Neue 18 F-markierte Liganden zur Visualisierung des GABA A, alpha 5-Rezeptorstatus mittels PET

Die heutige Verfügbarkeit der molekularen Bildgebung ermöglicht einen signifikanten Einfluss auf die Diagnostik und die Therapiekontrolle von neurodegenerativen Erkrankungen, die unter anderem durch Fehlsteuerungen im GABAergen System auftreten können. Die Visualisierung und Quantifizierung des GABAA-alpha5-Subtyps durch PET könnte dabei zu einem besseren Verständnis von Erkrankungen wie Alzheimer und traumatischen Neurosen (emotionales Langzeitgedächtnis) beitragen. Ferner eröffnen GABAA/alpha5-subtypselektive Liganden die Möglichkeit, wesentliche Grundlagen der elementaren Vorgänge von Lernen und Erinnern zu untersuchen. 7,8,9,10-Tetrahydro-(7,10-ethan)-1,2,4-triazol[3,4-alpha]phthalazine stellen sich als vielverspre-chende Leitstrukturen zur Entwicklung neuer 18F-markierter alpha5-subtypselektiver GABAA-Rezeptorliganden für die PET dar. Um diese neuartigen Substanzen hinsichtlich ihrer Potenz als GABAA-alpha5-subtypselektive Radioliganden zu verifizieren, wurden zunächst die entsprechenden 19F-Derivate TC07-TC12 synthetisiert. Diese Referenzverbindungen wurden in Rezeptor-bindungsassays und in Autoradiographien mit [3H]Ro 15-4513 als zu verdrängender Radioligand evaluiert. In beiden Experimenten als auch in in vivo-Verdrängungsexperimenten an Ratten konnte eine hohe Affinität im nanomolaren Bereich als auch eine hohe Selektivität bezüglich der GABAA/alpha5-Untereinheit für einige der dargestellten Referenzverbindungen nachgewiesen werden. Gemäß diesen vielversprechenden Ergebnissen wurden verschiedene Markie-rungsvorläufer für eine 18F-Direktmarkierung der relevantesten Substanz TC07 in einer mehrstufigen organischen Synthese dargestellt. Die anschließende 18F-Markierung erfolgte über eine nukleophile Substitution mit [18F]Fluorid. Die Reaktionsparameter wurden hinsichtlich Reaktionstemperatur und dauer, Markierungsvorläuferkonzentration, Basenabhängigkeit und verschiedenen Markierungsmethoden optimiert. Daraus resultierend konnte [18F]TC07 mit bis zu 45 % radiochemischer Ausbeute erhalten werden. Die zerfallskorrigierte, gesamtradiochemische Ausbeute von nca [18F]TC07 in isotonischer NaCl-Lösung betrug 15 %. Basierend auf den bisher erhaltenen Ergebnissen wurde der Radioligand in in vitro-, ex vivo- und in vivo µPET-Experimenten evaluiert. Die zunächst durchgeführten in vitro-Experimente deuteten auf eine homogene Verteilung der Aktivität hin und zeigten keine spezifische Anreicherung. Diese Ergebnisse wurden sowohl in ex vivo- als auch in in vivo-µPET-Studien bestätigt. Auch hier konnte nur eine niedrige Aktivitätsanreicherung, eine homogene Verteilung im gesamten Gehirn und keine Übereinstimmung mit der bekannten GABAA/alpha5-Subtypverteilung gefunden werden. Eine im Anschluss durchgeführte Metabolismusstudie zeigte eine langsame Metabolisierungsrate des [18F]TC07 und auch eine Organverteilungsstudie zeigte keine außergewöhnlichen Anreicherungen. Aus den erhaltenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass der Radioligand [18F]TC07 kein geeigneter Tracer zur in vivo-Visualisierung der alpha5-Untereinheit des GABAA-Rezeptors ist.

Synthese, Evaluierung und 18 F-Markierung von neuen Liganden zur Visualisierung der Strychnin-insensitiven Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors

Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im Gehirn. Folglich spielen Glutamat-kontrollierte Rezeptorsysteme eine entscheidende Rolle in neurologischen Vorgängen, wie beispielsweise in Lern- und Gedächtnisprozessen. Gerade der NMDA-Rezeptor ist in eine Vielzahl solcher Vorgänge involviert und wird vor allem mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Chorea Huntington, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und zerebraler Ischämie in Verbindung gebracht. Folglich stellt die Visualisierung des NMDA-Rezeptorstatus eine Möglichkeit dar, den Verlauf solcher Prozesse zu untersuchen.rnDie Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist eine leistungsstarke Anwendung in der molekularen Bildgebung und erlaubt die in vivo-Visualisierung sowie Quantifizierung biochemischer Prozesse. Durch die Verwendung geeigneter Tracer können bestimmte pathologische und neurologische Abläufe beurteilt werden. rnZurzeit sind keine geeigneten PET-Tracer zur Untersuchung des NMDA-Rezeptors verfügbar. Bisher dargestellte PET-Liganden zeichneten sich durch nicht zufriedenstellende Affinitäten und Selektivitäten aus und führten meist auf Grund der hohen Lipophilie zu einem hohen Maß an unspezifischer Bindung. rnDie Strychnin-insensitive Glycinbindungsstelle des NMDA-Rezeptors stellt ein vielversprechendes Target dar, spezifische Liganden für diese Bindungsstelle zu synthetisieren. Hier zeichnen sich einige Verbindungsklassen durch exzellente Affinitäten und Selektivitäten sowie durch vielversprechende in vivo-Eigenschaften aus. rnAuf Grundlage dieser biologischen Daten wurden zwei Substanzen der 2-Indolcarbonsäure, nämlich die 4,6-Dichlor-3-(2-oxo-3-phenylimidazolidin-1-ylmethyl)-1H-indol-2-carbonsäure (MDJ-114) und die (E)-4,6-Dichlor-3-(2-phenylcarbamoylvinyl)-1H-indol-2-carbonsäure (GV150526), als Leitstruktur gewählt. Ferner wurde das 7-Chlor-4-hydroxy-3-(3-phenoxyphenyl)-1H-chinolin-2-on (L-701,324) aus der Substanzklasse der 4-Hydroxy-1H-chinolin-2-one als dritte Leitstruktur gewählt.rnFür diese Substanzen wurden 19F-markierte Analogverbindungen synthetisiert, um als inaktive Referenzverbindungen auf ihre Eignung überprüft zu werden. Hierzu wurde eine Fluorethoxygruppierung im terminalen Phenylring der entsprechenden Leitstruktur eingeführt. Durch Variation der Fluorethoxysubstitution in ortho-, meta- und para-Stellung, konnten die besten Affinitäten in einem kompetitiven Rezeptorbindungsassay durch Verdrängung von [3H]MDL-105,519 bestimmt werden. Als Maß für die Lipophilie wurden die entsprechenden log D-Werte über die HPLC-Methode bestimmt. Basierend auf den Ergebnissen der Evaluierung wurden zwei Derivate identifiziert, welche zur 18F-Markierung genutzt werden sollten (GV150526-Derivat 34: log D = 0,23 ± 0,03, IC50 = 0,20 ± 0,25 µM, Ki = 0,13 ± 0,16 µM; L701,324-Derivat 55: log D = - 0,25 ± 0,01, IC50 = 78 ± 37 µM, Ki = 51 ± 24 µM). Die 18F-Markierung erfolgte durch die Reaktion des entsprechenden Markierungsvorläufers mit dem Markierungssynthon 2-[18F]Fluorethyltosylat, welches durch die Umsetzung von Ethylenditosylat mit [18F]Fluorid hergestellt wurde. Die Radiosynthesen der beiden 18F-markierten Verbindungen [18F]34 (4,6-Dichlor-3-{2-[4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenylcarbamoyl]-vinyl}-1H-indol-2-carbonsäure) und [18F]55 (7-Chlor-3-{3-[4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenoxy]-phenyl}-4-hydroxy-1H-chinolin-2-on) wurden optimiert sowie semipräparative Abtrennverfahren entwickelt. Beide Tracer wurden auf ihre in vivo-Eignung im µPET-Experiment untersucht. Die Zeitaktivitätskurven lassen erkennen, dass beide Tracer entgegen der Erwartung nicht die Blut-Hirn-Schranke überwinden können. Für das GV150526-Derivat ([18F]34) wurden zusätzlich Autoradiographiestudien durchgeführt. Die erhaltenen Aufnahmen zeigten ein heterogenes Verteilungsmuster der Aktivitätsanreicherung. Ebenso wurde ein hohes Maß an unspezifischer Bindung beobachtet. Möglicherweise sind Cross-Affinitäten zu anderen Rezeptorsystemen oder der recht hohe lipophile Rest des Moleküls hierfür verantwortlich. Ein Grund für die unzureichende Hirngängigkeit der Radioliganden kann sich in der Carboxylatfunktion des GV150526-Derivats bzw. in der 4-Hydroxy-1H-chinolin-2-on-Einheit des L-701,324-Derivats wiederspiegeln. rnAuf Grundlage dieser Resultate können Versuche unternommen werden, für die Verbindungsklasse der 2-Indolcarbonsäuren entsprechende Ester als Prodrugs mit einer verbesserten Bioverfügbarkeit darzustellen. Ebenso können neue Strukturen als Grundlage für neue PET-Tracer untersucht werden.rnrn

Funktionelle, strukturelle und phylogenetische Untersuchungen an Lipoproteinen des Flusskrebses Astacus leptodactylus

Diese Arbeit untersucht zwei Lipoproteine, das discoidale High density-Lipoprotein (dHDL) und das β-Glukan-Bindeprotein (BGBP) aus dem Flusskrebs Astacus leptodactylus in funktioneller, struktureller und phylogenetischer Hinsicht. Die Nukleotid-Sequenz des BGBP konnte nahezu vollständig entschlüsselt werden. Dabei errechnet sich aus der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz ein Molekulargewicht von 153 kDa. Das reife BGBP hat nur eine molekulare Masse von 105 kDa. Vermutlich kommt es durch eine Furin-ähnliche Protease zu einer post-translationalen N- und C-terminalen Prozessierung: zwei bisher nicht beschriebene, aber auch in der BGBP-Sequenz von anderen höheren Krebsen vorhandene, typische Furin-Schnittstellen (RAKR, bzw. RARR) wurden anhand von Sequenzvergleichen identifiziert. BGBP hat zwei Funktionen: zum Einen ist es für den Transport und die Aktivierung des proPhenoloxidase-Systems zuständig, zum Anderen für die Versorgung der Organe mit Lipiden, welche vermutlich der Energiegewinnung dienen. Eine 100 kDa große, BGBP-bindende Rezeptor-Fraktion konnte in Hämocyten-Membranen identifiziert werden. Das Vorkommen von dHDL war aus eigenen Befunden bisher ausschließlich in Astacus leptodactylus bekannt, doch konnte in dieser Arbeit ein mit dem dHDL-Antikörper reagierendes Protein erstmalig auch in anderen Arthropoden-Spezies nachgewiesen werden. Die discoidale Form und das Untereinheiten-Muster (240 + 85 kDa) sind typisch für die bei Vertretern ursprünglicher Tiergruppen gefundenen Lipoproteine (z.B. beim Cheliceraten Limulus und beim Polychaeten Nereis). Eventuell handelt es sich bei dHDL also um einen ‚Prototypen’ in der Lipoprotein-Evolution. Obwohl die Sequenz des dHDL auf Nukleotid-Ebene unbekannt ist, wurden die Sequenzen einiger dHDL-Peptide aus massenspektroskopischen Analysen gewonnen. Überraschenderweise befinden sich diese Sequenzen in der Aminosäuresequenz des BGBP. Dabei liegen alle Peptide am N- und/oder am C-Terminus der abgeleiteten BGBP-Aminosäure-Sequenz, und zwar in den Bereichen, die vermutlich durch das erwähnte Furin vom BGBP abgeschnitten werden, im reifen BGBP also gar nicht mehr vorkommen. Deshalb ist zu vermuten, dass BGBP und dHDL ein gemeinsames Vorläuferprotein haben und durch Genduplikation entstanden sind, oder dass es sich beim dHDL- und beim BGBP-Gen um ein und dasselbe Gen handelt. Das Genprodukt wird dann auf unterschiedliche Weise prozessiert und es entstehen die beiden Proteine dHDL und BGBP. Die Funktion von dHDL ist noch nicht eindeutig geklärt, es ließen sich aber dHDL-bindende Rezeptor-Fraktionen mit einer molekularen Masse von 160 kDa in somatischen Geweben (Muskel, Darm, Hepatopankreas, Kiemen und Samenleiter) sowie in Oocyten und Hämocyten nachweisen. Deshalb wird vermutet, dass dHDL als Energielieferant in Stoffwechsel-aktiven Organen und als Speicherprotein in Oocyten dient. Eine endocytotische Aufnahme konnte gezeigt werden.

