grünalgen wesentlich weiter verbreitet ist als bisher angenommen. Das sekundäre Carotinoid 4-Ketolutein kam in den Dauerstadien der Grünalgen neben seiner freien Form ausschließlich als Monoacylester vor, im Gegensatz zu Astaxanthin, das als mono- und diacylierte Form auftrat. rnÜber die Analyse der Pigmentausstattung hinaus konnten die entscheidenden Schritte des Synthesewegs der Ketocarotinoide in C. reinhardtii durch funktionelle Charakterisierung der beteiligten Enzyme in Bakterien aufgeklärt werden. Als Basis für die Charakterisierungen wurde ein umfangreiches Portfolio von carotinogenen E. coli-Bakterien etabliert, darunter α Carotin und Lutein produzierende Stämme, die bisher nicht zur Verfügung standen. Das wurde durch die Klonierung der Lycopinzyklase (OluLCY) aus der Grünalge Ostreococcus lucimarinus möglich, die eine Sonderolle unter den Zyklasen einnimmt, da sie die Lycopin-β-Zyklase und Lycopin-ε-Zyklase in einem Fusionsenzym vereint. Vorteile dieses Fusionsenzyms sind die Expressionskontrolle durch nur einen Promotor und die weitgehend konstante Stöchiometrie seiner Produkte α-Carotin und β-Carotin, was die OluLCY für die biotechnologische Anwendung prädestiniert.rnDie funktionelle Charakterisierung der Carotinoidbiosyntheseenzyme aus C. reinhardtii umfasste das Schlüsselenzym der Ketocarotinoidbiosynthese, die β-Carotin-Ketolase (BKT), sowie die Carotinoid-Hydroxylasen CHYB, CYP97A5 und CYP97C3. Dabei wurde für das BKT-Enzym aus C. reinhardtii nachgewiesen, dass es nicht nur die Ketolierung von β Carotin zu Canthaxanthin und von Zeaxanthin zu Astaxanthin, sondern auch die Bildung der von α-Carotin abgeleiteten Ketocarotinoide wie 4-Keto-α-Carotin und 4 Ketolutein katalysieren kann.rn