Untersuchung der lateralen Organisation und Phasenumwandlung von festkörperunterstützten Lipidmembranen

Im ersten Teil der Arbeit wurde das Bindungsverhalten von Annexin A1 und Annexin A2t an festkörperunterstützte Lipidmembranen aus POPC und POPS untersucht. Für beide Proteine konnte mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass irreversible Bindung nur in Anwesenheit von POPS auftritt. Durch rasterkraftmikroskopische Aufnahmen konnte die laterale Organisation der Annexine auf der Lipidmembran dargestellt werden. Beide Proteine lagern sich in Form lateraler Aggregate (zweidimensionale Domänen) auf der Oberfläche an, außerdem ist der Belegungsgrad und die Größe der Domänen von der Membranzusammensetzung und der Calciumkonzentration abhängig. Mit zunehmendem POPS-Gehalt und Calciumkonzentration steigt der Belegungsgrad an und der mittlere Domänenradius wird kleiner. Diese Ergebnisse konnten in Verbindung mit detaillierten Bindungsstudien des Annexins A1 mit der Quarzmikrowaage verwendet werden, um ein Bindungsmodell auf Basis einer heterogenen Oberfläche zu entwickeln. Auf einer POPC-reichen Matrix findet reversible Adsorption statt und auf POPS-reichen Domänen irreversible Adsorption. Durch die Anpassung von dynamischen Monte Carlo-Simulationen basierend auf einer zweidimensionalen zufälligen sequentiellen Adsorption konnten Erkenntnisse über die Membranstruktur und die kinetischen Ratenkonstanten in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration und der Inkubationszeit des Proteins gewonnen werden. Die irreversible Bindung ist in allen Calciumkonzentrationsbereichen schneller als die reversible. Außerdem zeigt die irreversible Adsorption eine deutlich stärkere Abhängigkeit von der Calciumkonzentration. Ein kleinerer Belegungsgrad bei niedrigen Ca2+-Gehalten ist hauptsächlich durch die Abnahme der verfügbaren Bindungsplätze auf der Oberfläche zu erklären. Die gute Übereinstimmung der aus den Monte Carlo-Simulationen erhaltenen Domänenstrukturen mit den rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen und die Tatsache, dass sich die simulierten Resonanzfrequenzverläufe problemlos an die experimentellen Kurven aus den QCM-Messungen anpassen ließen, zeigt die gute Anwendbarkeit des entwickelten Simulationsprogramms auf die Adsorption von Annexin A1. Die Extraktion der kinetischen Parameter aus dem zweidimensionalen RSA-Modell ist mit Sicherheit einem einfachen Langmuir-Ansatz überlegen. Bei einem Langmuir-Modell erfolgt eine integrale Erfassung einer einzelnen makroskopischen Geschwindigkeitskonstante, während durch das RSA-Modell eine differenzierte Betrachtung des reversiblen und irreversiblen Bindungsprozesses möglich ist. Zusätzlich lassen sich mikroskopische Informationen über die Oberflächenbeschaffenheit gewinnen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das thermotrope Phasenverhalten von festkörperunterstützten Phospholipidbilayern untersucht. Dazu wurden mikrostrukturierte, frei stehende Membranstreifen präpariert und mit Hilfe der bildgebenden Ellipsometrie untersucht. Dadurch konnten die temperaturabhängigen Verläufe der Schichtdicke und der lateralen Membranausdehnung parallel beobachtet werden. Die ermittelten Phasenübergangstemperaturen von DMPC, diC15PC und DPPC lagen 2 - 3 °C oberhalb der Literaturwerte für vesikuläre Systeme. Außerdem wurde eine deutliche Verringerung der Kooperativität der Phasenumwandlung gefunden, was auf einen großen Einfluss des Substrats bei den festkörperunterstützten Lipidmembranen schließen lässt. Zusätzlich wurde ein nicht systematischer Zusammenhang der Ergebnisse von der Oberflächenpräparation gefunden, der es unabdingbar macht, bei Untersuchungen von festkörperunterstützten Substraten einen internen Standard einzuführen. Bei der Analyse des thermotropen Phasenübergangsverhaltens von DMPC/Cholesterol - Gemischen wurde daher die individuelle Adressierbarkeit der strukturierten Lipidmembranen ausgenutzt und ein Lipidstreifen aus reinem DMPC als Standard verwendet. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass das für Phospholipide typische Phasenübergangsverhalten ab 30 mol% Cholesterol in der Membran nicht mehr vorhanden ist. Dies ist auf die Bildung einer nur durch höhere Sterole induzierten fluiden Phase mit hoch geordneten Acylketten zurückzuführen. Abschließend konnte durch die Zugabe von Ethanol zu einer mikrostrukturierten DMPC-Membran die Bildung eines interdigitierten Bilayers nachgewiesen werden. Die bildgebende Ellipsometrie ist eine sehr gute Methode zur Untersuchung festkörperunterstützter Lipidmembranen, da sie über ein sehr gutes vertikales und ein ausreichendes laterales Auflösungsvermögen besitzt. Sie ist darin zwar einem Rasterkraftmikroskop noch unterlegen, besitzt dafür aber eine einfachere Handhabung beim Umgang mit Flüssigkeiten und in der Temperierung, eine schnellere Bildgebung und ist als optische Methode nicht-invasiv.