Untersuchungen über Wechselwirkungen zwischen Proteinen der Leber und dem großen Hüllprotein des Hepatitis-B-Virus

Zusammenfassung:Im Infektionszyklus des Hepatitis-B-Virus spielt das große L-Hüllprotein mit seiner einzigartigen PräS1-Domäne eine zentrale Rolle. Es vermittelt die Bindung und Aufnahme in die Leberzelle, die Verpackung der Nukleokapside in die Virushülle, die Regulation der cccDNA-Amplifikation und eine transkriptionelle Aktivierung in der Wirtszelle. Zur Erfüllung seiner vielfältigen Aufgaben benötigt das L-Protein Unterstützung durch Wirtzellfaktoren, von denen einige im Rahmen dieser Untersuchung durch Verwendung von PräS1-Konstrukten als Fängerproteine im Hefe-Zwei-Hybrid-System identifiziert wurden. Mehrere Klone, die im Hefe-Zwei-Hybrid-Test mit dem C-terminalen PräS1-Fängerprotein (Aminosäure 44-108) isoliert worden waren, enthielten Teile der cDNA von gamma2-Adaptin, einem mutmaßlichen Mitglied der Clathrin-Adaptor-Proteine. Diese sind für intrazelluläre Membrantransportprozesse mittels clathrinumhüllter Vesikel verantwortlich. Unter den interagierenden Klonen, die mit dem N-terminalen Konstrukt des L-Proteins (Aminosäure 1-70) isoliert worden waren, befand sich überproportional häufig eine cDNA, die der schweren Kette H4 der Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitor-Familie homolog war. H4 besitzt vermutlich bei der 'Akute-Phase-Reaktion', die Entzündungen folgt, und bei der Stabilisierung der extrazellulären Matrix physiologische Bedeutung. Weitere Klone kodierten für die Serinprotease C1r. Diese ist Bestandteil des C1-Komplex, der ersten Komponente des klassischen Komplementsystems. Die Spezifität der Bindung zwischen den positiven Klonen und der PräS1-Domäne wurde in weiteren biochemischen Interaktionstests bestätigt, sodaß H4, C1r und gamma2-Adaptin als Wirtszellfaktoren in der Physiologie des Hepatitis-B-Virus wahrscheinlich eine Rolle spielen.Abstract:Little is known about host cell factors necessary for hepatitis B virus assembly and infectivity. Central to virogenesis is the large L envelope protein that mediates hepatocyte receptor binding, envelopment of viral capsids, regulation of supercoiled DNA amplification and transcriptional transactivation. To assess its multiple functions and host-protein assistance involved, we here initiated a yeast two-hybrid screen using the L-specific preS1 domain as bait to screen a human liver cDNA library for L-interacting proteins. One of the most prominent cDNAs interacting with aminoacid sequence 44-108 of L-protein encodes for gamma2-adaptin, a novel clathrin adaptor-related protein responsible for protein sorting and trafficking. Among the clones interacting with the N-terminal construct of L-protein (aminoacid sequence 1-70), a frequently isolated cDNA corresponds to the gene for inter-alpha-trypsin family heavy chain H4, likely to be involved in acute inflammatory phase response and stabilization of extracellular matrices. Some other interacting clones were found to carry the cDNA for the serine protease C1r, a subunit of the C1 complex which initiates the classical complement cascade. The specificity of the interaction between the positive clones and the preS1 domain was further confirmed in independent biochemical experiments. Taken together, the results suggest a role for H4, C1r and gamma2-adaptin as host-cell factors in L-mediated process of viral biogenesis and/or pathogenesis.

Charakterisierung funktioneller Domänen für GABA und Furosemid auf GABA A-Rezeptoren

