Funktionelle Charakterisierung der Casein Kinase 2 in der Etablierung und Aufrechterhaltung peripherer Toleranz durch dendritische Zellen

Dendritische Zellen (DCs) nehmen eine Schlüsselrolle in unserem Immunsystem ein, indem DCs sowohl Immunität, als auch Toleranz induzieren können. Im Falle der Immunität sind DCs in der Lage die Differenzierung der verschiedenen T-Helferzellen, wie Th1-, Th2- und Th17-Zellen zu steuern und tragen so zu der Qualität einer Immunantwort bei. Auf der anderen Seite können DCs in Gegenwart von TGF-β, IDO und Retinsäure die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen induzieren und tragen somit zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz bei. Insbesondere in den Darm-assoziierten lymphatischen Geweben (GALT) müssen DCs unverhältnismäßige Immunantworten gegen harmlose Antigene aus der Nahrung und kommensale Bakterien verhindern, während gegen Pathogene schützende Immunantworten induziert werden müssen. Auf Grund dieser entgegengesetzten Funktionen der DCs wollten wir die molekularen Mechanismen der DCs untersuchen, die der Regulation von Immunität und Toleranz zu Grunde liegen. Insbesondere der Wnt-Signalweg ist für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz im GALT von Bedeutung. Da die Casein Kinase 2 in diesem Signalweg entscheidend beteiligt ist, haben wir die CK2-Funktion konditionell, unter der Kontrolle des CD11c-Promotors, deletiert. Hierfür haben wir CD11c-cre Mäuse mit Mäusen verpaart, welche ein von loxP-Signalsequenzen flankiertes Ck2β Gen (CK2β-fl/fl) tragen. Die konditionelle Deletion der CK2-Funktion in DCs, führte zu einer verstärkten Expression der kostimulatorischen Moleküle (wie CD40, CD80, CD86) und der Zytokine IL-6 und IL-12 unter „steady-state“ Bedingungen. Detaillierte Untersuchungen der T-Zellen in CD11c-cre x CK2β-fl/fl Mäusen zeigte eine deutlich reduzierte naive T-Zellpopulation, einhergehend mit einer erhöhten Th1- und Th17-Differenzierung. Speziell in den mesenterialen Lymphknoten konnte eine höhere Frequenz von T-bet+ und Rorγt+ CD4+ T-Zellen gefunden werden, welche große Mengen der Zytokine IFN-γ und IL-17 nach ex vivo Stimulation produzierten. Weiterführende in vivo Versuche, hier wurde das Modell der oralen Toleranz gewählt, zeigten das eine CK2-Deletion in DCs die Induktion einer oralen Toleranz verhindert. Unsere Daten zeigen eindeutig, dass die CK2 entscheidend in der Regulation der DC Homöostase und der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz beteiligt ist.

Funktionale Bedeutung der Protein Kinase C - delta (PKC - delta) in der Reorganisation der zytoskelettären Architektur humaner Keratinozyten

Die Kontaktihibition, d.h. die Zell-Zell-Kontakt-vermittelte Proliferationskontrolle, stellt einen fundamentalen Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Homöostase in vitro und in vivo dar. So stellen in der Zellkultur nicht-transformierte Zellen in der Regel ihr Wachstum ein, sobald sie einen einschichtigen Zellrasen gebildet haben. Umgekehrt zeichnen sich transformierte Zellen durch einen Verlust der Kontaktinhibition aus. Sie wachsen nach Erreichen eines konfluenten Zellrasens mehrschichtig weiter, und es kommt zur Ausbildung charakteristischer Foci. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Proteinkinase C - delta eine wichtige Funktion in der Regulation der Zytoarchitektur humaner Keratinozyten besitzt und zugleich über Modulation der Zell-Zelladhäsion, insbesondere über Cadherin und Catenin, Einfluss nimmt.

The central role of Fyn kinase in axon-glial signalling and translation of myelin proteins

During central nervous system myelination, oligodendrocytes extend membrane processes towards an axonal contact site which is followed by ensheathment resulting in a compacted multilamellar myelin sheath. The formation of this axon-glial unit facilitates rapid saltatory propagation of action potentials along the axon and requires the synthesis and transport of copious amounts of lipids and proteins to the axon-glial contact site. Fyn is a member of the Src family of non receptor tyrosine kinases and inserted into the inner leaflet of the oligodendrocyte membrane by acylation. Fyn activity plays a pivotal role in the maturation of oligodendrocytes and the myelination process. It was suggested previously that Fyn kinase can be stimulated by binding of a neuronal ligand to oligodendroglial F3/ contactin, a glycosyl-phosphatidyl-inositol anchored immunoglobulin superfamily (IgSF) member protein. It could be shown here, that neuronal cell adhesion molecule L1 binds to oligodendrocytes in an F3-dependent manner and activates glial Fyn. In the search for downstream participants of this novel axon-glial signalling cascade, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2 was identified as a novel Fyn target in oligodendrocytes. HnRNP A2 was known to be involved in the localisation of translationally repressed myelin basic protein (MBP) mRNA by binding to a cis acting A2 response element (A2RE) present in the 3’ untranslated region. Transport of MBP mRNAs occurs in RNA-protein complexes termed RNA granules and translational repression during transport is achieved by hnRNP A2-mediated recruitment of hnRNP E1 to the granules. It could be shown here, that Fyn activity leads to enhanced translation of reporter mRNA containing a part of the 3’ UTR of MBP including the A2RE. Furthermore hnRNP E1 seems to dissociate from RNA granules in response to Fyn activity and L1 binding. These findings suggest a novel form of neuron- glial communication: Axonal L1 binding to oligodendroglial F3 activates Fyn kinase. Activated Fyn phosphorylates hnRNP A2 leading to removal of hnRNP E1 from RNA granules initiating the translation of MBP mRNA. MBP is the second most abundant myelin protein and mice lacking this protein show a severe hypomyelination phenotype. Moreover, the brains of Fyn knock out mice contain reduced MBP levels and are hypomyelinated. Hence, L1-mediated MBP synthesis via Fyn as a central molecule could be part of a regulatory mechanism required for myelinogenesis in the central nervous system.