Festkörperunterstützte Lipid-Modellmembranen auf Gold zur Rekonstitution von Membranproteinen

Festkörperunterstützte Lipid-Modellmembranen auf Goldzur Rekonstitution von Membranproteinen Ziel der Arbeit war der Aufbau von Lipid-Modellmembranen auf Goldelektroden in welchen die funktionelle Aktivität von rekonstituierten Membranproteinen über elektrochemische Methoden nachgewiesen werden kann.Im Rahmen der Arbeit wurden Lipidbilayer mit und ohne hydrophile Ethylenglykol-Spacer durch Kombination von Selbstorganisation, Langmuir-Blodgett-Kuhn-Techniken und Vesikelfusion aufgebaut. Dabei dienten Thiolipide zur Verankerung der Membranen auf der Goldelektrode und es wurden diverse Wege verfolgt, deren Ankerdichte auf dem Substrat einzustellen.Eine Studie zum Aufbau von festkörperunterstützten Lipidbilayern durch Fusion von Vesikeln auf binäre Alkanthiol-/Hydroxythiol-Monolagen mit definierter Oberflächenenergie zeigte, daß eine minimale Grenzflächenenergie (Monolayer/Wasser) existiert, unterhalb welcher die Fusion nicht mehr zu einer zusätzlichen Monolage, sondern lediglich zur Ausbildung von adsorbierten oder teilgespreiteten Vesikeln führt.Zur Charakterisierung der Membranen wurden Oberflächenplasmonenresonanz, Impedanzspektroskopie, zyklische Voltammetrie, elektrochemische reduktive Desorption, Rasterkraftmikroskopie und Kontaktwinkelmessungen herangezogen.In die Modellmembranen wurden Membranproteine (Porin, Annexin V, H+-ATPase) sowie ganze Membranfragmente (Bande 3 aus roten Blutzellen) rekonstituiert und mittels elektrochemischer Methoden auf ihre funktionelle Aktivität überprüft.

Synthese und Untersuchung von neuen Alpha,Omega-funktionalisierten Lipopolymeren zum Aufbau von polymerunterstützten Lipiddoppelschichten

