Analysen zur Expression proinflammatorischer Mediatoren in humanen Zellkulturmodellen und murinen Tiermodellen chronisch-inflammatorischer Erkrankungen

Die humane induzierbare NO-Synthase (iNOS) spielt bei zahlreichen Erkrankungen wie Asthma, Krebs und der rheumatoiden Arthritis eine entscheidende Rolle. Durch Fehlregulation der iNOS-Expression kommt es häufig zu massiven Gewebeschädigungen. Aus diesem Grund ist es wichtig die Mechanismen der Genregulation der iNOS-Expression zu verstehen. Bei Affinitätschromatographie-Analysen wurde das zytosolische PolyA-bindende Protein (PABP) als direkter Interaktionspartner der 3´UTR der humanen iNOS identifiziert. Weitere Bindungsanalysen konnten eine spezifische Bindestelle für PABP in der 5´UTR und zwei Bindestellen im AU-reichen Bereich der 3´UTR der humanen iNOS nachweisen. Eine siRNA-mediierte Herabregulation von PABP mit Hilfe der stabilen Expression spezifischer siRNAs in DLD-1 Zellen (siPABP Zellen) zeigte eine signifikant verringerte Expression der humanen iNOS und damit einhergehend eine verringerte NO-Produktion nach Zytokinstimulation. Promotoranalysen zeigten keine Veränderung der Induzierbarkeit des humanen 16 kb iNOS-Promotors in siPABP Zellen. RNA-Stabilitätsanalysen zeigten einen verstärkten Abbau der iNOS-mRNA in diesen Zellen, so dass davon auszugehen ist, dass die Regulation der humanen iNOS über die mRNA-Stabilität erfolgt. Reportergen-Analysen mit Plasmiden, welche die 5’ und/oder 3’UTR Sequenzen der humanen iNOS mit den identifizierten PABP-Bindestellen oder Mutationen in diesen Bindestellen enthielten, zeigten, dass PABP die iNOS-mRNA über die 5´UTR stabilisiert und anscheinend über die 3´UTR einen destabilisierenden Effekt auf die mRNA ausübt. Ebenfalls scheint PABP über die 3’UTR dieTranslation der iNOS mRNA zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass PABP, über seine allgemeinen Funktionen hinaus, eine spezifische Rolle in der Regulation der Expression der humanen iNOS einnimmt.rnDie rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche Autoimmunerkrankung, welche überwiegend die peripheren Gelenke der Hände und Füße betrifft. Die aktuellen Therapiemöglichkeiten sind immer noch mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen behaftet und führen nicht zur vollständigen Remission der Erkrankung, so dass die Entwicklung neuer Medikamente unerlässlich ist. In dieser Arbeit wurden die antiinflammatorischen Substanzen Gallielalacton (Gal) und Oxacyclododecindion (Oxa) im Mausmodell der kollagen-induzierten Arthritis (CIA) getestet. Leider waren beide Substanzen nicht in der Lage die Symptome der CIA zu vermindern, obwohl beide im Modell der LPS-induzierten akuten Entzündung die Expression proinflammatorischer Mediatoren senken konnten. Die Substanz S-Curvularin (SC) hat sich im CIA-Modell bereits bewährt und wurde in dieser Arbeit weiter untersucht. SC war in der Lage die Expression knorpel- und knochendestruktiver Markergene signifikant zu verrindern. rnIn der vorliegenden Arbeit wurden neue microRNAs identifiziert, die in der Pathogenese der CIA eine Dysregulation zeigen. Die Expression dieser microRNAs wurde von SC wieder auf das Normalniveau gebracht, so dass SC eine vielversprechende Substanz in der Therapie chronisch inflammatorische Erkrangungen sein könnte. Die neu identifizierten CIA-relevanten microRNAs könnten als neueRA-Marker oder als Zielstrukturen für neue Medikamente dienen.rn

Erkennungssequenzen und strukturelle Elemente als Determinanten der regulierten Spaltung von Membranproteinen

Eine funktionell und strukturell diverse Gruppe von Transmembranproteinen wie beispielsweise Mediatoren und deren Rezeptoren können proteolytisch gespalten werden. Dieser Prozess wird als Shedding bezeichnet. Kürzlich konnte die proteolytische Aktivität identifiziert werden, die für die Prozessierung von proTNFa verantwortlich ist. Sie wurde TACE (TNF Alpha Converting Enzyme) genannt. In Experimenten mit TACE-/- Fibroblasten konnte ich herausfinden, dass das durch PMA induzierte Shedding des IL-6Rs stark reduziert war. Eine basale hydroxamatsensitive Freisetzung des IL-6Rs konnte allerdings noch detektiert werden. Um Unterschiede im Shedding von IL-6R und proTNFa zu untersuchen, generierte ich chimäre Proteine aus diesen beiden Proteinen, bei denen die Spaltstellenregionen gegeneinander vertauscht worden waren. TNFa Chimären zeigten nur sehr geringes Shedding. Im Gegensatz dazu wurden IL-6R Chimären, die die proTNFa Spaltstelle enthielten spontan gespalten. Die PMA-Induzierbarkeit war verloren gegangen. Daraufhin wurden verschiedene Chimären des unspaltbaren Proteins gp130 und der Spaltstellenpeptide aus TNFa, TGFa und IL-6R generiert. Hierbei wurde ein kurzes membranproximales Peptid aus gp130 gegen die Spaltstellen ausgetauscht. Diese Peptide übertrugen sowohl spontane ale auch PMA-induzierte Spaltbarkeit auf gp130. Um die minimalen Bedingungen für Shedding zu untersuchen, setzte ich verkürzte IL-6R Spaltstellenpeptide in gp130 ein. Die resultierenden Chimären waren empfänglich für reguliertes Shedding. Überaschenderweise konnten auch spaltbare Chimären durch das Ersetzen der membrannahem Region von gp130 durch die entsprechende Region aus dem ebenfalls nicht spaltbaren LIFR generiert werden.