ZUSAMMENFASSUNGDie schnelle inhibitorische Neurotransmission im Säugerhirn ist wesentlich GABA-erg vermittelt.Neben GABA binden u.a. Picrotoxinin und TBPS (tert-Butylbicyclophosphorothionat) am GABAA-Rezeptor. Die Bindung von [35S]TBPS wird durch alle am GABAA-Rezeptor bindenden Substanzen moduliert. Zur Untersuchung der GABAA-Rezeptor-Funktionen wurden TBPS-Bindungsstudien an rekombinant exprimierten Rezeptoren in vitro und nativen Rezeptoren in situ verwendet.Die alpha-Untereinheiten spielen bei der gehirnarealspezifischen Auswirkungen verschiedener GABA-Mimetika, der Charakterisierung subtypspezifischer Substanzen und der Ausprägung der GABA-Sensitivitäten eine große Rolle. Für die Detaillierung der höheren GABA-Sensitivität alpha6-enthaltender Rezeptoren wurden Chimären und Punktmutationen zwischen den Untereinheiten alpha1 und alpha6 hergestellt. Nach Austausch des Asparagins 188 in der alpha1-Untereinheit durch das alpha6-entsprechende Lysin zeigten Rezeptoren in Kombination mit den Untereinheiten beta3 und gamma2 eine erhöhte GABA-Sensitivität gegenüber dem Wildtyp. Dementsprechend wiesen alpha6-enthaltende Rezeptoren mit der umgekehrten Punktmutation L187N eine geringere GABA-Sensitivität auf. Furosemid wirkt ausschließlich auf alpha6beta2/3-enthaltende GABAA-Rezeptors GABA-agonistisch. [35S]TBPS-Bindungsstudien an chimären alpha1/alpha6-Rezeptoren weisen auf eine niedrigpotente Bindungsstelle für Furosemid im extrazellulären Sequenzabschnitt zwischen der Aoc I-Schnittstelle und der TM3-Region hin. Die Substanz 4 PIOL zeigte subtypspezifischen Charakter am GABAA-Rezeptor. In den [35S]TBPS-Autoradiographien und den Bindungsstudien an Membranen wirkte 4 PIOL auf alpha6-enthaltende Rezeptoren schwach GABA-mimetisch bzw. agonistisch, in den [35S]TBPS-Bindungsstudien an alpha6-enthaltenden rekombinanten Rezeptoren schwach negativ modulatorisch oder antagonistisch.

Synthese von Sialyl-Lewis X -Glycopeptiden und -Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-Selektin

Die Selektine initiieren im Verlauf von Entzündungsprozessen einen ersten Zellkontakt zwischen Leukozyten und Endothelzellen und ermöglichen so die Auswanderung der Leukozyten aus den Blutgefäßen in das umliegende Gewebe, wo sie ihre immunologische Wirkung entfalten können. Viele Krankheiten gehen allerdings mit einer übermäßigen, durch Selektine vermittelten Zelladhäsion einher. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, Selektininhibitoren zu synthetisieren, die pathologische Zelladhäsionsprozesse, wie man sie z.B. bei rheumatoider Arthritis, bei Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder im Verlauf von Tumormetastasierungen findet, unterbinden können. Als Leitstruktur für solche Inhibitoren dient das auf den natürlichen Selektinliganden vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X. Sialyl-Lewis-X stellt aber nur einen Teil der natürlichen Selektinliganden dar. Es bindet auch nur im millimolaren Bereich an die Selektine. Die komplexen natürlichen Selektinliganden wie z.B. ESL-1 (E-Selektin-Ligand-1), die an verschiedenen Glycosylierungs-stellen des Glycoproteins Sialyl-Lewis-X präsentieren, binden mit deutlich höherer Affinität an die Selektine. Für eine spezifische Rezeptorbindung sind daher außer dem Tetrasaccharid weitere Partialstrukturen verantwortlich, wobei gezeigt werden konnte, dass ein Anknüpfen von Sialyl-Lewis-X-Derivaten an die Partialsequenz 672-681 des ESL-1 eine Affinitätssteigerung hervorruft. Ein weiterer Nachteil des natürlichen Sialyl-Lewis-X-Tetrasaccharids im Hinblick auf seine pharmakologische Verwendung besteht darin, dass sowohl die fucosidische Bindung als auch die glycosidische Verknüpfung zur Neuraminsäure durch Enzyme leicht gespalten werden, wodurch Sialyl-Lewis-X als potenzielles Anti-Adäsionsmolekül an Wert verliert. Um die Kohlenydratliganden vor einem solchen enzymatischen Abbau zu bewahren, wurden in dieser Arbeit neben der im Sialyl-Lewis-X vorliegenden L-Fucose die im Menschen nicht vorkommenden Kohlenhydrate D-Arabinose und L-Galactose sowie neben der Neuraminsäure die (S)-Cyclohexylmilchsäure zur Herstellung der sechs Glycopeptid-Selektinliganden 1-6 mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 verknüpft. Die Tetrasaccharide und Tetrasaccharid-Mimetika können aus den geschützten Monosacchariden und der geschützten Cyclohexylmilch-säure in parallelen Synthesen im Gramm-Maßstab hergestellt werden. Die automatisierten Glycopeptid-Festphasensynthesen wurden an einem Peptidsynthesizer nach der Fmoc-Strategie unter Verwendung von mit Asparaginsäure vorbeladenen TentaGel®-Harzen durchgeführt. Die Strukturen aller sechs Glycopeptide 1-6 wurden sowohl durch hoch auflösende massenspektrometrische Analysen als auch durch ein- und zweidimensionale NMR-Experimente belegt. Als Ergebnis dieser Arbeit liegen sechs Sialyl-Lewis-X-Glycopeptide und -Mimetika mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 vor. Diese werden in Kürze auf ihre Wirksamkeit als Zelladhäsions-inhibitoren für E-Selektin getestet. Daraus sollen sich Erkenntnisse über Struktur-Wirkungs-Beziehungen gewinnen lassen, insbesondere was das kooperative Zusammenwirken von Saccharid- und Peptidteilstrukturen in der Erkennung der Liganden durch das E-Selektin anbetrifft.

Untersuchung der Bindung des humanen Papillomvirus HPV16 an Heparansulfate der Zelloberfläche

