Zelluläre und molekulare Mechanismen der angeborenen Immunität

Die myeloide Zelllinie MUTZ-3 konnte als geeignetes Modellsystem zur Charakterisierung der TREM-1-Signaltransduktion etabliert werden, da diese TREM-1 und dessen essentielles Adaptermoleküle DAP12 funktional exprimiert. Übereinstimmend mit bisherigen Daten wurden die Kinasen PI3K und p38-MAPK als wichtige Regulatoren in der Signalweiterleitung nach TREM-1-Aktivierung identifiziert, wobei sich einige Unterschiede in der exakten Signalhierarchie zwischen monozytären und granulozytären Zellen ergaben. So erfolgt die Aktivierung von PI3K und p38-MAPK in PMN unabhängig voneinander und in monozytären Zellen findet die Aktivierung von p38-MAPK vor der Akt-Phosphorylierung statt und ist für Letztere notwendig. Zudem ist die Ca2+-Mobilisierung in PMN nur von PI3K abhängig und in monozytären Zellen von PI3K und p38-MAPK. Bei der durch TLR- oder NLR-Koligation gesteigerten TREM-1-Aktivierung sind PI3K und p38-MAPK ebenfalls zentrale Regulatoren. Es ergaben sich ebenfalls Unterschiede in der exakten TREM-1-Signaltransduktion.rnrnEin Mausmodell für invasive Aspergillose (IA) wurde erfolgreich etabliert, wobei die wichtige Rolle der PMN bei der Abwehr von Pilzinfektionen durch deren Depletion mit unterschiedlichen Antikörpern belegt wurde. Für das Abtöten von A. fumigatus-Konidien sind oxidative und nicht-oxidative PMN-Effektormechanismen notwendig. Dabei konnte die essentielle Rolle der oxidativen PMN-Effektorfunktionen anhand NADPH-Oxidase-defizienter p47phox-/- und gp91phox-/- Mäuse für das Überleben von Pilzinfektionen gezeigt werden. Dagegen war die Infektion von Neutrophiler Elastase defizienter ELANE Mäuse nicht letal. Dies deutet darauf hin, dass diese als prototypische Serinprotease und wichtiger Bestandteil der NET-Formation nicht essentiell für das Überleben von IA ist oder durch andere, nicht-oxidative Effektormechanismen kompensiert werden kann. Keinen Einfluss auf die IA hatte die Depletion von Arginin mittels ADI-PEG, da weder das Überleben der Mäuse noch das Abtöten der Pilzkonidien beeinflusst wurde. Außerdem wurden keine Veränderung in der Einwanderung und Aktivierung von PMN nach Infektion quantifiziert. Dagegen induzierte die Defizienz in ADAMTS13 (ADAMTS13-/- Mäuse) eine verminderte Rekrutierung von PMN, einhergehend mit erhöhter Mortalität, vermindertem Abtöten von A. fumigatus-Konidien und erhöhter Schädigung der Lunge bei IA. Da in vitro keine generellen oder pilzspezifischen Defekte der PMN quantifiziert wurden, muss ADAMTS13 die Einwanderung der PMN beeinflussen. Normalerweise spaltet die Protease ADAMTS13 den von-Willebrand-Faktor (vWF), der die Quervernetzung und das Anhaften von Blutplättchen an beschädigte Gefäßwände steuert. Ob und wie ADAMTS13 oder der vWF die verminderte PMN-Einwanderung bei Pilzinfektionen verursacht, muss weiter untersucht werden.rnrnZusammenfassend verbessern die erhaltenen Daten für eine zellspezifische TREM-1-Signaltransduktion, ein von oxidativen und nicht-oxidativen PMN-Effektorfunktionen abhängiges sowie Arginin-unabhängiges Abtöten vom Pilz A. fumigatus als auch der Einfluss von ADAMTS13 und vWF bei der Rekrutierung von PMN nach A. fumigatus-Infektion unser Verständnis der angeborenen Immunität. Diese Erkenntnisse dienen der zukünftigen Entwicklung von Therapien zur Behandlung von schweren Entzündungsreaktionen wie Aspergillose und Sepsis.

The triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) is an important mediator of innate inflammatory responses, especially during microbial infections and sepsis. TREM-1 ligation on polymorphonuclear neutrophils (PMN) or monocytes results e.g. in the production of proinflammatory cytokines and chemokines like IL-8. Towards cellular mechanisms, TREM-1 engagement induces the activation of MAP kinases as well as rapid Ca2+ mobilization. In PMN the kinases phosphatidyl-inositide 3-kinase (PI3K) and p38-MAPK regulate independently from each other TREM-1 effector mechanisms. However, a detailed understanding of TREM-1 signaling pathways in monocytic versus granulocytic cells is currently missing.rnrnIn our present work, we evaluated the TREM-1 signaling hierarchy in monocytic cells and found that the acute myeloid leukemia cell line MUTZ-3 expresses TREM-1 in a natural and functional manner. We compared essential signaling molecules of the of the TREM-1, TLR and NLR cascades in MUTZ-3 cells as well as primary monocytes or PMN by Western Blot analysis. These studies confirmed the essential role of PI3K and p38-MAPK in the TREM-1 as well as the TLR or NLR cascades of monocytic cells. Importantly, PI3K and p38-MAPK signals in monocytic cells both control Ca2+ mobilization and are directly connected in the TREM-1 signaling hierarchy, which contrasts previous results obtained in PMN showing only a PI3K dependent Ca2+ mobilization and a regulation of PI3K and p38-MAPK independently from each other. Taken together, our results indicate cell type specific differences in the TREM-1 signaling cascade and contribute to an enhanced understanding of the regulation of innate inflammatory responses.rnrnIn addition, PMN are important for the control of invasive aspergillosis (IA), a major threat to immunocompromised individuals. To clear A. fumigatus infections, PMN employ potent oxidative and non-oxidative mechanisms, i.e. releasing intracellular granules containing antimicrobial proteins like neutrophil elastase (ELA) and inflammatory mediators.rnrnTo study the relative contribution of these mechanisms, mice with a defective NADPH oxidase (p47phox-/- and gp91phox-/-) rendering phagocytes incapable of generating measurable superoxides and ELA deficient (ELANE) mice were analyzed after intratracheal infection with A. fumigatus. Infected p47phox-/- and gp91phox-/- mice died within three days and had a significant higher fungal burden compared to wildtype mice determined by colony-forming units of lung homogenates. This clearly demonstrats the essential role of the oxidative burst for fungal killing. Interestingly, in ELANE mice the survival after infection was unimpaired indicating that ELA is not essential here. Nevertheless, we detected delayed A. fumigatus clearance in vivo in ELANE mice indicating a partial contribution of ELA as a major component of azurophilic granules to fungal immunity.rnrnMoreover, the effect of arginine deficiency on the course of IA was analyzed, as this suppresses adaptive immune responses as well as viral, bacterial and vermicular expansion. Infection of immunocompetent as well as neutropenic, arginine depleted mice did not affect survival, fungal killing, PMN recruitment or activation compared to control groups denoting no impact of arginine as well as their effector molecules arginase-1 and inducible nitric oxide synthase (iNOS) on the fungal clearance in IA.rnrnvon Willebrand factor (VWF) levels as well as the activity of the metalloprotease ADAMTS13 cleaving ultra-large vWF multimers decreases in both acute and chronic inflammation. In mice, ADAMTS13 deficiency results in increased leukocyte rolling and adhesion on veins and enhanced, vWF-dependent extravasation of PMN in inflammatory models. In contrast, PMN recruitment was diminished after pulmonary infection with A. fumigatus resulting in increased fungal burden, lung injury as well as mortality. These findings suggest an important influence of ADAMTS13 on PMN recruitment depending on the used infection model, while the exact mechanism remains elusive.rnrnIn summary, the proposed cell type specific TREM-1 signaling, the oxidative and non-oxidative dependent and arginine independent fungal clearance as well as the influence of ADAMTS13 and vWF on PMN recruitment after A. fumigatus infection improve our understanding of the innate immune response and might contribute to the development of future concepts for the treatment of severe inflammatory conditions such as aspergillosis or sepsis.