Der Einfluss der regulierten Expression der onkogenen Kinase PKB,Akt auf die T-Zell-vermittelte Tumorabstoßung

Eine wesentliche Voraussetzung für die maligne Transformation von Zellen ist die Inaktivierung des programmierten Zelltodes (Apoptose). Die dabei erworbenen Defekte der Apoptose-Signalwege führen häufig zu Resistenzen gegenüber Radio- und Chemotherapien. Immuntherapeutische Ansätze haben zum Ziel, solche resistenten Tumorzellen spezifisch zu entfernen. Resistenzen gegenüber Immuntherapien können wiederum in einer gestörten Immunerkennung der Tumorzellen oder deren Resistenz gegenüber Immuneffektormechanismen begründet sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu überprüfen, ob durch Proteinkinase B (PKB)/Akt Immunresistenz vermittelt werden kann. Hierbei zeigte sich, dass die Aktivierung des PKB/Akt-Signalweges in Tumorzellen einen deutlichen Schutz gegenüber verschiedenen Apoptosestimuli in vitro vermittelt. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt hemmte sowohl die pharmakologisch, als auch die durch ZTL induzierte Apoptose-Signalkaskade über eine posttranskriptionelle Stabilisierung des anti-apoptotischen Proteins MCL-1. Diese Beobachtung konnte auch in einem murinen Tumorimmuntherapiemodell in vivo bestätigt werden. Unstimulierte Splenozyten von C57Bl/6-Mäusen wurden adoptiv in NOD/SCID-Mäuse mit etablierten, PKB/Akt-exprimierenden, murinen Fibrosarkomen transferiert. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt inhibierte den tumorsuppressiven Effekt dieser transplantierten Splenozyten signifikant. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die PKB/Akt-abhängige Immunresistenz auch in vivo durch anti-apoptotisches MCL-1 vermittelt wird. PKB/Akt-exprimierende Fibrosarkome mit supprimierter endogener MCL-1-Expression verloren ihre Resistenz gegenüber der durch adoptiven Splenozytentransfer vermittelten Tumorsuppression. Dies bestätigte endogenes MCL-1 als entscheidenden Faktor der PKB/Akt-vermittelten Immunresistenz. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung der PKB/Akt-induzierten Signaltransduktion auf der Ebene der nachgeschalteten Kinase mTOR etablierte Fibrosarkome gegenüber adoptiver Lymphozytentherapie sensitiviert. Der mTOR-Inhibitor Rapamycin verhinderte die PKB/Akt-induzierte Aufregulation von MCL-1 und die damit einhergehende Resistenzentwicklung in vivo. Zusammengefasst wurde erstmalig gezeigt, dass eine Deregulation des PKB/Akt-Signalweges Resistenz gegenüber immunologischer Tumorsuppression vermitteln kann. PKB/Akt stellt somit ein entscheidendes Zielmolekül für die Verbesserung von Krebsimmuntherapien dar.

Expression und Funktion der Lyn Kinase in Oligodendrozyten

Die Bildung, Aufrechterhaltung und die Funktionalität von Oligodendrozyten, den myelinisierenden Zellen des ZNS, bedarf einer präzisen Regulation von Ereignissen wie Migration, Proliferation und Differenzierung. Die Src-Kinasen spielen in vielen Signalkaskaden eine zentrale Rolle. In murinen Oligodendrozyten werden die beiden Src-Kinasen Fyn und Lyn exprimiert, diese Arbeit konzentriert sich auf die Analyse der Lyn Kinase. Es konnte die Expression von Lyn in Oligodendrozyten und Myelin in vitro und in vivo bestätigen werden, sowie die Lokalisation innerhalb und außerhalb von rafts. Je älter die Mäuse, desto weniger Lyn wird in Myelin exprimiert und desto stärker ist das verbleibende Lyn in den rafts lokalisiert. Die Aktivität von Lyn ist im Myelin 12-Tage alter Mäuse am höchsten. Synchronisation des Zellzyklus in Oli-neu Zellen zeigte eine zyklische Expression von Lyn. Transfektion aktiver und inaktiver Konstrukte machte deutlich, dass eine Lyn Aktivität die Zellausläufer Bildung, sowie die Differenzierung der Zelle, hemmt. Es konnte eine Assoziation der GluRB/C Untereinheit des AMPA Rezeptors mit Lyn nachgewiesen werden. Stimulierung des AMPA-Rezeptors mit Glutamat führte zu einer Aktivierung der Lyn Kinase und daraus resultierend, zu einer Inhibierung der Zelldifferenzierung. Welche biologische Relevanz diese Ergebnisse haben könnten, wurde in drei Hypothesen festgehalten. Zum einen könnte die Lyn Kinase den zeitlichen Übergang von Proliferation und Differenzierung in Oligodendrozyten regulieren und zwar sowohl in perinatalen oligodendroglialen Vorläuferzellen, als auch, unter besonderen Umständen, in adulten oligodendroglialen Vorläuferzellen. Des Weiteren könnte die Lyn Kinase auch eine Rolle in der Neuron-Glia-Synapsenbildung spielen. Weitere Versuche, insbesondere in vivo, müssen folgen, um diese Hypothesen zu bestätigen oder zu widerlegen.