Molekulare Reaktionsmuster in dendritischen Zellen nach Allergenexposition

Allergische Erkrankungen, wie zum Beispiel die allergische Rhinitis oder das allergische Asthma haben im Verlauf der letzten vier Jahrzehnte stark zugenommen. So leidet heute jeder vierte bis fünfte Mensch an einer Allergie. Ausgelöst wird diese IgE-vermittelte Hypersensibilitätsreaktion des Typs I (Allergie vom Soforttyp) von Allergenen und beruht auf der Aktivierung von Mastzellen durch die Interaktion eines Antigens mit dem an eine Mastzelle über die Fc-Rezeptoren gebundenen IgE-Moleküls. Die degranulierende Mastzelle sezerniert Mediatoren, was zu einem Auftreten von allergischen Symptomen führt. Die Bildung von IgE wird durch das von TH2-Zellen produzierte Zytokin IL-4 induziert. Das von TH1-Zellen produzierte Zytokin IFN- ist in der Lage die Sekretion von IL-4 zu inhibieren, wie auch IL-4 hemmend auf die Produktion von IFN- wirkt. Dieses TH1-/ TH2-Gleichgewicht ist bei allergischen Erkrankungen in Richtung TH2 verschoben. Allergene werden von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und auf der Zelloberfläche präsentiert. Die potentesten antigenpräsentierenden Zellen sind die dendritischen Zellen, die nach Kontakt mit einem Allergen in die benachbarten Lymphknoten wandern, ausreifen und kostimulatorische Moleküle exprimieren. Sie sind so in der Lage T-Zellen zu aktivieren und entweder in TH1- oder in TH2-Zellen differenzieren zu lassen. Die zytokinabhängige TH1- beziehungsweise TH2-Differenzierung führt zur Aktivierung der Januskinasen. Im aktiven Zustand phosphorylieren sie STAT-Moleküle, die dimerisieren und in den Zellkern translozieren, wo sie unter anderem als Transkriptionsfaktoren für Zytokingene dienen. Unreife humane dendritische Zellen von Allergikern zeigen nach Stimulation mit Proteinallergenen eine schnelle Phosphorylierung des mit der TH2-Entwicklung assoziierten STAT6. Dahingegen sind TH1-Antwort hervorrufende Kontaktallergene nicht in der Lage STAT6 oder andere STAT-Moleküle in dendritischen Zellen zu induzieren. Die Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA3 sind ebenfalls von Bedeutung für die TH1-/TH2-Entwicklung, da T-bet ausschließlich in TH1-Zellen, GATA3 nur in TH2-Zellen exprimiert wird. Die Regulation des JAK/STAT-Weg unterliegt den Molekülen der intrazellulär vorkommenden Familie der SOCS-Proteine. SOCS3 ist in TH2-Zellen höher exprimiert als SOCS1, wohingegen SOCS1 in TH1-Zellen eine erhöhte Expression gegenüber SOCS3 aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Proteinallergenen auf humane dendritische Zellen untersucht. Zunächst konnte eine morphologische Veränderung der unreifen dendritischen Zellen nach Kontakt mit dem Allergenextrakt beobachtet werden. Die beginnende Ausreifung der Zellen konnte mittels Durchflußzytometrie anhand der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, insbesondere aber über den Marker für reife dendritische Zellen CD83, nachgewiesen werden. Die zu beobachtende beginnende Ausreifung scheint ein Effekt des bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) zu sein, das in dem Allergenextrakt vorkommt, da sich durch Zugabe des kationischen Antibiotikums Polymyxin B die beginnende Reifung verhindern ließ. Auf RNA-Ebene war es im Rahmen dieser Arbeit möglich, den Einfluss verschiedener Allergene auf unreifen humanen dendritischen Zellen näher zu charakterisieren. So weisen unreife humane dendritische Zellen nach Kontakt mit Proteinallergenextrakt ein TH2-assoziiertes Genexpressionprofil auf, was sich durch eine erhöhte relative Expression der Gene SOCS3 und GATA3 auszeichnet. Im Gegensatz hierzu zeigen unreife humane dendritische Zellen nach Inkubation mit dem Kontaktallergen MCI/MI eine erhöhte relative Expression des Gens T-bet, was mit einer TH1-Antwort assoziiert ist. Nach Zugabe des „TH1-/ TH2-neutralen“ Tetanustoxoids konnten erhöhte relative Expressionen der Gene GATA3, T-bet und SOCS3 gemessen werden. Die Ergebnisse in dem in dieser Arbeit benutzten humanen in vitro System geben Anlass zur Hypothese, dass die Art der Immunantwort (TH1 versus TH2) sich bereits auf Ebene der dendritischen Zellen anbahnt. GeneChip-Analysen mittels High Density Micro Arrays von unreifen humanen dendritischen Zellen, die entweder mit Proteinallergenextrakt oder mit LPS in Berührung kamen, zeigten statistisch signifikant regulierte Gene, die allerdings keine Gemeinsamkeiten aufwiesen. Es konnten für die mit Alllergenextrakt gepulsten dendritischen Zellen insgesamt 10 Gene identifiziert werden, jedoch gelang es nicht, diese näher zu deuten oder in einen Zusammenhang mit der allergischen Erkrankung oder der dendritischen Zelle zu bringen. Für die mit LPS, dem stärkeren Stimulus, gepulsten dendritischen Zellen konnten 40 Gene identifiziert werden, die unter anderem für die Maturierung der dendritischen Zelle verantwortlich sind. Zudem war es möglich, die Daten der Arrays auf Proteinebene exemplarisch anhand des Chemokins CXCL2 (Gro-β) zu verifizieren.