In 99,7% aller Zervixkarzinome kann die DNA humaner Papillomviren (HPV) nachgewiesen werden, die somit den Hauptauslöser für eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen weltweit darstellen. HPV16 ist verantwortlich für etwa 50% aller Zervixkarzinome. Für die Infektion von Zellen mit HPV16 ist die Interaktion mit Heparansulfatproteoglykanen der Zelloberfläche essentiell. Um Aminosäuren auf der Oberfläche des majoren Kapsidproteins L1 von HPV16 zu identifizieren, die zu dieser Interaktion beitragen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zahlreiche Punktmutanten hergestellt und analysiert. Der Austausch der drei Lysine K278, K356 und K361 zu Alaninen führte zu signifikant verminderter Zell-, Heparin- und Heparansulfatbindung, die noch weiter reduziert wurde, wenn zwei oder drei der Lysine gleichzeitig mutiert waren. Auch die Infektiosität der mutanten Pseudovirionen war stark beeinträchtigt, die Trippelmutante zeigte nur noch 5% Infektiosität. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die drei Lysine gemeinsam die Bindestelle für Heparansulfate bilden. Ihr Austausch zu Argininen beeinflusste die Infektiosität der Partikel hingegen nicht, was bestätigt, dass die Interaktion mit Heparansulfaten von der positiven Ladungsdichte abhängt und nicht sequenzspezifisch ist. Die drei Lysine befinden sich auf der Spitze des HPV16-Kapsomers in einer flachen Tasche, die aufgrund ihrer Struktur bereits früher als potentielle Rezeptorbindestelle vorgeschlagen wurde. Fab-Fragmente des bindungsneutralisierenden Antikörpers H16.56E, dessen Epitop in direkter Nachbarschaft der Lysine liegt, inhibierten die heparansulfatvermittelte Zellbindung viraler Partikel. Auch Epitope anderer bindungsneutralisierender Antikörper befinden sich in der Nähe. Dies untermauert die Hypothese, dass die Lysine K278, K356 und K361 die Heparansulfatbindestelle von HPV16 bilden. Der Austausch von Threoninen, die genau zwischen den Lysinen liegen, hatte keine Auswirkung auf Bindung der Partikel und Infektiosität. Sie könnten jedoch durch die Bildung von Wasserstoffbrücken die Bindung an Heparansulfat stabilisieren. Die Bedeutung der Lysine K278, K356 und K361 bei der primären Interaktion von HPV16 mit Heparansulfaten konnte durch die Computersimulation der Interaktion der Virusoberfläche mit einem Heparinmolekül bestätigt werden. Des Weiteren konnten Anforderungen ermittelt werden, die eine solche Interaktion an das Heparinmolekül stellt. Weiterhin zeigten die Ergebnisse dieser Arbeit, dass basische Aminosäuren in der interkapsomeren Grube nicht an der primären Zellbindung an Heparansulfate beteiligt zu sein scheinen, aber eine Rolle bei sekundären Interaktionen mit der Zelloberfläche spielen könnten.

Aktivierung der alpha-Sekretase ADAM10 als neuer therapeutischer Ansatz zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung

Die Stimulation der APP-prozessierenden α-Sekretase ADAM10 eröffnet eine vielversprechende Möglichkeit zur medizinischen Behandlung der Alzheimer-Krankheit. In dieser Arbeit wurden drei unterschiedliche Strategien zur therapeutischen Aktivierung von ADAM10 verfolgt: Die Aktivierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors PAC1 durch PACAP, die Gentherapie mit ADAM10-cDNA und die ADAM10-Promotorstimulation durch Retinoid-Rezeptor-Aktivierung. PACAP-38 stimuliert die α-Sekretase-vermittelte APPsα-Sekretion in humanen Neuroblastomzellen. Durch Aktivierung des PAC-1-Rezeptors via intranasal verabreichtem PACAP-38, konnte eine erhöhte α-sekretorische APP-Prozessierung bzw. verminderte Ablagerung von amyloiden Plaques in Mäusen gezeigt werden. Weiterhin sollte durch Immunoliposomen-basierte Transfektion die humane ADAM10-cDNA in den Neuronen der Maus überexprimiert werden. Hiefür wurde die DNA in Liposomen eingeschlossen, welche an ihrer Oberfläche mit anti-Transferrin-Antikörpern zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke gekoppelt waren. Für die Herstellung des DNA-Transportsystems wurden die Einzelschritte wie DNA-Einschluss mit einem Reportergen-Vektor, Konjugation mit verschiedenen Antikörpern und Größe der Liposomen erprobt und optimiert. Es konnte allerdings weder in vitro noch in vivo eine Immunoliposomen-vermittelte Transfektion nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde zudem die Retinoid-basierte Expressionssteigerung von ADAM10 untersucht. Dafür wurden die beiden potentiellen Retinoid-Rezeptor-Bindestellen auf dem ADAM10-Promotor durch Verwendung selektiver nukleärer Rezeptor-Agonisten charakterisiert. Hierbei konnte erstmals gezeigt werden, dass der ADAM10-Promotor durch ein Dimer der nukleären Rezeptoren RAR und RXR aktiviert wird, wodurch eine erhöhte α-sekretorischen APP-Prozessierung in Neuroblastoma-Zellen resultiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die RAR/RXR-Heterodimeraktivierung sowohl auf dem humanen wie auf dem murinen ADAM10-Promotor identisch ist, so dass am Mausmodell entwickelte Retinoid-basierte Therapien auf den Menschen übertragbar sind. Für das Modell einer solchen Therapie wurde Acitretin verwendet, welches für die medizinische Behandlung humaner Hautkrankheiten seit Jahrzehnten eingesetzt wird. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Acitretin in humanen und murinen Neuroblastoma-Zellen die Menge an ADAM10 erhöht, wodurch die α-sekretorische APP-Prozessierung gesteigert wird. Zudem wurden Mäuse mit Acitretin oral, subcutan und intranasal behandelt, wobei jedoch weder eine Veränderung in der APP-Prozessierung noch der Blut-Hirn-Transport von Acitretin eindeutig belegt werden konnten. Dennoch erschließt die α-Sekretase-erhöhende Eigenschaft von Acitretin einen neuen Therapieansatz, zur Behandlung von Demenzformen vom Typ des Morbus Alzheimer.