Ziel dieser Arbeit war es hydrophile Lipopolymere darzustellen, mit denen es möglich sein sollte polymerunterstützte Lipiddoppelschichten auf festen Substratoberflächen zu fixieren. Die Polymere sollten einen Oberflächenanker, eine lipophile Gruppe und ein hydrophiles Polymerrückgrat enthalten. Hierzu wurden Alpha,Omega-funktionalisierte Polymere ausgehend von lipophilen Initiatoren dargestellt. Ausgehend von hydrophoben 2-Brompropionsäureamiden konnte eine kontrollierte radikalische Polymerisation (ATRP) von verschiedenen Acrylamiden durchgeführt werden. So wurden verschiedene Copolymere aus Acrylamid, N-Isopropylacrylamid und N-(3-Dimethylaminopropyl)-acrylamid synthetisiert. Der Einbau des Oberflächenankers als Funktionalität erfolgte indirekt durch Polymerisation eines N-Acryloxysuccinimid Endblocks, welcher in einer anschließenden polymeranalogen Reaktion mit Cysteaminmethyldisulfid umgesetzt wurde.In Ladungsuntersuchungen (PCD) konnte das pH-abhängige Verhalten der Polymere untersucht werden. Der Knäuelkollaps (LCST) der Poly-(N-isopropylacrylamide) wurde mittels Turbidimetrie und DSC charakterisiert. Die Adsorption der Polymere auf Goldoberflächen wurde mit Hilfe der Oberflächenplasmonen Spektroskopie (SPS) aus wässriger Lösung nachgewiesen werden. Dabei bildeten sich ultradünne Filme von 15-20 Å Dicke aus. Kontaktwinkelmessungen wiesen diesen adsorbierten Polymerfilmen ein sehr hydrophiles Verhalten nach. In Lösung adsorbierten die Polymere auf Vesikeloberflächen. Auf ultradünnen Polymerfilmen adsorbierten die Vesikel, wobei mit Hilfe der SPS eine Dickenzunahme um etwa 50 Å nachgewiesen werden konnte. Die ultradünnen Filme der Poly(N-isopropylacrylamide) wiesen eine temperaturabhängige Attraktivität gegenüber Vesikeln auf. Durch gezielte Polystyrol-Entnetzung konnten strukturierte Träger erhalten werden.

Kontaktmechanik und Strukturierung von festkörperunterstützen Lipidmembranen

Die vorliegende Arbeit beschreibt unter anderem die Realisierung eines Assays aus mikrostrukturierten und selektiv funktionalisierten künstlichen Membransegmenten auf einem Chip. Die Strukturierungsmethode kombiniert die softlithographische Technik des Mikroformens in Kapillaren mit der Vesikelspreittechnik und bietet ein elegantes Verfahren, einzeln adressierbare Lipidsegmente im Mikrometer Regime zu erzeugen. Unter Berücksichtigung des hydrodynamischen Fließverhaltens und der Stabilitätskriterien für PDMS-Elastomere wurden außerdem neue Strukturen entwi-ckelt, die für den kombinierten Einsatz von Rasterkraftmikroskopie und Fluoreszenz-mikroskopie optimiert sind. Die Anwendbarkeit des Lab-On-A-Chip-Devices als Bio-sensor wurde durch zwei prominente Protein-Rezeptor-Bindungsstudien fluores-zenzmikroskopisch und rasterkraftmikroskopisch belegt. Im zweiten Teil der Arbeit sind die mechanischen und adhäsiven Eigenschaften aus-gewählter Lipidsysteme mit einer neuen Charakterisierungstechnik untersucht wor-den, die die Kontaktmechanik von Rastersonden und Lipidmembranen auf Basis der Digitalisierung von Hochgeschwindigkeitskraftkurven und einer automatisierten Multi-parameteranalyse quantitativ erfasst. Dabei konnte die Korrelation zwischen der Ad-häsion und den materialspezifischen Durchbruchlängen und Durchbruchkräften, die charakteristische Stabilitätsparameter der Lipidmembran darstellen, auf Systemen mit variierenden Kopfgruppen und Kettenlängen analysiert werden. Das Verfahren erlaubte zudem die simultane Quantifizierung der elastischen Eigenschaften der Li-piddoppelschichten. Zu den Kraftkurven wurden Simulationen der Systemantwort durchgeführt, die ein tieferes Verständnis der Kontrastentstehung ermöglichen.