Die Bedeutung von NFAT-Transkriptionsfaktoren für die Expression von Mastzell-Cytokinen

Zusammenfassung Die Rolle verschiedener Mitglieder der NFAT- Familie in der Entwicklung von T- Zellen und deren Funktion wird intensiv untersucht, wohingegen vergleichbare Untersuchungen in Mastzellen rar sind. Mastzellen exprimieren eine Vielzahl biologisch hochaktiver Mediatoren und sind auf diese Weise sowohl in angeborenen als auch adaptiven Immunantworten beteiligt. Die von Mastzellen produzierten Th2-Cytokine verstärken lokal Th2- Reaktionen und TNF-alpha ist ein wichtiger Initiator antimikrobieller Antworten. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Transkriptionsfaktoren NFATc1 und NFATc2 eine bedeutende Rolle in der Regulation der Expression von TNF-alpha und IL-13 einnehmen, wohingegen NFATc3 hierbei keine Funktion zukommt. Murine „Bone marrow derived mast cells“ (BMMC) aus NFATc2- defizienten Mäusen, aktiviert entweder durch Kreuzvernetzung des IgE- Rezeptors oder Ionomycin, zeigen eine drastisch reduzierte Expression dieser Cytokine verglichen mit Mastzellen aus Wildtyp- Mäusen. Genauere Untersuchungen zeigen, dass sowohl NFATc2 als auch NFATc1 an der Expression von IL-13 und TNF-alpha beteiligt sind, wohingegen sie auf die Degranulation und die Expression von IL-6 keinen Einfluss nehmen. Zusammenfassend scheint eine hohe Aktivität von NFAT- Faktoren für die Induktion des IL-13 und TNF-alpha Promoters in Mastzellen erforderlich zu sein, unabhängig davon, ob diese durch NFATc2 oder NFATc1 oder eine Kombination beider Transkriptionsfaktoren bewerkstelligt wird.

Conditional and transgenic mouse models as tools to study the role of TGFbeta, BMP signaling in skeletal development

Die TGFbeta/BMP Signaltransduktionskaskade ist wichtig für viele Entwicklungsprozesse fast aller embryonaler sowie extraembryonaler Gewebe und sie ist ebenso essentiell bei der Aufrechterhaltung der Homöostase im adulten Organismus. In vielen Mausmodellen und Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Liganden dieses Signalweges in verschiedene Stadien der Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. BMPs sind beispielsweise maßgeblich an der frühen Kondensation und Bildung des Knorpels und später an Proliferation und Hypertrophie der Chondrozyten beteiligt. BMPs können ektopisch Knochenbildung auslösen und das Expressionsmuster der Liganden und spezifischen Rezeptoren in der Wachstumsfuge lässt auf eine wichtige Rolle der BMPs in der Wachstumsfuge schließen. Der gezielte knock out der BMP-Rezeptoren Bmpr1a und Bmpr1b in proliferierenden Chondrozyten führt zur Ausbildung einer generellen Chondrodysplasie. Smad1, Smad5 und Smad8 sind die Mediatoren der BMP-Signalkaskade. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Funktion der Smad1- und Smad5-Proteine in der Wachstumsfuge untersucht werden. Hierzu wurden konditionale Smad1-knock out-Mäuse mit einer transgenen Mauslinie gekreuzt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in proliferierenden Chondrozyten exprimiert. Diese Mäuse wurden mit und ohne heterozygotem Smad5-Hintergrund charakterisiert. Bei einem knock out von Smad1 allein konnte ein leichte Verkürzung der Wachstumsfuge beobachtet werden, wobei prähypertrophe und hypertrophe Zone gleichermaßen betroffen waren. Dieser Phänotyp war verstärkt in Mäusen mit zusätzlichem heterozygotem Smad5-Hintergrund. Eine Verringerung der Proliferationsrate konnte zusammen mit einer verminderten Ihh-Expression nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte anhand von Röntgenaufnahmen eine Dysorganisation der nasalen Region und ein fehlendes nasales Septum beobachtet werden. Produktion und Mineralisation der extrazellulären Matrix waren nicht beeinträchtigt. Um die Rolle der BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden während der endochondralen Ossifikation zu vergleichen, wurden transgene Mäuse generiert, in denen die TGFbeta-Signalkaskade spezifisch in proliferierenden Chondrozyten gestört war. Zwei Mauslinien, die ähnliche Phänotypen zeigten, wurden untersucht. Esl1 ist ein TGFbeta-bindendes Protein, von dem man annimmt, dass es die TGFbeta-Signalkaskade inhibieren kann. Esl1-knock out-Mäuse sind kleiner als Wildtypmäuse und die Überexpression von Esl1 in proliferierenden Chondrozyten führt zu einer Verlängerung der Wachstumsfuge und einer verstärkten Proliferationsrate. Knorpelmarker, wie Col2a1 und Sox9 sind in diesen Mäusen herunterreguliert, während Col10a1 und Ihh als Marker für die hypertrophe und prähypertrophe Zone herunterreguliert waren. Dies führt zu der Annahme, dass mehr Zellen in die terminale Differenzierung eintreten. Bei transgenen Mäusen, in denen ein dominant-negativer (dn) TGFbeta-Rezeptor in proliferierenden Chondrozyten überexprimiert wurde, konnte eine verlängerte prähypertrophe Zone, eine erhöhte Ihh-Expression, sowie eine verstärkte Proliferationsrate beobachtet werden. Zusätzlich konnte in homozygoten Tieren ein craniofacialer Phänotyp beschrieben werden, der zu Problemen bei der Nahrungsaufnahme und damit zu einer starken Wachstumsbeeinträchtigung führte. Die BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden haben möglicherweise antagonistische Effekte in der Wachstumsfuge. Während der Ausfall von BMP in proliferierenden Chondrozyten aufgrund einer gesunkenen Proliferationsrate zu einer Verkürzung der Wachstumsfuge führte, kann man in Mäusen mit einer Störung der TGFbeta-Signalkaskade eine verstärkte Proliferation in einer daher verlängerten Wachstumsfuge beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Generation einer transgenen Mauslinie, die die Cre-Rekombinase spezifisch in hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Promoterstudien mit transgenen Mäusen weisen darauf hin, dass ein putatives AP1-Element, etwa 4 kb vor dem ersten Exon des Col10a1 gelegen, wichtig für die spezifische Expression in hypertrophen Chondrozyten ist. Ein Konstrukt, dass vier Kopien dieses Elements und den basalen Promoter enthält, wurde benutzt, um die Cre-Rekombinase spezifisch zu exprimieren. Diese Mauslinie befindet sich in der Testphase und erste Daten deuten auf eine spezifische Expression der Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrozyten hin.