Untersuchung neuer hochwirksamer neuroprotektiver Antioxidantien in experimentellen Modellen der Parkinsonschen Krankheit

Bei der Parkinsonschen Krankheit kommt es zu einer selektiven Degeneration der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra pars compacta. Die Rolle des oxidativen Stresses in der Pathogenese dieser Erkrankung konnte an post mortem Untersuchungen der Parkinson-Patienten, wie auch an zahlreichen in vitro und in vivo Modellen bestätigt werden. Die Anwendung von Antioxidantien wurde als therapeutische Strategie der Parkinsonschen Krankheit vorgeschlagen. In dieser Hinsicht wurden bereits antioxidative Substanzen in klinischen Studien evaluiert. Klinische Studien mit Antioxidantien haben jedoch bislang nur wenig überzeugende Ergebnisse erbracht, mit Ausnahme des Einsatzes des Ubichinons (Coenzym Q). Eine kritische Analyse der klinischen Studien lässt zusammenfassen, dass auf Seiten der verwendeten Antioxidantien noch massiver Optimierungsbedarf besteht. Für einen erfolgreichen therapeutischen Einsatz von Antioxidantien bei dieser Krankheit sind folgende Eigenschaften der Substanzen von höchster Bedeutung: i) maximale neuroprotektive Aktivität bei geringen Dosen; ii) geringe Nebenwirkungen; iii) eine hohe Blut-Hirn-Schrankengängigkeit.In dieser Arbeit wurde das neuroprotektive Potential von drei Bisarylimin-basierten antioxidativen Strukturen (Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin) in in vitro und in vivo Parkinson-Modellsystemen evaluiert. Beide experimentellen Modelle basieren auf der Wirkung der mitochondrialen Komplex I Inhibitoren 1-Methyl-4-Phenylpyridin (MPP+) und Rotenon, welche pathophysiologische Charakteristika der Parkinsonschen Krankheit reproduzieren. Unsere in vitro Untersuchungen an primären Neuronen des Mittelhirns und der klonalen SH-SY5Y-Neuroblastomazelllinie konnten zeigen, dass die Komplex I Inhibition krankheitsspezifische zelluläre Merkmale induziert, wie die Abnahme der antioxidativen Verteidigungskapazität und Verlust des mitochondrialen Membranpotentials. Zusätzlich kommt es in primären Neuronen des Mittelhirns zur selektiven Degeneration dopaminerger Neurone, welche in der Parkinsonschen Erkrankung besonders betroffen sind. Ko-Inkubation der in vitro Modelle mit Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin in niedrigen Konzentrationen (50 nM) halten die pathologischen Prozesse fast vollständig auf. In vivo Untersuchungen am MPP+- und Rotenon-basierten Caenorhabditis elegans (C. elegans) Modell bestätigen das neuroprotektive Potential der Bisarylimine. Hierfür wurde eine transgene C. elegans Linie mithilfe einer dopaminerg spezifischen DsRed2- (Variante des rot fluoreszierenden Proteins von Discosoma sp.)-Expression und pan-neuronaler CFP- (cyan fluoreszierendes Protein)-Expression zur Visualisierung der dopaminergen Neuronenpopulation in Kontrast zum Gesamtnervensystem erstellt. Behandlung des C. elegans mit MPP+ und Rotenon im larvalen und adulten Stadium führt zu einer selektiven Degeneration dopaminerger Neurone, sowie zum Entwicklungsarrest der larvalen Population. Die dopaminerge Neurodegeneration, wie auch weitere phänotypische Merkmale des C. elegans Modells, können durch Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin in niedrigen Konzentrationen (500 nM) komplett verhindert werden. Ein systemischer Vergleich aromatischer Bisarylimine mit bekannten, gut charakterisierten Antioxidantien, wie α-Tocopherol (Vitamin E), Epigallocatechingallat und β-Catechin, zeigt, dass effektive Konzentrationen für Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin um Zehnerpotenzen niedriger liegen im Vergleich zu natürlichen Antioxidantien. Der Wirkungsmechanismus der Bisarylimine konnte in biochemischen und in vitro Analysen, sowie in Verhaltensuntersuchungen an C. elegans von der Wirkungsweise strukturell ähnlicher, neuroleptisch wirkender Phenothiazin-Derivate differenziert werden. Die Analyse des dopaminerg-gesteuerten Verhaltens (Beweglichkeit) in C. elegans konnte verdeutlichen, dass antioxidative und Dopaminrezeptor-bindende Eigenschaften der Bisaryliminstrukturen sich gegenseitig ausschließen. Diese qualitativen Merkmale unterscheiden Bisarylimine fundamental von klinisch angewandten Neuroleptika (Phenothiazin-Derivate), welche als Dopaminrezeptor-Antagonisten zur Behandlung psychischer Erkrankungen klinisch eingesetzt werden.Aromatische Bisarylimine (Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin) besitzen günstige strukturelle Eigenschaften zur antioxidativ-basierter Neuroprotektion. Durch die Anwesenheit der antioxidativ wirkenden, nicht-substituierten Iminogruppe unterscheiden sich Bisarylimine grundlegend von neuroleptisch-wirkenden Phenothiazin-Derivaten. Wichtige strukturelle Voraussetzungen eines erfolgreichen antioxidativen Neuropharmakons, wie eine hohe Radikalisierbarkeit, die stabile Radikalform und der lipophile Charakter des aromatischen Ringsystems, werden in der Bisaryliminstruktur erfüllt. Antioxidative Bisarylimine könnten in der Therapie der Parkinsonschen Krankheit als eine effektive neuroprotektiv-therapeutische Strategie weiter entwickelt werden.