Biomimetic bilayer membranes made from polymers and lipids

Amphiphile Blockcopolymere sind in der Lage in Wasser Morphologien auszubilden, die analog sind zur hydrophil-hydrophob-hydrophil-Struktur von natürlichen Lipiddoppelschichten. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal die Präparation und Charakterisierung von oberflächengestützten Polymerdoppelschichten aus Polybutadien-b-Polyethylenoxid (PB-PEO) beschrieben. Für die Herstellung dieser Strukturen wurden zwei unterschiedliche Präparationsstrategien verfolgt. Der erste Weg besteht aus einer zweistufigen Methode, bei der im ersten Schritt organisierte Monoschichten mittels Langmuir-Blodgett-Transfer auf Gold übertragen und kovalent angebunden werden. Im zweiten Schritt werden hydrophobe Wechselwirkungen ausgenutzt, um über Langmuir-Schaefer-Transfer eine weitere Schicht aufzubringen. Somit wurden homogene Architekturen erzeugt, die oberflächengestützten Lipiddoppelschichten gleichen. Als alternativer, einstufiger Ansatz zur Herstellung von Polymerdoppelschichten wurde das Spreiten von Polymervesikeln auf Gold verfolgt. Auch hierdurch ließen sich Doppelschichtstrukturen mit einer vollständigen Oberflächenbedeckung erzeugen. Die hergestellten Polymerdoppelschichten besitzen eine Dicke von 11-14 nm, die von der Präparationsmethode abhängt. Die Polymerstrukturen weisen bei Trocknung für 1.5 h eine Stabilität gegenüber Luft auf. Bei längeren Trocknungszeiten von ca. 12 h kommt es zu einer Reorganisation der Oberfläche. Dies deutet darauf hin, dass Wasser dazu notwendig ist die Strukturen auf lange Sicht zu stabilisieren. Um die Biokompatibilität der Polymerschichten nachzuweisen, wurden die Wechselwirkungen mit dem membranaktiven Peptid Polymyxin B und dem Transmembranprotein α-Haemolysin gezeigt. Mobilität ist ein wichtiger Faktor für die korrekte Funktion vieler Transmembranproteine. Um die laterale Diffusionsdynamik innerhalb der künstlichen Strukturen zu untersuchen, wurde die Mobilität eines integralen Modellpeptids und von fluoreszierenden Membransonden gemessen. Es konnte mit einzelmolekülempfindlichen Techniken gezeigt werden, dass das α-helikale Peptid und die kleinen Fluoreszenzfarbstoffe frei im hydrophoben Kern der Polymerdoppelschicht diffundieren können. Die Diffusion von beiden Spezies scheint stark von der Fluidität der Polymermatrix beeinflusst zu sein. Ein weiterer Teil dieser Arbeit widmet sich der Entwicklung eines angemessenen, lipidbasierten Referenzsystems für zukünftige Proteinuntersuchungen. Hierzu wurde eine neue Methode zu Herstellung von peptidgestützten Lipiddoppelschichtmembranen entwickelt. Dies wurde durch kovalente Befestigung eines Thiopeptids an einen Goldfilm und darauffolgende Anbindung eines Lipids erreicht. Zur Ausbildung der Lipiddoppelschicht auf dem Lipopeptidunterbau wurder der Rapid Solvent Exchange verwendet. Die Ausbildung der Lipiddoppelschicht wurde sowohl auf microskopischer als auch auf makroskopischer Ebene nachgewiesen. Im letzten Schritt wurde die Anwendbarkeit des Modelsystems für elektrochemische Messungen durch den funktionalen Einbau des Ionentransporters Valinomycin unter Beweis gestellt.

From lipid bilayers to synaptic vesicles: atomic force microscopy on lipid-based systems