Oligomerization and protein-protein interactions of the sensory histidine kinase DcuS in Escherichia coli

DcuS is a membrane-integral sensory histidine kinase involved in the DcuSR two-component regulatory system in Escherichia coli by regulating the gene expression of C4-dicarboxylate metabolism in response to external stimuli. How DcuS mediates the signal transduction across the membrane remains little understood. This study focused on the oligomerization and protein-protein interactions of DcuS by using quantitative Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) spectroscopy. A quantitative FRET analysis for fluorescence spectroscopy has been developed in this study, consisting of three steps: (1) flexible background subtraction to yield background-free spectra, (2) a FRET quantification method to determine FRET efficiency (E) and donor fraction (fD = [donor] / ([donor]+[acceptor])) from the spectra, and (3) a model to determine the degree of oligomerization (interaction stoichiometry) in the protein complexes based on E vs. fD. The accuracy and applicability of this analysis was validated by theoretical simulations and experimental systems. These three steps were integrated into a computer procedure as an automatic quantitative FRET analysis which is easy, fast, and allows high-throughout to quantify FRET accurately and robustly, even in living cells. This method was subsequently applied to investigate oligomerization and protein-protein interactions, in particular in living cells. Cyan (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP), two spectral variants of green fluorescent protein, were used as a donor-acceptor pair for in vivo measurements. Based on CFP- and YFP-fusions of non-interacting membrane proteins in the cell membrane, a minor FRET signal (E = 0.06 ± 0.01) can be regarded as an estimate of direct interaction between CFP and YFP moieties of fusion proteins co-localized in the cell membrane (false-positive). To confirm if the FRET occurrence is specific to the interaction of the investigated proteins, their FRET efficiency should be clearly above E = 0.06. The oligomeric state of DcuS was examined both in vivo (CFP/YFP) and in vitro (two different donor-acceptor pairs of organic dyes) by three independent experimental systems. The consistent occurrence of FRET in vitro and in vivo provides the evidence for the homo-dimerization of DcuS as full-length protein for the first time. Moreover, novel interactions (hetero-complexes) between DcuS and its functionally related proteins, citrate-specific sensor kinase CitA and aerobic dicarboxylate transporter DctA respectively, have been identified for the first time by intermolecular FRET in vivo. This analysis can be widely applied as a robust method to determine the interaction stoichiometry of protein complexes for other proteins of interest labeled with adequate fluorophores in vitro or in vivo.

Fyn kinase targets in oligodendroglial physiology and myelination

In the central nervous system (CNS), oligodendrocytes form the multilamellar and compacted myelin sheath by spirally wrapping around defined axons with their specialised plasma membrane. Myelin is crucial for the rapid saltatory conduction of nerve impulses and for the preservation of axonal integrity. The absence of the major myelin component Myelin Basic Protein (MBP) results in an almost complete failure to form compact myelin in the CNS. The mRNA of MBP is sorted to cytoplasmic RNA granules and transported to the distal processes of oligodendrocytes in a translationally silent state. A main mediator of MBP mRNA localisation is the trans-acting factor heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2 which binds to the cis-acting A2 response element (A2RE) in the 3’UTR of MBP mRNA. A signalling cascade had been identified that triggers local translation of MBP at the axon-glial contact site, involving the neuronal cell adhesion molecule (CAM) L1, the oligodendroglial plasma membrane-tethered Fyn kinase and Fyn-dependent phosphorylation of hnRNP A2. This model was confirmed here, showing that L1 stimulates Fyn-dependent phosphorylation of hnRNP A2 and a remodelling of A2-dependent RNA granule structures. Furthermore, the RNA helicase DDX5 was confirmed here acting together with hnRNP A2 in cytoplasmic RNA granules and is possibly involved in MBP mRNA granule dynamics.rnLack of non-receptor tyrosine kinase Fyn activity leads to reduced levels of MBP and hypomyelination in the forebrain. The multiadaptor protein p130Cas and the RNA-binding protein hnRNP F were verified here as additional targets of Fyn in oligodendrocytes. The findings point at roles of p130Cas in the regulation of Fyn-dependent process outgrowth and signalling cascades ensuring cell survival. HnRNP F was identified here as a novel constituent of oligodendroglial cytoplasmic RNA granules containing hnRNP A2 and MBP mRNA. Moreover, it was found that hnRNP F plays a role in the post-transcriptional regulation of MBP mRNA and that defined levels of hnRNP F are required to facilitate efficient synthesis of MBP. HnRNP F appears to be directly phosphorylated by Fyn kinase what presumably contributes to the initiation of translation of MBP mRNA at the plasma membrane.rnFyn kinase signalling thus affects many aspects of oligodendroglial physiology contributing to myelination. Post-transcriptional control of the synthesis of the essential myelin protein MBP by Fyn targets is particularly important. Deregulation of these Fyn-dependent pathways could thus negatively influence disorders involving the white matter of the nervous system.rnrn