Die Identifizierung und Charakterisierung von HLA-Klasse-I-restringierten Minorhistokompatibilitätsantigenen und Leukämie-assoziierten Antigenen mittels cDNA-Expressionsklonierung

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HSCT) bietet bei einem hohen Anteil akuter Leukämien die einzige kurative Behandlungsmöglichkeit. Um die mit ihr assoziierte Morbidität und Mortalität zu senken und ihre Effektivität zu steigern, soll die GvL (graft-versus-leukemia)-Reaktion als eigentliches Therapieziel gegenüber der unerwünschten GvHD (graft-versus-host disease) möglichst selektiv verstärkt werden. Wesentliche Mediatoren beider Effekte sind alloreaktive T-Zellen. Bei HLA-Übereinstimmung zwischen Spender und Empfänger sind so genannte Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) und Leukämie-assoziierte Antigene (LAA) die mutmaßlichen Zielstrukturen beider Reaktionen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in dem Leukämie-Modell der Patientin MZ201 [akute myeloische Leukämie (AML) vom Subtyp FAB M5] mittels T-Zell-basierter cDNA-Expressionsklonierung zwei neue Antigene identifiziert, die von allogenen, AML-reaktiven CD8+ T-Lymphozyten aus Blut eines HLA-passenden gesunden Spenders erkannt wurden. Es handelt sich zum einen um das HLA-B*5601-restringierte mHAg PLAUR-317P, das aus einem Polymorphismus des Gens PLAUR (plasminogen activator, urokinase receptor) resultiert. Das von den T-Zellen am Besten erkannte Peptid enthält die Aminosäuren 316 - 327. PLAUR wird in lymphohämatopoetischen Zellen und in verschiedenen Malignomen überexprimiert und ist dabei mit schlechterer Prognose und vermehrter Gewebeinvasivität assoziiert. Etwa 30% getesteter Individuen tragen das Allel PLAUR-317P. Zum anderen handelt es sich um ein Epitop aus der Signalregion des Chemokins CXCL3 [chemokine (C-X-C motif) ligand 3], das von CD8+ T-Zellen des gleichen Spenders auf Leukämiezellen der Patientin MZ201 in Assoziation mit HLA-A*0201 erkannt wurde. Auch CXCL3 wird vorwiegend in Zellen der Myelopoese exprimiert. Aufgrund ihres Expressionsmusters sind beide Antigene potentielle Zielstrukturen für die Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss der Leukämieblasten im Rahmen der allo-HSCT. Weiterführende Untersuchungen müssen zeigen, ob diese Antigene tatsächlich in vivo GvL-Reaktionen hervorrufen. Die Kenntnis eines repräsentativen Spektrums solcher Antigene würde verbesserte Spenderselektionen erlauben und neue Wege des adoptiven T-Zelltransfers erschließen helfen.

Die Rolle der Mastzelle bei der Entstehung einer allergischen Atemwegserkrankung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Mastzelle und deren Mediatoren für die Entstehung einer allergischen Atemwegsentzündung untersucht. Anhand von zwei mastzelldefizienten Mausstämmen (C57BL/6-KitWsh/Wsh und WBB6FI-KitW/Wv), konnte gezeigt werden, dass Mastzellen an der Entstehung einer allergischen Entzündung und Atemwegsüberempfindlichkeit beteiligt sind. Durch die Rekonstitution von mastzelldefizienten Tieren mit aus Knochenmark gewonnenen Mastzellen (BMMC) von Wildtyp-Spendern konnte die wichtige Funktion der Mastzelle in diesem Model bestätigt werden. Überdies konnte durch die Rekonstitution mit TNF-defizienten BMMC eine wichtige Rolle für diesen mastzellproduzierten Mediator im allergischen Modell demonstriert werden. Weiterhin konnte die Arbeit zeigen, dass Mastzellen wichtig für die Migration von antigenbeladenen Dendritischen Zellen aus der Lunge in die regionalen Lymphknoten sind. Dieses stellt einen wichtigen Schritt für die Ausbildung einer lokalen allergischen Antwort dar. Im Gegensatz dazu war die Entstehung einer allergischen Atemwegserkrankung nach Transfer von in vitro generierten DC und Allergenprovokation nicht mastzellabhängig. Diese Ergebnisse zeigen, dass es auf die Wahl des Sensibilisierungs- und Provokationsmodels ankommt, um mastzellspezifische Effekte zu demonstrieren. Die vorliegende Arbeit zeigt die wichtige Rolle der Mastzelle und von mastzellproduziertem TNF bei der Ausbildung einer allergischen Entzündung der Atemwege. Die Mastzelle und deren Mediatoren stellen somit mögliche Ziele für die therapeutische Behandlung der allergischen Entzündung der Atemwege dar.