Study on the regulation of mRNA expression of GABA transporters (GAT-1 and GAT-3) in rat brain

The submitted work concentrated on the study of mRNA expression of two distinct GABA transporters, GAT-1 and GAT-3, in the rat brain. For the detection and quantification of the chosen mRNAs, appropriate methods had to be established. Two methods, ribonuclease protection assay (RPA) and competitive RT-PCR were emloyed in the present study. Competitive RT-PCR worked out to be 20 times more sensitive as RPA. Unlike the sensitivity, the fidelity of both techniques was comparable with respect to their intra- and inter-assay variability.The basal mRNA levels of GAT-1 and GAT-3 were measured in various brain regions. Messenger RNAs for both transporters were detected in all tested brain regions. Depending on the region, the observed mRNA level for GAT-1 was 100-300 higher than for GAT-3. The GAT-1 mRNA levels were similar in all tested regions. The distribution of GAT-3 mRNA seemed to be more region specific. The strongest GAT-3 mRNA expression was detected in striatum, medulla oblongata and thalamus. The lowest levels of GAT-3 were in cortex frontalis and cerebellum.Furthermore, the mRNA expression for GAT-1 and GAT-3 was analysed under altered physiological conditions; in kindling model of epilepsy and also after long-term treatment drugs modulating GABAergic transmission. In kindling model of epilepsy, altered GABA transporter function was hypothesised by During and coworkers (During et al., 1995) after observed decrease in binding of nipecotic acid, a GAT ligand, in hippocampus of kindled animals. In the present work, the mRNA levels were measured in hippocampus and whole brain samples. Neither GAT-1 nor GAT-3 showed altered transcription in any tested region of kindled animals compared to controls. This leads to conclusion that an altered functionality of GABA transporters is involved in epilepsy rather than a change in their expression.The levels of GAT-1 and GAT-3 mRNAs were also measured in the brain of rats chronically treated with diazepam or zolpidem, GABAA receptor agonists. Prior to the molecular biology tests, behavioural analysis was carried out with chronically and acutely treated animals. In two tests, open field and elevated plus-maze, the basal activity exploration and anxiety-like behaviour were analysed. Zolpidem treatment increased exploratory activity. There were observed no differencies between chronically and acutely treated animals. Diazepam increased exploratory activity and decresed anxiety-like behaviour when applied acutely. This effect disappeard after chronic administration of diazepam. The loss of effect suggested a development of tolerance to effects of diazepam following long-term administration. Double treatment, acute injection of diazepam after chronic diazepam treatment, confirmed development of a tolerance to effects of diazepam. Also, the mRNAs for GAT-1 and GAT-3 were analysed in cortex frontalis, hippocampus, cerebellum and whole brain samples of chronically treated animals. The mRNA levels for any of tested GABA transporters did not show significant changes in any of tested region neither after diazepam nor zolpidem treatment. Therefore, changes in GAT-1 and GAT-3 transcription are probably not involved in adaptation of GABAergic system to long-term benzodiazepine administration and so in development of tolerance to benzodiazepines.

Conditional and transgenic mouse models as tools to study the role of TGFbeta, BMP signaling in skeletal development

Die TGFbeta/BMP Signaltransduktionskaskade ist wichtig für viele Entwicklungsprozesse fast aller embryonaler sowie extraembryonaler Gewebe und sie ist ebenso essentiell bei der Aufrechterhaltung der Homöostase im adulten Organismus. In vielen Mausmodellen und Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Liganden dieses Signalweges in verschiedene Stadien der Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. BMPs sind beispielsweise maßgeblich an der frühen Kondensation und Bildung des Knorpels und später an Proliferation und Hypertrophie der Chondrozyten beteiligt. BMPs können ektopisch Knochenbildung auslösen und das Expressionsmuster der Liganden und spezifischen Rezeptoren in der Wachstumsfuge lässt auf eine wichtige Rolle der BMPs in der Wachstumsfuge schließen. Der gezielte knock out der BMP-Rezeptoren Bmpr1a und Bmpr1b in proliferierenden Chondrozyten führt zur Ausbildung einer generellen Chondrodysplasie. Smad1, Smad5 und Smad8 sind die Mediatoren der BMP-Signalkaskade. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Funktion der Smad1- und Smad5-Proteine in der Wachstumsfuge untersucht werden. Hierzu wurden konditionale Smad1-knock out-Mäuse mit einer transgenen Mauslinie gekreuzt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in proliferierenden Chondrozyten exprimiert. Diese Mäuse wurden mit und ohne heterozygotem Smad5-Hintergrund charakterisiert. Bei einem knock out von Smad1 allein konnte ein leichte Verkürzung der Wachstumsfuge beobachtet werden, wobei prähypertrophe und hypertrophe Zone gleichermaßen betroffen waren. Dieser Phänotyp war verstärkt in Mäusen mit zusätzlichem heterozygotem Smad5-Hintergrund. Eine Verringerung der Proliferationsrate konnte zusammen mit einer verminderten Ihh-Expression nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte anhand von Röntgenaufnahmen eine Dysorganisation der nasalen Region und ein fehlendes nasales Septum beobachtet werden. Produktion und Mineralisation der extrazellulären Matrix waren nicht beeinträchtigt. Um die Rolle der BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden während der endochondralen Ossifikation zu vergleichen, wurden transgene Mäuse generiert, in denen die TGFbeta-Signalkaskade spezifisch in proliferierenden Chondrozyten gestört war. Zwei Mauslinien, die ähnliche Phänotypen zeigten, wurden untersucht. Esl1 ist ein TGFbeta-bindendes Protein, von dem man annimmt, dass es die TGFbeta-Signalkaskade inhibieren kann. Esl1-knock out-Mäuse sind kleiner als Wildtypmäuse und die Überexpression von Esl1 in proliferierenden Chondrozyten führt zu einer Verlängerung der Wachstumsfuge und einer verstärkten Proliferationsrate. Knorpelmarker, wie Col2a1 und Sox9 sind in diesen Mäusen herunterreguliert, während Col10a1 und Ihh als Marker für die hypertrophe und prähypertrophe Zone herunterreguliert waren. Dies führt zu der Annahme, dass mehr Zellen in die terminale Differenzierung eintreten. Bei transgenen Mäusen, in denen ein dominant-negativer (dn) TGFbeta-Rezeptor in proliferierenden Chondrozyten überexprimiert wurde, konnte eine verlängerte prähypertrophe Zone, eine erhöhte Ihh-Expression, sowie eine verstärkte Proliferationsrate beobachtet werden. Zusätzlich konnte in homozygoten Tieren ein craniofacialer Phänotyp beschrieben werden, der zu Problemen bei der Nahrungsaufnahme und damit zu einer starken Wachstumsbeeinträchtigung führte. Die BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden haben möglicherweise antagonistische Effekte in der Wachstumsfuge. Während der Ausfall von BMP in proliferierenden Chondrozyten aufgrund einer gesunkenen Proliferationsrate zu einer Verkürzung der Wachstumsfuge führte, kann man in Mäusen mit einer Störung der TGFbeta-Signalkaskade eine verstärkte Proliferation in einer daher verlängerten Wachstumsfuge beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Generation einer transgenen Mauslinie, die die Cre-Rekombinase spezifisch in hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Promoterstudien mit transgenen Mäusen weisen darauf hin, dass ein putatives AP1-Element, etwa 4 kb vor dem ersten Exon des Col10a1 gelegen, wichtig für die spezifische Expression in hypertrophen Chondrozyten ist. Ein Konstrukt, dass vier Kopien dieses Elements und den basalen Promoter enthält, wurde benutzt, um die Cre-Rekombinase spezifisch zu exprimieren. Diese Mauslinie befindet sich in der Testphase und erste Daten deuten auf eine spezifische Expression der Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrozyten hin.