Einfluss der Phosphorylierung durch die Casein Kinase II auf den HSP90-Chaperone-Zyklus in humanen Zellen

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Analysenmethode auf Basis der Massenbestimmung über Elektrospray-Ionisation qualifiziert, mit der es möglich ist, den Gehalt beider in humanen Zellen vorliegenden isoformen Chaperone HSP90-alpha und HSP90-beta sowie deren Phosphorylierungsstatus in der sog. „charged linker“-Region (CLR) getrennt voneinander zu bestimmen. Die Quantifizierung dieser posttranslationalen Modifikation von HSP90 in der noch wenig untersuchten Region des Chaperons stellte eine besondere Herausforderung an das analytische Messsystem dar, da diese sich fast ausschließlich aus geladenen Aminosäuren zusammensetzt und eine hohe Sequenzhomologie der beiden Isoformen in humanen Zellen vorliegt. Mit dieser Methode ist es gelungen, sowohl die stärkere Expression beider Isoformen in Tumor-Zelllinien im Vergleich zu Nicht-Tumor-Zelllinien als auch signifikant höhere Level beider phosphorylierten Varianten in den Tumor-Zelllinien nachzuweisen. Des Weiteren konnte durch gezielte Arretierung der Tumor-Zelllinie HCT116 in der G0/G1-Phase des Zellzyklus der Nachweis erbracht werden, dass nur HSP90-alpha in diesem Ruhestadium der Zellteilung in der phosphorylierten Form vorliegt. rnDa die Phosphorylierung der CLR von HSP90 als ein Marker für die Substrataktivierung herangezogen werden kann, besteht jetzt die Möglichkeit, Auswirkungen von z. B. HSP90-Inhibitoren auf beide HSP90-Isoformen hinsichtlich ihrer Expression und Phosphorylierung durch die Casein Kinase II (CK II) im zellulären Umfeld zu testen.rnIn-vitro konnte die Phosphorylierung der CLR von HSP90-alpha und -beta mit der CK II an den rekombinant hergestellten Proteinen nachgestellt werden. Dieses typische Phosphorylierungs-Motiv (S-X-X-E/D) findet man bei sehr vielen Co-Chaperonen wie auch bei der Prostaglandin E Synthase p23, das ebenfalls durch eine in-vitro Kinase-Reaktion mit der CK II an drei Positionen phosphoryliert wurde. Durch ein Binde-Assay zeigte sich, dass p23 nur in dieser modifizierten Form an HSP90-alpha bindet. Das Bindeverhalten von p23 an die beta-Isoform wird durch diese Phosphorylierung jedoch nicht beeinflusst. Diese Erkenntnisse erweitern das Verständnis des bis dato beschriebenen Chaperon-Zyklus von HSP90 und zeigen deutliche Unterschiede in den Aktivierungszyklen beider Isoformen auf. Da die Casein Kinase II hier entscheidend in den durch HSP90 vermittelten Aktivierungsprozess eingreift, eröffnet sich ein weites Feld an Möglichkeiten, diese Prozesse an weiteren Co-Chaperonen und Substratproteinen zu studieren.rn

Biochemische Charakterisierung der Zyklin-abhängigen Kinase 2,Aktivator-Komplexe des Parasiten Eimeria tenella sowie deren Nutzung in der Wirkstoffforschung

Der Stamm der Apicomplexa ist eine artenreiche Gruppe, der einzellige, meist obligat intrazelluläre Parasiten angehören, darunter auch erstzunehmende Krankheitserreger wie Plasmodium sp. sowie tierpathogene Vertreter wie Eimeria sp. und Theileria sp. Eimeria sp. verursacht die Kokzidiose beim Huhn. Diese Krankheit bedingt weltweite Verluste in der Geflügelindustrie von etwa 3 Milliarden US$ pro Jahr [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. Die Parasiten weisen eine hohe Resistenzbildungsrate gegen vorhandene Wirkstoffe auf. Zudem ist der Einsatz von Vakzinen mit Nebenwirkungen verbunden und für hohe Produktionskosten verantwortlich. Daher ist die Entwicklung von neuen, kostengünstigen und effektiven Kokzidiostatika eine dringend notwendige Herausforderung [KINNAIRD et al., 2004]. rnAuf Grund ihrer essentiellen, regulatorischen Funktion im eukaryotischen Zellzyklus sind Zyklin-abhängige Kinasen (CDKs) validierte Zielproteine [LEHNINGER et al., 2005]. Auch Eimeria tenella CDC2-related kinase 2 (EtCRK2) wurde bereits mittels des bekannten CDK-Inhibitors Flavopiridol als Zielprotein chemisch validiert [ENGELS et al., 2010]. Wie bei allen CDKs ist die Aktivität von EtCRK2 abhängig von der Bindung eines Aktivators, der zur Zyklin-Proteinfamilie gehört. Dieser natürliche EtCRK2-Aktivator war jedoch bislang nicht bekannt. Deshalb war ein Teil dieser Arbeit die Identifizierung des natürlichen EtCRK2-Aktivators. Bioinformatische Analysen identifizierten vier E. tenella Zyklin-ähnliche Proteine (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), die nah verwandt zu den Plasmodium falciparum-Zyklinen sind [ENGELS et al., 2010; SUÁREZ FERNÁNDEZ et al., bislang unveröffentlichte Daten]. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neue Aktivatoren identifiziert und biochemisch charakterisiert werden: der bekannte CDK-Aktivator XlRINGO und das neue E. tenella-Zyklin EtCYC3a. Nachdem der nicht-radioaktive TR-FRET-Assay für die EtCRK2 etabliert und optimiert wurde, konnte die EtCRK2-Aktivität im Komplex mit beiden Aktivatoren und weitere wichtige kinetische Parameter bestimmt werden.rnZusätzlich wurde dieser Assay zum in vitro Screening einer kommerziellen Chemikalienbibliothek auf die EtCRK2 eingesetzt, um potentielle Inhibitoren für EtCRK2 zu identifizieren. Dieses in vitro Screening gefolgt von einer in silico Hit-Anreicherung identifizierte 19 aktive Verbindungen für die durch EtCYC3a und XlRINGO aktivierte EtCRK2. Zudem wurden drei Struktur-Cluster definiert: Naphthoquinone, 8-Hydroxyquinoline und 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ole. rnDie aktivsten Vertreter von jedem Cluster wurden als Leitstrukturen ausgewählt und auf EtCRK2 und HsCDK2 getestet. Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf EtCRK2 stellen diese Verbindungen viel versprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines neuen Antikokzidiums dar. Hiermit konnte auch gezeigt werden, dass BES124764, der Vertreter des 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ol-Clusters, in der Lage ist, die EtCRK2 selektiv zu inhibieren. rnDaher wird BES124764 sowie einige Derivate in den Leitstruktur-Optimierungsprozess für die Auffindung eines neuen Arzneimittelkandidaten gegen Kokzidiose eingehen.rn