The aim of this thesis was to apply the techniques of the atomic force microscope (AFM) to biological samples, namely lipid-based systems. To this end several systems with biological relevance based on self-assembly, such as a solid-supported membrane (SSM) based sensor for transport proteins, a bilayer of the natural lipid extract from an archaebacterium, and synaptic vesicles, were investigated by the AFM. For the characterization of transport proteins with SSM-sensors proteoliposomes are adsorbed that contain the analyte (transport protein). However the forces governing bilayer-bilayer interactions in solution should be repulsive under physiological conditions. I investigated the nature of the interaction forces with AFM force spectroscopy by mimicking the adsorbing proteoliposome with a cantilever tip, which was functionalized with charged alkane thiols. The nature of the interaction is indeed repulsive, but the lipid layers assemble in stacks on the SSM, which expose their unfavourable edges to the medium. I propose a model by which the proteoliposomes interact with these edges and fuse with the bilayer stacks, so forming a uniform layer on the SSM. Furthermore I characterized freestanding bilayers from a synthetic phospholipid with a phase transition at 41°C and from a natural lipid extract of the archaebacterium Methanococcus jannaschii. The synthetic lipid is in the gel-phase at room temperature and changes to the fluid phase when heated to 50°C. The bilayer of the lipid extract shows no phase transition when heated from room temperature to the growth temperature (~ 50°C) of the archeon. Synaptic vesicles are the containers of neurotransmitter in nerve cells and the synapsins are a family of extrinsic membrane proteins, that are associated with them, and believed to control the synaptic vesicle cycle. I used AFM imaging and force spectroscopy together with dynamic light scattering to investigate the influence of synapsin I on synaptic vesicles. To this end I used native, untreated synaptic vesicles and compared them to synapsin-depleted synaptic vesicles. Synapsin-depleted vesicles were larger in size and showed a higher tendency to aggregate compared to native vesicles, although their mechanical properties were alike. I also measured the aggregation kinetics of synaptic vesicles induced by synapsin I and found that the addition of synapsin I promotes a rapid aggregation of synaptic vesicles. The data indicate that synapsin I affects the stability and the aggregation state of synaptic vesicles, and confirm the physiological role of synapsins in the assembly and regulation of synaptic vesicle pools within nerve cells.

Herstellung und physikochemische Charakterisierung von planaren gestützten Lipid-Modellmembran-Systemen

Es wurden funktionalisierte polymerunterstützte planare Phospholipid-Modellmembran-Systeme hergestellt und auf jeder Präparationsstufe eingehend charakterisiert. Dünne Polysaccharidfilme wurden in der Form von quellbaren Gelen auf oxidische Oberflächen aufgebracht und bezüglich ihres Quellungsverhaltens und der Oberflächeneigenschaften in Abhängigkeit vom Wassergehalt untersucht. Lipidmonoschichten unterschiedlicher Zusammensetzung wurden mittels Langmuir-Blodgett-Tranfer auf Polymersubstrate übertragen und bezüglich der Stärke der Lipid/Polymer Wechselwirkung, der lateralen Selbstdiffusion in Abhängigkeit von der Wasseraktivität, dem Spreitverhalten der monomolekularen Membran auf dem Substrat in Abhängigkeit von der Wasseraktivität und dem Lateraldruck der Monoschicht, sowie des Ausmaßes der Hydratation im Kopfgruppenbereich der Lipidmembran in Abhängigkeit von der Wasseraktivität mittels Fluoreszensondenmethoden (Fluoreszenzerholung nach Photobleichung (FRAP), Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzspektroskopie) untersucht. Diffusions- und Spreitverhalten von amphiphilen Monoschichten auf Polymersubstraten wurden auf der Basis von in dieser Arbeit entwickelten physikalischen Modellen diskutiert. Mittels Langmuir-Schäfer Transfer wurde auf polymerunterstützte Lipidmonoschichten eine zweite Monoschicht übertragen. Die somit erhaltenen Lipid-Doppelschichtmembranen wurden bezüglich ihrer Stabilität, der lateralen Struktur, der lateralen Selbstdiffusion, des Spreitverhaltens auf unbedeckte Bereiche sowie der Stärke der Membran/Substrat Wechselwirkung vermittels Fluoreszenzmikroskopie, FRAP und Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (RICM) untersucht. Schließlich wurden substratgestützte Doppelschicht-Lipidmembranen mit als Protonenpumpen fungierenden integralen Membranproteinen versehen. Die laterale Selbstdiffusion der rekonstituierten Proteinmoleküle wurde mittels FRAP, die funktionale Aktivität der Protonenpumpen mit einem Ionen-sensitiven Feldeffekttransistor-Array analysiert.