Analyse des anti-inflammatorischen Pilzmetaboliten S-Curvularin in verschiedenen Modellen der rheumatoiden Arthritis

An der Entwicklung und Aufrechterhaltung chronisch-inflammatorischer Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (RA) ist die Fehlregulation verschiedener pro-inflammatorischer Gene von entscheidender Bedeutung. Bei der RA führt unter anderem eine erhöhte Expression der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) zu einer gesteigerten NO-Produktion, was schließlich zum Knochenabbau beiträgt. Für eine Therapie der RA werden häufig Glukokortikoide eingesetzt, die jedoch viele Nebenwirkungen zeigen. Um eine mögliche Therapiealternative zu identifizieren, sollten die Effekte des anti-inflammatorisch wirksamen Pilzmetaboliten S-Curvularin in verschiedenen Modellen der RA analysiert werden.rnIn humanen C-28/I2-Chondrozyten als in vitro-Modell der RA führte die Inkubation mit einem Zytokingemisch zu einer Induktion der iNOS-Expression, die vom chondrogenen Differenzierungsgrad der Zellen abhängig war. Entscheidend für die iNOS-Induktion in C-28/I2-Zellen ist hauptsächlich der p38-MAPK-, der JAK-STAT- und der NF-kappa B-Signaltransduktionsweg. Eine Inkubation der Zellen mit S-Curvularin führte zu einer deutlichen Hemmung der iNOS-Expression. Dexamethason hatte hingegen keinen Effekt auf die iNOS-Expression, was vermutlich auf die fehlende Expression der Glukokortikoidrezeptor-mRNA zurückgeführt werden kann. Daher können von S-Curvularin abgeleitete Pharmaka möglicherweise auch in Fällen einer Steroidresistenz zur Therapie von RA-Patienten zum Einsatz kommen.rnIm Tiermodell der Kollagen-induzierten Arthritis konnte die anti-inflammatorische Wirkung von S-Curvularin auf mehreren Ebenen bestätigt werden. Die Pilzsubstanz reduzierte sowohl die Schwellung der Pfoten als auch die Expression CII-induzierter pro-inflammatorischer Gene, wie z.B. S100A8, Defb6, Camp und Mpo. Dabei waren die Effekte von S-Curvularin meist deutlicher als in Dexamethason-behandelten Mäusen. Die Analyse von Zytokinen (z.B. TNF-alpha, IL-1beta) und Chemokinen (z.B. MCP-1, MIP-1alpha) zeigte, dass die CII-induzierte Expression dieser pro-inflammatorischen Mediatoren in den Pfoten der Mäuse durch eine Therapie mit S-Curvularin und Dexamethason wieder reduziert werden konnte, wobei Unterschiede zwischen den Behandlungen beobachtet werden konnte.rnAuch im Tiermodell der LPS-induzierten akuten Entzündung wurde die iNOS- und die S100A8-Expression in verschiedenen Geweben S-Curvularin reduziert. rnrnS-Curvularin ist also in der Lage, in verschiedenen Modellen der RA und im akuten Entzündungsmodell die pro-inflammatorische Genexpression effizient zu hemmen und könnte somit in Zukunft eine Rolle in der Therapie der RA einnehmen.rn

Spektroelektrochemische Untersuchungen mittels oberflächenverstärkter Infrarotabsorptionsspektroskopie (SEIRAS) an Multi-Redox-Center-Proteinen in einer biomimetischen Membranumgebung

Die optische Eigenschaften sowie der Oberflächenverstärkungseffekt von rauen Metalloberflächen sowie Nanopartikeln wurden intensiv für den infraroten Bereich des Spektrums in der Literatur diskutiert. Für die Präparation solcher Oberflächen gibt es prinzipiell zwei verschiedene Strategien, zum einen können die Nanopartikel zuerst ex-situ synthetisiert werden, der zweite Ansatz beruht darauf, dass die Nanopartikel in-situ hergestellt und aufgewachsen werden. Hierbei wurden beide Ansätze ausgetestet, dabei stellte sich heraus, dass man nur mittels der in-situ Synthese der Goldnanopartikel in der Lage ist nanostrukturierte Oberflächen zu erhalten, welche elektronisch leitfähig sind, nicht zu rau sind, um eine Membranbildung zu ermöglichen und gleichzeitig einen optimalen Oberflächenverstärkungseffekt zeigen. Obwohl keine ideale Form der Nanopartikel mittels der in-situ Synthese erhalten werden können, verhalten sich diese dennoch entsprechend der Theorie des Oberflächenverstärkungseffekts. Optimierungen der Form und Grösse der Nanopartikel führten in dieser Arbeit zu einer Optimierung des Verstärkungseffekts. Solche optimierten Oberflächen konnten einfach reproduziert werden und zeichnen sich durch eine hohe Stabilität aus. Der so erhaltene Oberflächenverstärkungseffekt beträgt absolut 128 verglichen mit dem belegten ATR-Kristall ohne Nanopartikel oder etwa 6 mal, verglichen mit der Oberfläche, die bis jetzt auch in unserer Gruppe verwendet wurde. Daher können nun Spektren erhalten werden, welche ein deutlich besseres Signal zu Rauschverhältnis (SNR) aufweisen, was die Auswertung und Bearbeitung der erhaltenen Spektren deutlich vereinfacht und verkürzt.rnNach der Optimierung der verwendeten Metalloberfläche und der verwendeten Messparameter am Beispiel von Cytochrom C wurde nun an der Oberflächenbelegung der deutlich größeren Cytochrom c Oxidase gearbeitet. Hierfür wurde der DTNTA-Linker ex-situ synthetisiert. Anschließend wurden gemischte Monolagen (self assembeld monolayers) aus DTNTA und DTP hergestellt. Die NTA-Funktionalität ist für die Anbindung der CcO mit der his-tag Technologie verantwortlich. Die Kriterien für eine optimale Linkerkonzentration waren die elektrischen Parameter der Schicht vor und nach Rekonstitution in eine Lipidmembran, sowie Elektronentransferraten bestimmt durch elektrochemische Messungen. Erst mit diesem optimierten System, welches zuverlässig und reproduzierbar funktioniert, konnten weitere Messungen an der CcO begonnen werden. Aus elektrochemischen Messungen war bekannt, dass die CcO durch direkten Elektronentransfer unter Sauerstoffsättigung in einen aktivierten Zustand überführt werden kann. Dieser aktivierte Zustand zeichnet sich durch eine Verschiebung der Redoxpotentiale um etwa 400mV gegenüber dem aus Gleichgewichts-Titrationen bekannten Redoxpotential aus. Durch SEIRAS konnte festgestellt werden, dass die Reduktion bzw. Oxidation aller Redoxzentren tatsächlich bei den in der Cyclovoltammetrie gemessenen Potentialen erfolgt. Außerdem ergaben die SEIRA-Spektren, dass durch direkten Elektronentransfer gravierende Konformationsänderungen innerhalb des Proteins stattfinden. rnBisher war man davon ausgegangen, aufgrund des Elektronentransfers mittels Mediatoren, dass nur minimale Konformationsänderungen beteiligt sind. Vor allem konnte erstmaligrnder aktivierte und nicht aktivierte Zustand der Cytochrom c Oxidase spektroskopisch nachweisen werden.rn