Pathogenetische Bedeutung der Glutathionperoxidase-1 in der arteriellen Gefäßwand

Die antioxidative Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) schützt vor Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen. In einer Vorstudie konnten wir zeigen, dass der Mangel an GPx-1 die Atheroskleroseentwicklung in Apolipoprotein E defizienten (ApoE-/-) Mäusen beschleunigt und modifiziert. Allerdings sind die Verteilung der GPx-1 in atherosklerotischen Läsionen und die Mechanismen für den erhöhten Makrophagengehalt in der Läsion noch nicht geklärt. Deshalb haben wir (1) die in-situ Expression der GPx-Isoformen in atherosklerotischen Läsionen von GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Mäusen und (2) den Einfluss der GPx-1 Defizienz auf die Schaumzellbildung und Proliferation der Peritonealmakrophagen in ApoE-/- Mäusen untersucht. Die GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Weibchen wurden für 6 und 12 Wochen auf einer atherogenen „Western-type“ Diät gehalten. Die in situ-Hybridisierung zeigte, dass die verschiedenen Isoformen der GPx (GPx-1, GPx-3, GPx-4) vorwiegend in Makrophagen, nicht jedoch in glatten Muskelzellen der atherosklerotischen Läsionen von ApoE-/- Mäusen exprimiert wurden. Für die in vitro Untersuchungen wurden 5 Monate alte, GPx-1 defiziente und Wildtyp-Mäuse, gehalten auf Normaldiät, verwendet. Die Öl-Rot-O Färbung zeigte, dass die GPx-1 Defizienz die OxLDL (oxidiertes LDL) - und E-LDL (enzymatisch modifiziertes LDL) - induzierte Schaumzellbildung förderte. Darüber hinaus war die OxLDL-induzierte Cholesterinakkumulation (zellulärer Cholesterinester/ Cholesterin-Gehalt) in GPx-1 defizienten Makrophagen verstärkt, sodass ein Mangel an GPx-1 die Aufnahme von OxLDL durch Monozyten und damit die Umwandlung in Schaumzellen beschleunigt. Hinsichtlich der Proliferation zeigte sich, dass MCSF (Macrophage Colony-Stimulating Facotr) ein stärkerer Stimulus als OxLDL ist. Ein Mangel an GPx-1 fördert die Proliferation zusätzlich. Daran ist die ERK1/2 (extracellular-signal regulated kinase 1/2) - Kaskade beteiligt, denn es wurde eine schnelle Phosphorylierung der ERK1/2-Kaskade durch MCSF und/oder OxLDL nachgewiesen. Entsprechend reduzieren ERK1/2-Inhibitoren die proliferative Aktivität der Makrophagen. Die Hemmung der p38-MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase) führt zur vermehrten Proliferation und bei gleichzeitig verringerter Caspase-3/7 Aktivität der Makrophagen unabhängig von der Expression der GPx-1. Ein Mangel an GPx-1 hat auch keinen Einfluss auf die MCSF-vermittelte Aktivierung der p38-MAPK und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass die GPx-1-Defizienz einen signifikanten Einfluss auf die Schaumzellbildung und Proliferation von Makrophagen hat, was zur Beschleunigung der Atherosklerose und zu vermehrter Zellularität der entstehenden atherosklerotischen Läsionen führt. Die Proliferation wird über den ERK1/2 Signal-transduktionsweg positiv und über den p38-MAPK Weg negativ reguliert, wobei die ERK1/2-Kaskade empfindlich gegenüber oxidativem Stress bei GPx-1-Defizienz ist.