Design, synthesis and application of ultrastable rylene dyes for fluorescent labeling of biomolecules

Studies of organic fluorescent dyes are experiencing a renaissance related to the increasing demands posed by new microscopy techniques for high resolution and high sensitivity. While in the last decade single molecule equipment and methodology has significantly advanced and in some cases reached theoretical limits (e.g. detectors approaching unity quantum yields) unstable emission from chromophores and photobleaching become more and more the bottleneck of the advancement and spreading of single-molecule fluorescence studies. The main goal of this work was the synthesis of fluorophores that are water-soluble, highly fluorescent in an aqueous environment, have a reactive group for attachment to a biomolecule and posses exceptional photostability. An approach towards highly fluorescent, water-soluble and monofunctional perylene-3,4,9,10-tetracarboxdiimide and terrylene-3,4:11,12-tetra carboxidiimide chromophores was presented. A new synthetic strategy for the desymmetrization of perylenetetracarboximides was elaborated; water-solubility was accomplished by introducing sulfonyl substituents in the phenoxy ring. Two strategies have been followed relying on either non-specific or site specific labeling. For this purpose a series of new water-soluble monofunctional perylene and terrylene dyes, bearing amine or carboxy group were prepared. The reactivity and photophysical properties of these new chromophores were studied in aqueous medium. The most suitable chromophores were further derivatized with amine or thiol reactive groups, suitable for chemical modification of proteins. The performance of the new fluorescent probes was assessed by single molecule enzyme tracking, in this case phospholipase acting on phospholipid supported layers. Phospholipase-1 (PLA-1) was labeled with N-hydroxysuccinimide ester functionalized perylene and terrylene derivatives. The purification of the conjugates was accomplished by novel convenient procedure for the removal of unreacted dye from labeled enzymes, which involves capturing excess dye with a solid support. This novel strategy for purification of bioconjugates allows convenient and fast separation of labeled proteins without the need for performing time consuming chromatographic or electrophoretic purification steps. The outstanding photostability of the dyes and, associated therewith, the extended survival times under strong illumination conditions allow a complete characterization of enzyme action on its natural substrates and even connecting enzyme mobility to catalytic activity. For site-specific attachment of the rylene dyes to proteins the chromophores were functionalized with thioesters or nitrilotriacetic acid groups. This allowed attachment of the emitters to the N-terminus of proteins by native chemical ligation or complexation with His-tagged polypeptides at the N- or C-termini, respectively. The synthesis of a water-soluble perylenebis (dicarboximide) functionalized with a thioester group was presented. This chromophore exhibits an exceptional photostability and a functional unit for site-specific labeling of proteins. The suitability of the fluorophore as a covalent label was demonstrated via native chemical ligation with protein containing N-terminal cystein residue. We exploited also oligohisitidine sequences as recognition elements for site-selective labeling. The synthesis of a new water-soluble perylene chromophore, containing a nitrilotriacetic acid functional group was demonstrated, using solution-phase and solid-phase approaches. This chromophore combines the exceptional photophysical properties of the rylene dyes and a recognition unit for site-specific labeling of proteins. An important feature of the label is the unchanged emission of the dye upon complexation with nickel ions.