Identifizierung und Überexpression immunregulatorischer Moleküle in dendritischen Zellen zur gezielten Modulation ihrer T-Zell-stimulierenden Eigenschaften

Die Modifizierung von dendritischen Zellen (DCs) in vitro erfolgt meist durch eine Behandlung mit Mediatoren, die den Aktivierungszustand sowie die T-Zell-polarisierenden DC-Eigenschaften verändern. In dieser Doktorarbeit sollten zunächst mediatorinduzierte tolerogene Schlüsselmoleküle identifiziert werden. Als Modell wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen mit dem Glucocorticoid Dexamethason (DEX) behandelt. Die generierten DEX-APCs (antigenpräsentierende Zellen) zeigten einen protolerogenen, weitgehend maturierungsresistenten Phänotyp und eine gesteigerte Expression toleranzassoziierter Moleküle. DEX-APCs induzierten in vitro aus CD25+ depletierten allogenen T-Zellen de novo CD4+ und CD8+ regulatorische T-Zellen (Tregs). Basierend auf diesen Ergebnissen und Literaturstudien wurden protolerogene Moleküle für eine Überexpression in DCs selektiert. Da DCs non-viral kaum transfizierbar sind, wurde die lentivirale Transduktion von DCs optimiert, wodurch Effizienzen bis zu 95% erreicht werden konnten. Der mit der Transduktion assoziierte physikalische Stress resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung. Trotzdessen zeigten DCs, die die Zytokine IL-10 oder IL-21 überexprimierten, einen protolerogenen Phänotyp und induzierten in vitro Tregs. Beide DC-Populationen reduzierten im therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie haptenspezifisch die Ohrschwellungsreaktion. Auch DCs, die andere Zytokine, intrazelluläre Proteine oder Oberflächenrezeptoren mit protolerogenen Eigenschaften überexprimierten, wiesen eine jeweils spezifische Genexpressionssignatur auf. Diese DC-Populationen waren zumeist durch eine verminderte allogene T-Zell-Aktivierungskapazität gekennzeichnet und veränderten die Th1-/Th2-Zytokinmuster in kokultivierten T-Zellen.

Transkutane Immunisierung - Mechanismen und Optimierungsstrategien

In dieser Arbeit wurde ein etabliertes Immunisierungsmodell auf der Basis eines synthetischen TLR 7-Liganden zur Aufhebung der suppressiven Eigenschaften von UV B-Strahlung verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass nach Ermittlung eines geeigneten Immunisierungsprotokolls mit UV B die durch TCI vermittelte ausschließlich primäre Immunantwort verstärkt werden konnte, so dass eine Gedächtnisantwort induziert werden konnte. Durch die Immunisierung verschiedenster knockout sowie transgener Stämme konnte bewiesen werden, dass die Reaktion auch nach zusätzlicher UV B-Bestrahlung abhängig von TLR 7 und dem Adaptormolekül MyD88 ist. Bei der Aufklärung der zellulären Mechanismen, die dieser Immunisierungsmethode zu Grunde liegen, konnten dermale DCs, sowie GR1+-Zellen als wichtige Mediatoren identifiziert werden. Eine wesentliche Funktion von epidermalen Langerhans Zellen konnte in diesem Zusammenhang ausgeschlossen werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass auf Zytokinebene Typ I Interferone eine tragende Rolle spielen und die Produktion von IL-12p35 in den Haut-drainierenden Lymphknoten angeregt wird. Supprimiert wird die Immunantwort durch regulatorische T-Zellen, sowie durch die Freisetzung von IL-10, welches nicht ausschließlich von regulatorischen T-Zellen produziert wird. Die Applikation eines blockierenden IL-10-Rezeptor Antikörpers verhinderte die IL-10-vermittelte Suppression und führte zu einer weiteren Verstärkung der Immunantwort. Durch die induzierte Gedächtnisantwort nach UV B/TCI konnte das Immunisierungs-Modell in einem therapeutischen Tumormodell angewandt werden und führt hier zu einer verstärkten Abstoßung von Tumoren, verglichen mit TCI alleine, was die Basis für zukünftige nadelfreie Vakzinierungen für die Behandlung von Krebs oder persistierender Infektionen darstellen könnte.