Induktion von Pro-Autophagie-Signalen durch einen extra- oder intrazellulären Alpha-Toxin-Angriff

Autophagie ist ein konservierter, kataboler Mechanismus in allen eukaryoten Zellen. Unter anderem wird ihm eine wichtige Rolle als zellautonomer Abwehrmechanismus gegen Mikroorganismen zugeschrieben; von manchen Infektionserregern wird er jedoch unterlaufen oder sogar genutzt. Der stärkste Auslöser der Autophagie ist ein Mangel an Nährstoffen, insbesondere Aminosäuren. Über die Deaktivierung der Kinase mTORC1 und die Phosphorylierung des eukaryoten Translationsinitiationsfaktors eIF2α hemmt die Nährstoffknappheit die Proteinbiosynthese und aktiviert gleichzeitig Autophagie. Wie Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, Autophagie auslösen oder manipulieren, ist derzeit Gegenstand intensiver Forschung. Modifikationen an Mikroben oder Phagosomen und Adapterproteine, die diese Veränderungen und Komponenten des Autophagieapparates erkennen, scheinen jedenfalls bei der selektiven Erkennung durch die Autophagie-Maschinerie wichtig zu sein. rnIn der vorliegenden Dissertationsarbeit wird die Rolle des membranporenbildenden α-Toxins von Staphylococcus aureus für die Induktion von Autophagie beleuchtet. Zum einen erwies sich die Akkumulation von (EGFP)-LC3(II), einem Marker der Autophagosomen, um intrazelluläre S. aureus als abhängig von α-Toxin. Zweitens, genügt extrazellulär appliziertes α-Toxin um (EGFP)-LC3(II)-positive Endosomen zu induzieren. Während der Angriff aus dem extrazellulären Raum jedoch binnen kurzer Zeit eine fokale Kumulation von phosphoryliertem eIF2α an der Plasmamembran induziert, die an der Internalisierung des Toxins beteiligt ist, findet sich am phagosomalen Kompartiment keine Toxin-abhängige Anhäufung von p-eIF2α oder proximalen Autophagieregulatoren. Dies impliziert, dass Toxin-Angriff auf die Plasmamembran, nicht aber auf das Phagosom, zu einer Reaktion führt, wie sie bei massivem Nährstoffmangel zu beobachten ist. Obwohl keine α-Toxin-abhängige Kumulation von p-eIF2α bei einem Angriff aus dem Phagosom erfolgt, findet sich um α-Toxin-produzierende Bakterien eine massive Kumulation von LC3 und Adapterprotein p62/Sequestosome1. Dies deutet daraufhin, dass der Ort des Angriffs - Plasmamembran oder Phagosom – für den Autophagie-induzierenden Mechanismus wichtig sein könnte. Der unterschiedliche Effekt auf die zellulären Ionenkonzentrationen, den ein Angriff auf die Plasmamembran oder auf ein Phagosom auslösen würde, bietet hierfür eine mögliche Erklärung. Die Aktivierung der Autophagie über Adapterproteine könnte dann als back-up Mechanismus fungieren, der auch dann greift, wenn eine Invasion ohne Schädigung der Plasmamembran erfolgt. Ein cross-talk der beiden Induktionswege ist angesichts der Bedeutung von p62 für die selektive und die Hunger-assoziierte Autophagie gut möglich; sezerniertes Toxin könnte durch die Aktivierung der basalen Autophagie Adapter-basierte Mechanismen verstärken.

Akkumulation von Splenozyten mit immunsuppressiven Eigenschaften in mastzelllosen Mäusen mit Kit-W-sh-Mutation

Mutationen, die zu einer reduzierten Aktivität der Tyrosinkinase c-Kit führen, können zum Verlust von Mastzellen führen, weshalb entsprechende Mausstämme intensiv zur Erforschung von Mastzellfunktionen verwendet werden. C-Kit ist der Rezeptor für den in der Hämatopoese essentiellen Stammzellfaktor (SCF) und die vorliegende Arbeit hatte daher das Ziel, mögliche weitere Auswirkungen der Mutation KitW-sh auf die Hämatopoese in Mäusen zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die KitW-sh-Mutation zu einer ausgeprägten extramedullären Hämatopoese in der Milz führt. Dies ist durch das vermehrte Vorkommen von hämatopoetischen Stammzellen und Vorläufern der myeloiden Zellreihe charakterisiert, die alle eine reduzierte Expression von c-Kit aufweisen. Detailiert untersucht wurde eine massiv expandierte Zellpopulation mit dem Phänotyp neutrophiler Granulozyten in den Milzen naiver KitW-sh-Mäuse. Es handelt sich hierbei jedoch um Zellen mit immunsuppressiven Eigenschaften, die in Wildtypmäusen typischerweise während der Entwicklung von Tumoren expandieren und als "myeloid-derived suppressor cells" (MDSC) angesprochen werden, eine phänotypisch und funktionell heterogene Zellgruppe. Die entsprechenden Zellen aus naiven KitW sh-Mäusen wurden als granulozytär-(G)-MDSC-ähnlichen Zellen bezeichnet, da sie in der Lage sind, in vitro die Proliferation von T-Zellen durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies zu hemmen und nach Transfer in tumortragende Wildtypmäuse das Tumorwachstum zu begünstigen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit unserer Beobachtung, dass der Transfer einer Karzinom-Zelllinie in KitW-sh-Mäusen zur Bildung größerer Tumore führt als in entsprechenden Wildtyp-Kontrolltieren, unabhängig von der Abwesenheit von Mastzellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen einen starken Einfluss der KitW-sh-Mutation nicht nur auf die Entwicklung von Mastzellen, sondern auch auf die extramedulläre Myelopoese. Die Expansion G-MDSC-ähnlicher Zellen mit potentiell immunsuppressiven Eigenschaften kann die Verwendung von KitW-sh-Mäusen für die gezielte Untersuchung Mastzell-spezifischer Phänomene einschränken.