Structural characterisation of tBLMs

Biological membranes are one of the vital key elements of life but are also highly complex architectures. Therefore, various model membrane systems have been developed to enable systematic investigations of different membrane related processes. A biomimetic model architecture should provide a simplified system, which allows for systematic investigation of the membrane while maintaining the essential membrane characteristics such as membrane fluidity or electrical sealing properties. This work has been focused on two complementary parts. In a first part, the behaviour of the whey protein ß-lactoglobulin (ßlg) at a membrane interface has been investigated. Protein-lipid interactions have been studied using Langmuir monolayers at the air-water interface and tethered bilayer lipid membranes. A combination of different surface analytical techniques such as surface plasmon spectroscopy, neutron reflectivity and electrochemical techniques allowed for a detailed analysis of the underlying processes. Those experiments showed that the protein adsorbed in native confirmation, slightly flattened, to hydrophobic monolayers. If hydrophilic bilayers with defects were present, ßlg penetrated the upper layer. Interactions with phospholipids were only observed if the protein was denatured beforehand. Experiments at the air-water interface showed a more rigid conformation of the protein at acidic pH compared to alkaline pH. In the second part of this work, the structure of different model membrane systems has been investigated. Solid supported membrane systems have been established as powerful biomimetic architectures, which allow for the systematic investigation of various membrane related processes. Additionally, these systems have been proposed for biosensing applications. Tethered bilayer lipid membranes (tBLMS) are one type of solid supported membranes. The structure of the anchor lipid that tethers the membrane to the solid support has a significant impact on the membrane properties. Especially the sub-membrane part, which is defined by the spacer group, is important for the biological activity of incorporated membrane proteins. Various anchor lipids have been synthesised with different spacer and anchor groups. An increase of the spacer length led to a direct increase of the water reservoir beneath the membrane. However, this elongation also resulted in an amplified roughness of the monolayer and subsequently to diminished mechanical and electrical bilayer qualities. Additionally, a cholesterol-spacer had been designed to modulate the membrane fluidity. Model membrane systems with additional cholesterol-spacer or upper bilayer leaflets with additional cholesterol also exhibited an increased water reservoir with only slightly diminished mechanical and electrical abilities. Both parts show that tBLMs are very effective model systems that can be applied as biomimetic platforms to study for example lipid-protein interactions. They also enable the incorporation of ion channels and allow for potential biosensing application.

In-vitro synthesis and reconstitution of cytochrome bo 3 ubiquinol oxidase in artificial membranes

Forschung über Membranenproteine stellt strenge Hindernisse, seit ruhigem gerade wenige Beispiele der Membranenproteinsorten sind gekennzeichnet worden in den verwendbaren experimentellen Plattformen gegenüber. Die Hauptherausforderung ist, ihre ausgezeichnete entworfene strukturelle Vollständigkeit zu konservieren, während die Ausdruck-, Lokalisierungs- und Wiederherstellungprozesse auftreten. In-vitro übersetzungssysteme können Vorteile über auf Zellenbasisgenausdruck zum Beispiel haben, wenn das über-ausgedrückte Produkt zur Wirtszelle giftig ist oder wenn fehlende Pfosten-Übersetzungsänderung in den bakteriellen Ausdrucksystemen die Funktionalität der Säugetier- Proteine oder Mangel an vorhandenem Membranenraum verdirbt, Funktionsausdruck verbieten.rn Der Nachahmer von biologische Membranen wie feste gestützte Lipidmembranen sind als Plattform am meisten benutzt, Proteinmembraneninteraktionen nachzuforschen. Wir sind in der Lage, Membranenproteinsorte, da wir eine Plattform für Membranenproteinsynthese vorstellen, nämlich die in-vitrosynthese der Membranenproteine in ein Peptid gestütztes Membranensystem zu adressieren. Die Wiederherstellung der Membranenproteine in den Lipid bilayers resultiert im Allgemeinen mit verschiedenen Proteinanpassungen. Als Alternative erforschen wir dieses System zum ersten Mal, um genaueres Modell zu den zellularen Membranen zu verursachen und ihre Funktion, wie Proteineinfügung, Proteinfunktion und Ligandinteraktionen nachzuahmen.rn In dieser Arbeit ist unser Ziel, komplizierte Transmembraneproteine, wie des Cytochrome bo3-ubiquinol Oxydase (Cyt-bo3) direkt innerhalb der biomimetic vorbildlichen Membrane zu synthetisieren. In unserem System wird festes gestütztes tBLM wie, P19/DMPE/PC als Plattform benutzt. Dieses künstliche Membranensystem mimiks die amphiphile Architektur eines Zelle-abgeleiteten Membranensystems.rn

Bio-inspired polymer-supported nitrido molybdenum(VI) complexes for ammonia synthesis − reactivity towards protons and electrons : EPR investigations on paramagnetic molybdenum(V) and copper(II) complexes