Die Rolle von Interleukin-22 bei Asthma bronchiale

Interleukin (IL)-22 ist ein Effektorzytokin, das von Zellen des Immunsystems produziert wird und auf Epithelzellen wirkt. Es nimmt eine duale Rolle ein, indem es abhängig vom Gewebe und Zytokinmilieu entweder entzündungsfördernden oder entzündungshemmenden Einfluss ausübt. Über seine Wirkung bei Asthma bronchiale ist bislang noch wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten in einem murinen Modell der allergischen Atemwegsentzündung lymphoide Zellen des angeborenen Immunsystems als Hauptproduzenten für IL-22 detektiert werden, die bislang noch nicht im Zusammenhang mit Asthma bronchiale beschrieben wurden. Es konnte gezeigt werden, dass IL-22- defiziente Mäuse eine verstärkte Atemwegsentzündung entwickelten und sich die IL-22-Defizienz in diesem Modell entzündungsfördernd auf die induzierte Atemwegsentzündung auswirkte. Mit Hilfe einer murinen bronchialen Epithelzelllinie wurden die Mechanismen des IL-22 und die Expression Asthma-relevanter Mediatoren untersucht. Der beobachtete inhibierende IL-22-Effekt ließ sich mit Hilfe seines natürlichen Antagonisten IL-22BP neutralisieren. Diese entzündungshemmende Wirkung des IL-22 konnte ebenfalls in Wildtyp-Mäusen, denen rekombinantes IL-22 intratracheal verabreicht worden war, bestätigt werden.

Mastzellen als Verstärker wichtiger Effektorfunktionen neutrophiler Granulozyten

Mastzellen sind an der Entstehung und Regulation von Entzündungsreaktionen unterschiedlicher Genese beteiligt und leisten somit auch innerhalb der angeborenen Immunität einen wichtigen Beitrag zur Pathogenabwehr. Mastzellen sind jedoch auch in entzündliche Prozesse involviert, welche chronische Erkrankungen auslösen oder verstärken können. Zentral ist hierbei ihre Fähigkeit, durch Produktion inflammatorischer Mediatoren die lokalen Blutgefäße zu aktivieren und somit rasch neutrophile Granulozyten zum Entzündungsort zu rekrutieren. Über eine direkte Interaktion zwischen Mastzellen und Neutrophilen ist bisher jedoch wenig bekannt.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass aktivierte Mastzellen essentielle Effektorfunktionen neutrophiler Granulozyten verstärken. So erhöhen Mastzellen den Aktivierungsstatus von Neutrophilen, was anhand der Modulation der Aktivierungsmarker CD11b und CD62L auf der Zelloberfläche von Neutrophilen demonstriert wurde. Die Phagozytoseaktivität von Neutrophilen wird in Anwesenheit aktivierter Mastzellen enorm gesteigert. Dies wird hauptsächlich durch Mastzell-produziertes TNF und GM-CSF vermittelt, wie in Experimenten mit Mastzellen aus TNF- und GM-CSF-defizienten Mäusen gezeigt wurde. Darüber hinaus wird die Produktion reaktiver Sauerstoffradikale von Neutrophilen in Gegenwart aktivierter Mastzellen erhöht. Dieser Effekt wird hauptsächlich durch GM-CSF der Mastzellen induziert, während TNF nur einen geringen Einfluss hat. Weiterhin zeigten in vitro Experimente, dass die Anwesenheit aktivierter Mastzellen die Lebensdauer von Neutrophilen erhöht. Die verminderte Apoptose von Neutrophilen wird einzig durch GM-CSF bewirkt. rnZur Validierung der in vitro Studien wurden in vivo Untersuchungen zur Mastzell-abhängigen Phagozytoseaktivität von Neutrophilen durchgeführt. Mit Hilfe des Modells einer LPS-induzierten akuten Atemwegsentzündung in Mastzell-defizienten und Wildtyp-Tieren des kongenen Stammes konnte bestätigt werden, dass Mastzellen auch in vivo die Phagozytosefunktion von Neutrophilen verstärken. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen somit, dass Mastzellen in Entzündungsprozessen auch eine Rolle als lokaler Verstärker von Neutrophilenfunktionen einnehmen können. rn

Beeinflusst Stereotype Threat die Leseleistung von Jungen?