Zelluläre und molekulare Mechanismen der angeborenen Immunität

Die myeloide Zelllinie MUTZ-3 konnte als geeignetes Modellsystem zur Charakterisierung der TREM-1-Signaltransduktion etabliert werden, da diese TREM-1 und dessen essentielles Adaptermoleküle DAP12 funktional exprimiert. Übereinstimmend mit bisherigen Daten wurden die Kinasen PI3K und p38-MAPK als wichtige Regulatoren in der Signalweiterleitung nach TREM-1-Aktivierung identifiziert, wobei sich einige Unterschiede in der exakten Signalhierarchie zwischen monozytären und granulozytären Zellen ergaben. So erfolgt die Aktivierung von PI3K und p38-MAPK in PMN unabhängig voneinander und in monozytären Zellen findet die Aktivierung von p38-MAPK vor der Akt-Phosphorylierung statt und ist für Letztere notwendig. Zudem ist die Ca2+-Mobilisierung in PMN nur von PI3K abhängig und in monozytären Zellen von PI3K und p38-MAPK. Bei der durch TLR- oder NLR-Koligation gesteigerten TREM-1-Aktivierung sind PI3K und p38-MAPK ebenfalls zentrale Regulatoren. Es ergaben sich ebenfalls Unterschiede in der exakten TREM-1-Signaltransduktion.rnrnEin Mausmodell für invasive Aspergillose (IA) wurde erfolgreich etabliert, wobei die wichtige Rolle der PMN bei der Abwehr von Pilzinfektionen durch deren Depletion mit unterschiedlichen Antikörpern belegt wurde. Für das Abtöten von A. fumigatus-Konidien sind oxidative und nicht-oxidative PMN-Effektormechanismen notwendig. Dabei konnte die essentielle Rolle der oxidativen PMN-Effektorfunktionen anhand NADPH-Oxidase-defizienter p47phox-/- und gp91phox-/- Mäuse für das Überleben von Pilzinfektionen gezeigt werden. Dagegen war die Infektion von Neutrophiler Elastase defizienter ELANE Mäuse nicht letal. Dies deutet darauf hin, dass diese als prototypische Serinprotease und wichtiger Bestandteil der NET-Formation nicht essentiell für das Überleben von IA ist oder durch andere, nicht-oxidative Effektormechanismen kompensiert werden kann. Keinen Einfluss auf die IA hatte die Depletion von Arginin mittels ADI-PEG, da weder das Überleben der Mäuse noch das Abtöten der Pilzkonidien beeinflusst wurde. Außerdem wurden keine Veränderung in der Einwanderung und Aktivierung von PMN nach Infektion quantifiziert. Dagegen induzierte die Defizienz in ADAMTS13 (ADAMTS13-/- Mäuse) eine verminderte Rekrutierung von PMN, einhergehend mit erhöhter Mortalität, vermindertem Abtöten von A. fumigatus-Konidien und erhöhter Schädigung der Lunge bei IA. Da in vitro keine generellen oder pilzspezifischen Defekte der PMN quantifiziert wurden, muss ADAMTS13 die Einwanderung der PMN beeinflussen. Normalerweise spaltet die Protease ADAMTS13 den von-Willebrand-Faktor (vWF), der die Quervernetzung und das Anhaften von Blutplättchen an beschädigte Gefäßwände steuert. Ob und wie ADAMTS13 oder der vWF die verminderte PMN-Einwanderung bei Pilzinfektionen verursacht, muss weiter untersucht werden.rnrnZusammenfassend verbessern die erhaltenen Daten für eine zellspezifische TREM-1-Signaltransduktion, ein von oxidativen und nicht-oxidativen PMN-Effektorfunktionen abhängiges sowie Arginin-unabhängiges Abtöten vom Pilz A. fumigatus als auch der Einfluss von ADAMTS13 und vWF bei der Rekrutierung von PMN nach A. fumigatus-Infektion unser Verständnis der angeborenen Immunität. Diese Erkenntnisse dienen der zukünftigen Entwicklung von Therapien zur Behandlung von schweren Entzündungsreaktionen wie Aspergillose und Sepsis.