Specific PET-ligands for selected 5-HT and GABA A-receptor subtypes = PET-Liganden mit Spezifität für definierte 5-HT und GABA A-Rezeptor-Subtypen

Für diese Arbeit wurden sechs neue Benzodiazepinderivate, TC07, TC08, TC09, TC10, TC11 und TC12, hergestellt. Diese wurden mittels Radioligandenbindungsassay sowohl auf ihre Bindungseigenschaften für Membranen des Cerebellum, des Hippo-campus und des Cortex der Ratte hin untersucht, als auch für Membranen von HEK293 Zellen, die transient rekombinante GABAA Rezeptoren exprimierten. Zusätz-lich wurden kompetitive in situ Rezeptorautoradiographien an Rattenhirnschnitten mit den Liganden [3H]Ro15-4513 und [3H]R015-1788 durchgeführt. Zusammen ergaben sich aus diesen Experimenten deutliche Hinweise auf eine Selektivität der Verbindun-gen TC07, TC11 und TC12 für a5-Untereinheiten enthaltende GABAA Rezeptoren mit a5-Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich. In vivo Bindungsexperimente in Ratten, mit [3H]Ro15-1788 als Tracer und TC07 als Kompetitor, ergaben, dass TC07 mehr [3H]Ro15-1788 im Vorderhirn als im Cerebellum verdrängt. Bezog man die regionale Verteilung der a5-Untereinheit des GABAA Rezep-tors im Rattenhirn mit ein – sehr wenige a5-Untereinheiten im Cerebellum, etwa 20 % der GABAA Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus – untermauerten diese Ergeb-nisse die Vermutung, TC07 könne a5-selektiv sein. Diese Daten bestätigten darü-berhinaus, dass TC07 die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Für elektrophysiologische Messungen mit TC07 und TC12 wurden die oben erwähnten transient transfizierten HEK293 Zellen verwendet, welche die GABAA Rezeptor Unte-reinheitenkombination a5b3g2 exprimierten. Das Dosis-Antwort Verhalten ergab keinen signifikanten Effekt für TC12. Die Daten von TC07 dagegen lassen auf einen schwach negativ modulatorischen Effekt schließen, was, zumindest theoretisch, die Möglichkeit eröffnet, TC07 auch als sogenannten cognitive enhancer einzusetzen. Der errechnete Ki-Wert lag in derselben Größenordnung wie der Ki-Wert, der anhand der Bindungsas-saydaten errechnet wurde. Insgesamt rechtfertigen die bisherigen Ergebnisse die radiochemische Markierung mit 18F von drei der sechs getesteten Verbindungen in der Reihenfolge TC07, TC12 und TC11. Des Weiteren wurde [18F]MHMZ, ein potentiell 5-HT2A selektiver Ligand und PET-Tracer einschließlich Vorläufer und Referenzverbindungen, mit hohen Ausbeuten syn-thetisiert (Herth, Debus et al. 2008). Autoradiographieexperimente mit Rattenhirn-schnitten zeigten hervorragende in situ Bindungseigenschaften der neuen Verbindung. Die Daten wiesen eine hohe Selektivität für 5-HT2A Rezeptoren in Verbindung mit einer niedrigen unspezifischen Bindung auf. [18F]MHMZ erfährt in vivo eine schnelle Metabo-lisierung, wobei ein polarer aktiver Metabolit entsteht, welcher vermutlich nicht die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Transversale, sagittale und coronale Kleintier-PET-Bilder des Rattenhirns zeigten eine hohe Anreicherung im frontalen Cortex und im Striatum, während im Cerebellum so gut wie keine Anreicherung festzustellen war. Diese Verteilung deckt sich mit der bekann-ten Verteilung der 5-HT2A Rezeptoren. Die in vivo Anreicherung scheint sich ebenfalls gut mit der Verteilung der in den Autoradiographieexperimenten gemessenen Bindung zu decken. Nach Berechnungen mit dem 4-Parameter Referenzgewebe Modell beträgt das Bindungspotential (BP) für den frontalen Cortex 1,45. Das Cortex zu Cerebellum Verhältnis wurde auf 2,7 nach 30 Minuten Messzeit bestimmt, was bemerkenswert nah an den von Lundkvist et al. für [11C]MDL 100907 publizierten Daten liegt. Abgesehen von der etwas niedrigeren Affinität waren die gemessenen in vitro, in situ und in vivo Daten denen von [3H]MDL 100907 und [11C]MDL 100907 sehr ähnlich, so dass wir ein [18F]Analogon in der Hand haben, das die bessere Selektivität von MDL 100907 verglichen mit Altanserin mit der längeren Halbwertszeit und den besse-ren Eigenschaften für die klinische Routine von 18F verglichen mit 11C verbindet. Die Ergebnisse von [18F]MHMZ rechtfertigenden weitere Experimente, um diesen Liganden für die klinische Routine am Menschen nutzbar zu machen.