Die biologische Stickstofffixierung durch Molybdän-haltige Nitrogenasen sowie die Erforschung des zugrundeliegenden komplexen Mechanismus (N2-Aktivierung an Metall-Zentren, 6-fache Protonierung und Reduktion, N–N Bindungsspaltung unter Bildung von Ammoniak) ist von erheblichem Interesse. Insbesondere Molybdän-Komplexe wurden bereits erfolgreich als Modellverbindungen für die Untersuchung elementarer Einzelschritte der N2-Aktivierung eingesetzt. Durch die Verwendung von Triamidoamin-Liganden ist es Schrock et al. sogar gelungen mehrere Katalysezyklen zu durchlaufen und einen Mechanismus zu formulieren. Trotz der sterisch anspruchsvollen Substituenten in den Schrock-Komplexen ist die Umsatzrate dieses homogenen Katalysators, aufgrund Komplex-Deaktivierung infolge intermolekularer Reaktionen wie Dimerisierung und Disproportionierung, limitiert. In der vorliegenden Arbeit wurden einige dieser Herausforderungen angegangen und die aktiven Spezies auf einer Festphase immobilisiert, um intermolekulare Reaktionen durch räumliche Isolierung der Komplexe zu unterdrücken.rnEin Polymer-verankertes Analogon des Schrock Nitrido-Molybdän(VI)-Komplexes wurde auf einem neuen Reaktionsweg synthetisiert. Dieser beinhaltet nur einen einzigen Reaktionsschritt, um die funktionelle Gruppe „MoN“ einzuführen. Protonierung des immobilisierten Nitrido-Molybdän(VI)-Komplexes LMoVIN (L = Polymer-verankerter Triamidoamin-Ligand) mit 2,6-Lutidinium liefert den entsprechenden Imido-Molybdän(VI)-Komplex. Durch anschließende Ein-Elektronen-Reduktion mit Cobaltocen wird der Polymer-angebundene Imido-Molybdän(V)-Komplex erhalten, bewiesen durch EPR-Spektroskopie (g1,2,3 = 1.989, 1.929, 1.902). Durch die Immobilisierung und die effektive räumliche Separation der Reaktionszentren auf der Festphase werden bimolekulare Nebenreaktionen, die oft in homogenen Systemen auftreten, unterdrückt. Dies ermöglicht zum ersten Mal die Darstellung des Imido-Molybdän(V)-Intermediates des Schrock-Zyklus.rnEPR-Spektren des als Spin-Label eingeführten immobilisierten Nitrato-Kupfer(II)-Komplexes wurden unter verschiedenen Bedingungen (Lösungsmittel, Temperatur) aufgenommen, wobei sich eine starke Abhängigkeit zwischen der Zugänglichkeit und Reaktivität der immobilisierten Reaktionszentren und der Art des Lösungsmittels zeigte. Somit wurde die Reaktivität von LMoVIN gegenüber Protonen und Elektronen, welches zur Bildung von NH3 führt, unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel untersucht und optimiert. Innerhalb des kugelförmigen Polymers verläuft die Protonierung und Reduktion von LMoVIN stufenweise. Aktive Zentren, die sich an der „äußeren Schale“ des Polymers befinden, sind gut zugänglich und reagieren schnell nach H+/e− Zugabe. Aktive Zentren im „Inneren des Polymers“ hingegen sind schlechter zugänglich und zeigen langsame diffusions-kontrollierte Reaktionen, wobei drei H+/e− Schritte gefolgt von einer Ligandenaustausch-Reaktion erforderlich sind, um NH3 freizusetzen: LMoVIN  LMoVNH  LMoIVNH2  LMoIIINH3 und anschließender Ligandenaustausch führt zur Freisetzung von NH3.rnIn einem weiteren Projekt wurde der Bis(ddpd)-Kupfer(II)-Komplex EPR-spektroskopisch in Hinblick auf Jahn−Teller-Verzerrung und -Dynamik untersucht. Dabei wurden die EPR-Spektren bei variabler Temperatur (70−293 K) aufgenommen. Im Festkörperspektrum bei T < 100 K erscheint der Kupfer(II)-Komplex als gestreckter Oktaeder, wohingegen das EPR-Spektrum bei höheren Temperaturen g-Werte aufzeigt, die einer pseudo-gestauchten oktaedrischen Kupfer(II)-Spezies zuzuordnen sind. Diese Tatsache wird einem intramolekularen dynamischen Jahn−Teller Phänomen zugeschrieben, welcher bei 100 K eingefroren wird.