Funktionelle Charakterisierung der Protein-Kinase CK2 in der Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen (Tregs) leisten durch ihre suppressiven Eigenschaften einen essenziellen Beitrag zur Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz. Sie verhindern schädliche Immunreaktionen gegen Autoantigene, kommensale Bakterien, sowie harmlose Nahrungsmittel-bestandteile. Gleichzeitig gewährleisten sie die Entwicklung effektiver Immunantworten gegen eindringende Pathogene, wie z.B. Parasiten, Bakterien und Viren. Damit haben Tregs direkten Einfluss auf das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz. Fehler in der suppressiven Funktionsweise von Tregs begünstigen daher auf der einen Seite die Entstehung zahlreicher autoimmuner Erkrankungen und Allergien. Auf der anderen Seite können Tregs Immunreaktionen bei chronischen Infektionen reduzieren, sowie die Entstehung effektiver Immunantworten gegen Tumore hemmen. Ihre Beteiligung an der Ätiologie all dieser Krankheiten macht Tregs zu einem bedeutenden potenziellen Zielobjekt, um diese Krankheiten effektiv zu therapieren. Die Erweiterung des Grundwissens um die molekularen Mechanismen der Treg-vermittelten Suppression ist daher ein notwendiger Schritt bei der Entwicklung Treg-basierter Theraphieansätze. 2003 konnte mit Foxp3 ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der maßgeblich die suppressiven Funktionen von Tregs steuert. Um weiteren Einblick in die der Suppression zugrundeliegenden Signalwege zu erhalten, wurde im Institut für Immunologie ein komparativer Kinomarray durchgeführt, anhand dessen die Casein Kinase 2 (CK2) als eine der aktivsten Kinasen in Tregs identifiziert wurde (Daten freundlicherweise von Prof. Dr. Tobias Bopp bereitgestellt). rnBasierend auf den Ergebnissen des Kinomarrays wurde in dieser Arbeit die Funktion der CK2 in Tregs untersucht. Dabei konnte in in vitro Experimenten die Treg-vermittelte Suppression durch den pharmakologische CK2 Inhibitor DMAT aufgehoben werden. Weil derartige Inhibitoren jedoch nicht absolut spezifisch die Aktivität nur einer Kinase supprimieren, wurden außerdem Mäuse mit konditionalem „knockout“ der CK2β Untereinheit spezifisch in Tregs gekreuzt (CK2βTreg-/- Mäuse). Die Analyse dieser Tiere offenbarte eine essenzielle Beteiligung der CK2 an den suppressiven Funktionen von Tregs. So entwickeln CK2βTreg-/- Mäuse mit zunehmendem Alter Splenomegalien und Lymphadenopathien, von denen in besonderem Maße die Mukosa-assoziierten Lymphknoten betroffen sind. Eine Analyse des Aktivierungsstatus der T-Zellen in den Tieren konnte zudem einen erhöhten Anteil sogenannter Effektor-Gedächtnis T-Zellen aufdecken, die charakteristische Merkmale eines Th2 Phänotyps zeigten. Erhöhte Titer des Antikörperisotyps IgE in den Seren von CK2βTreg-/- Mäusen suggerieren zusätzlich eine fehlerhafte Suppression speziell Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs. In Th2-vermittelten Asthma Experimenten in vivo konnte der Verdacht der fehlerhaften Kontrolle von Th2-Antwort bestätigt werden, wobei zusätzlich aufgedeckt wurde, dass bereits unbehandelte CK2βTreg-/- Mäuse Zeichen einer Entzündungsreaktion in der Lunge aufweisen. Bei der Suche nach den molekularen Ursachen der fehlerhaften Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs konnten zwei mögliche Erklärungsansätze gefunden werden. Zum einen zeigen CK2β-defiziente Tregs eine verringerte Expression von Foxp3, was, in Analogie zu Ergebnissen der Gruppe von R. Flavell (Wang Y.Y. Nature. 445, 766-770 (2007)), zu einer Konversion von Tregs zu Th2 Zellen und damit zur Entstehung eines Th2-basierten, autoimmunen Phänotyps führt. Des Weiteren weisen CK2β-defiziente Tregs eine reduzierte Expression des Transkriptionsfaktors IRF4 auf, der in Tregs entscheidend für die Kontrolle Th2-basierter Immunreaktionen ist (Zheng Y. Nature. 19; 351-356 (2009)). Die dargelegten Ergebnisse identifizieren die CK2 damit als Kinase, die entscheidend an der Treg-vermittelten Suppression speziell Th2-basierter Immunantworten beteiligt ist. Demnach könnten pharmakologische CK2 Inhibitoren beispielsweise dazu eingesetzt werden, um die Treg-vermittelte Suppression im Rahmen chronischer Parasiten-Infektionen aufzuheben. Die in CK2βTreg-/- Mäusen beobachtete Prävalenz der Funktion der CK2 für Mukosa-assoziierte Organe stellt dabei einen zusätzlichen Vorteil dar, weil systemische Nebenwirkungen, die durch die Blockade der Treg-vermittelte Suppression entstehen, zumindest in nicht-Mukosa-assoziierten Geweben nicht zu erwarten sind.rn

Optimization of RNA-based transgene expression by targeting Protein Kinase R

The aim of this thesis was to establish a method for repeated transfection of in vitro transcribed RNA (IVT-RNA) leading to a sustained protein expression lasting for days or even weeks. Once transfected cells recognize IVT-RNA as "non-self" and initiate defense pathways leading to an upregulated interferon (IFN) response and stalled translation. In this work Protein Kinase R (PKR) was identified as the main effector molecule mediating this cellular response. We assessed four strategies to inhibit PKR and the IFN response: A small molecule PKR inhibitor enhanced protein expression and hampered the induction of IFN-transcripts, but had to be excluded due to cytotoxicity. A siRNA mediated PKR knockdown and the overexpression of a kinase inactive PKR mutant elevated the protein expression, but the down-regulation of the IFN response was insufficient. The co-transfer of the viral inhibitors of PKR and the IFN response was most successful. The use of E3, K3 and B18R co-transfection enabled repeated IVT-RNA-based transfection of human fibroblasts. Thus, the developed protocol allows a continuous IVT-RNA encoded protein expression of proteins, which could be the basis for the generation of induced pluripotent stem cells (iPS) for several therapeutic applications in regenerative medicine or drug research.