Ein durchgängiger Befund internationaler Schulleistungsvergleichsstudien bezieht sich auf die niedrigere Lesekompetenz von Jungen im Vergleich zu Mädchen (OECD, 2010). Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu prüfen, welchen Einfluss negative Stereotype – im Sinne der Stereotype Threat-Theorie (Steele & Aronson, 1995) – auf die Leseleistung von Jungen haben. Basierend auf Befunden aus der Lese- und Stereotype Threat-Forschung wurde ein Mediator-Moderator-Modell des Stereotype Threat-Effekts (vgl. Schmader, Johns & Forbes, 2008) auf die Leseleistung von Jungen abgeleitet und überprüft. Um diese Fragestellungen zu beantworten, wurden zwei quasiexperimentelle Untersuchungen mit Schülern achter und neunter Klassen durchgeführt. An der ersten Untersuchung nahmen insgesamt 167 Schüler (n = 69 Jungen, n = 98 Mädchen) zweier Gymnasien in privater Trägerschaft teil. Um die Fragestellungen an einer weniger selektiven Stichprobe untersuchen zu können, erfolgte eine zweite Untersuchung mit Schülern (N = 441) öffentlicher Schulen und verschiedener Schulformen, wobei der Fokus ausschließlich auf den männlichen Schülern (n = 188 Jungen; n = 122 Gymnasiasten, n = 66 Realschüler plus) lag. Für beide Experimente kann zusammenfassend festgehalten werden, dass sich, entgegen der Erwartungen, kein leistungsmindernder Stereotype Threat-Effekt auf die Leseleistung von Jungen zeigte. Ferner konnten keine signifikante Mediatoren und Moderatoren eines leistungsmindernden Stereotype Threat-Effekts auf die Leseleistung von Jungen identifiziert werden. Ziel zukünftiger Forschung muss sein, den Einfluss negativer Stereotype auf die Leistungen männlicher Probanden im Sinne von Mitgliedern dominanter Gruppen zu untersuchen. Besonderes Augenmerk sollte auf die stereotypisierte Fähigkeitsdomäne gelegt werden. Weiterhin ist wichtig, der Frage nach zugrunde liegenden Prozessen und Voraussetzungen für das Erleben von Stereotype Threat nachzugehen. Studien weisen darauf hin, dass unterschiedlich stigmatisierte Gruppen unterschiedlich auf Stereotype Threat reagieren. Daher sollte der Fokus zukünftiger Forschung darauf liegen, die Prozesse und Voraussetzungen näher zu untersuchen, die für Mitglieder sonst positiv stereotypisierter Gruppen in solchen Situationen zum Tragen kommen.

A daily perspective on work interruptions

Diese Dissertation basiert auf einem theoretischen Artikel und zwei empirischen Studien.rnrnDer theoretische Artikel: Es wird ein theoretisches Rahmenmodell postuliert, welches die Kumulierung von Arbeitsunterbrechung und deren Effekte untersucht. Die meisten bisherigen Studien haben Unterbrechungen als isoliertes Phänomen betrachtet und dabei unberücksichtigt gelassen, dass während eines typischen Arbeitstages mehrere Unterbrechungen gleichzeitig (oder aufeinanderfolgend) auftreten. In der vorliegenden Dissertation wird diese Lücke gefüllt, indem der Prozess der kumulierenden Unterbrechungen untersucht wird. Es wird beschrieben,rninwieweit die Kumulation von Unterbrechungen zu einer neuen Qualität vonrn(negativen) Effekten führt. Das Zusammenspiel und die gegenseitige Verstärkung einzelner Effekte werden dargestellt und moderierende und mediierende Faktoren aufgezeigt. Auf diese Weise ist es möglich, eine Verbindung zwischen kurzfristigen Effekten einzelner Unterbrechungen und Gesundheitsbeeinträchtigungen durch die Arbeitsbedingung ‚Unterbrechungen‘rnherzustellen.rnrnStudie 1: In dieser Studie wurde untersucht, inwieweit Unterbrechungen Leistung und Wohlbefinden einer Person innerhalb eines Arbeitstages beeinflussen. Es wurde postuliert, dass das Auftreten von Unterbrechungen die Zufriedenheit mit der eigenen Leistung vermindert und das Vergessen von Intentionen und das Irritationserleben verstärkt. Geistige Anforderung und Zeitdruck galten hierbei als Mediatoren. Um dies zu testen, wurden 133 Pflegekräften über 5 Tage hinweg mittels Smartphones befragt. Mehrebenenanalysen konnten die Haupteffekte bestätigen. Die vermuteten Mediationseffekte wurden für Irritation und (teilweise) für Zufriedenheit mit der Leistung bestätigt, nicht jedoch für Vergessen von Intentionen. Unterbrechungen führen demzufolge (u.a.) zu negativen Effekten, da sie kognitiv anspruchsvoll sind und Zeit beanspruchen.rnrnStudie 2: In dieser Studie wurden Zusammenhänge zwischen kognitiven Stressorenrn(Arbeitsunterbrechungen und Multitasking) und Beanspruchungsfolgen (Stimmung und Irritation) innerhalb eines Arbeitstages gemessen. Es wurde angenommen, dass diese Zusammenhänge durch chronologisches Alter und Indikatoren funktionalen Alters (Arbeitsgedächtniskapazität und Aufmerksamkeit) moderiert wird. Ältere mit schlechteren Aufmerksamkeitsund Arbeitsgedächtnisleistungen sollten am stärksten durch die untersuchten Stressoren beeinträchtigt werden. Es wurde eine Tagebuchstudie (siehe Studie 1) und computergestützternkognitive Leistungstests durchgeführt. Mehrebenenanalysen konnten die Haupteffekte für die abhängigen Variablen Stimmung (Valenz und Wachheit) und Irritation bestätigen, nicht jedoch für Erregung (Stimmung). Dreifachinteraktionen wurden nicht in der postulierten Richtung gefunden. Jüngere, nicht Ältere profitierten von einem hohen basalen kognitivenrnLeistungsvermögen. Ältere scheinen Copingstrategien zu besitzen, die mögliche kognitive Verluste ausgleichen. rnrnIm Allgemeinen konnten die (getesteten) Annahmen des theoretischen Rahmenmodellsrnbestätigt werden. Prinzipiell scheint es möglich, Ergebnisse der Laborforschung auf die Feldforschung zu übertragen, jedoch ist es notwendig die Besonderheiten des Feldes zu berücksichtigen. Die postulieren Mediationseffekte (Studie 1) wurden (teilweise) bestätigt. Die Ergebnisse weisen jedoch darauf hin, dass der volle Arbeitstag untersucht werden muss und dass sehr spezifische abhängige Variablen auch spezifischere Mediatoren benötigen. Des Weiteren konnte in Studie 2 bestätigt werden, dass die kognitive Kapazität eine bedeutsamernRessource im Umgang mit Unterbrechungen ist, im Arbeitskontext jedoch auch andere Ressourcen wirken.