Funktionelle Charakterisierung des TRPM5-Gens

In der vorliegenden Promotionsarbeit wurde der zur TRP (transient receptor potential)-Familie geh��rende TRPM5-Kanal funktionell charakterisiert. Elektrophysiologische Analysen TRPM5-��berexprimierender HEK 293-Zellen zeigten, dass TRPM5 einen Ca2+-aktivierbaren, nicht-selektiven Kationenkanal darstellt, der monovalente Ionen leitet. Die Aktivierung des TRPM5-Kanals h��ngt insbesondere von der Geschwindigkeit des intrazellul��ren Ca2+-Anstiegs ab. Somit stellt TRPM5 eine Komponente der zellul��ren Signaltransduktionskaskaden dar: Nach Rezeptoraktivierung induziert TRPM5 einen raschen, transienten Kationeneinstrom, der zur Depolarisation der Zellmembran f��hrt. Die Expression der beiden humanen TRPM5-Splei��formen als TRPM5/EGFP-Fusionsproteine in HEK 293-Zellen zeigte eine vorwiegende Lokalisation in der Zellmembran. In elektrophysiologischen Analysen wurde nachgewiesen, dass TRPM5-short als TRPM5-Kanalblocker funktioniert. F��r die funktionelle in vivo-Charakterisierung des TRPM5-Kanals wurde ein auf RNAi (RNA interference) basierendes, transgenes Trpm5-knock down-Mausmodell hergestellt. Obwohl in drei der vier etablierten Knock down-Mauslinien eine Trpm5-Herunterregulation in der Leber und/oder in der Zunge nachgewiesen werden konnte, zeigten alle M��use einen wildtyp-��hnlichen Ph��notyp. Weiterf��hrende Untersuchungen an den von Zhang et al. (Cell, 2003) hergestellten Trpm5-knock out-M��usen offenbarten, dass Trpm5 f��r eine geregelte Glukosetoleranz essentiell ist. Insulinsekretionsanalysen mit isolierten Langerhans���schen Inseln dieser M��use zeigten, dass ohne Trpm5 eine beeintr��chtigte Insulinsekretionskinetik in den pankreatischen Betazellen vorliegt. Somit stellt TRPM5 einen neuen Kandidaten f��r Erkrankungen wie Diabetes Typ 2 dar, die durch eine Fehlregulation der Insulinsekretion gekennzeichnet sind.

Induktion und Signaltransduktion bei der Expression des Chemokins MCP-1 in Monozyten

Das Chemokin 'Monocyte Chemoattractant Protein-1' (MCP-1) spielt bei inflammatorischen Erkrankungen eine wesentliche Rolle. Verschiedene Zelltypen produzieren MCP-1. Es interessierte, welche Stimuli in Monozyten MCP-1 induzieren k��nnen und welche Signaltransduktionskaskaden daran beteiligt sind. Dar��ber hinaus sollte die Rolle einzelner Transkriptionsfaktoren und Promotorregionen des MCP-1-Gens untersucht werden.Komponenten Gram-positiver und -negativer Bakterien, Phorbolester und Substanzen, die die intrazellul��re Calciumkonzentration erh��hen, induzierten die MCP-1-Expression in einer humanen myelomonozyt��ren Zellinie (THP-1) und in frisch isolierten Monozyten. Die mit Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte MCP-1-Expression war stark von der MAPK/ERK-Kinase (MEK)-1/-2 und von I-kappaB Kinasen beziehungsweise NF-kappaB abh��ngig, dagegen scheinen Calcineurin, Calmodulinkinasen und die 'Mitogen-Activated Protein Kinase' p38 keine entscheidende Rolle zu spielen. Die Thapsigargin (TG)-induzierte MCP-1-Bildung durch Erh��hung der intrazellul��ren Calciumkonzentration war zus��tzlich von Calcineurin und Calmodulinkinasen abh��ngig. Als nukle��re Transkriptionsfaktoren wurden bei der LPS-Stimulation NF-kappaB sowie AP-1 und zus��tzlich NF-ATc3 bei Stimulation durch TG nachgewiesen. Die Untersuchung des MCP-1-Promotors konnte eine Bindung von NF-kappaB- und AP-1-Mitglieder an eine bislang nicht untersuchte distale Region und eine AP-1-Bindung an eine proximale Region nachweisen. Die Ergebnisse lassen den Schlu�� zu, da�� die Aktivierung der MCP-1-Expression durch verschiedene Stimuli unter Beteiligung teilweise unterschiedlicher Signaltransduktionswege abl��uft und sowohl eine proximale als auch eine distale Promotorregion des MCP-1-Gens daran beteiligt ist.

Elektrophysiologische Charakterisierung und PKC-vermittelte Regulation des humanen Transporters f��r basische Aminos��uren hCAT-1

ZusammenfassungDer humane kationische Aminos��ure-Transporter hCAT-1 (CAT f��r cationic amino acid transporter) geh��rt zur Familie der Na+- und pH-unabh��ngigen Transporter f��r basische Aminos��uren (BAS). Die vorliegende Arbeit befasst sich mit unterschiedlichen Aspekten des hCAT-1-vermittelten Transportes, die in zwei Teilabschnitten behandelt werden. Im ersten Abschnitt wurden die Transporteigenschaften von hCAT-1-exprimierenden X. laevis-Oozyten mit Hilfe von elektrophysiologischen Methoden untersucht und mit denen der Isoformen hCAT-2A und -2B verglichen. Dabei zeigte sich, dass es durch die Expression von hCAT-2A und -2B in Oozyten zur Bildung eines BAS-Potentiales kommt, jedoch nicht durch die Expression von hCAT-1. Hierf��r d��rfte die hohe Transstimulierbarkeit des hCAT-1-Proteins verantwortlich sein. Obwohl das Membranpotential einer Zelle die Akkumulation von BAS durch die hCAT-Proteine beeinflusst, war bei sehr hohen extrazellul��ren BAS-Konzentrationen die Akkumulation durch hCAT-1 und -2B im Gegensatz zu hCAT-2A nicht vom Membranpotential abh��ngig, da unter diesen Bedingungen der Efflux limitierend wirkte. Mit Hilfe der voltage clamp-Methode wurden die L-Arginin-induzierten Maximalstr��me (Vmax) und die Leitf��higkeiten der hCAT-Proteine bestimmt. Die so ermittelten Vmax-Werte sind nur halb so gro�� wie die durch Flux-Studien bestimmten. Daher muss von einem Gegentransport an positiver Ladung (Substrat) ausgegangen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die hCAT-Isoformen zwei unterschiedliche Leitf��higkeitszust��nde f��r BAS besitzen, die von der intrazellul��ren BAS-Konzentration abh��ngig sind. Eine Leitf��higkeitszunahme durch Zugabe von extrazellul��rem L-Arginin konnte bei allen hCAT-Isoformen in depletierten Oozyten beobachtet werden. In BAS-beladenen Oozyten f��hrte die Zugabe von L-Arginin dagegen zu keiner (hCAT-1 und hCAT-2B) bzw. zu einer geringen (hCAT-2A) Zunahme der Leitf��higkeit der Transporter. Im Substratgleichgewicht jedoch nahm die Leitf��higkeit der drei untersuchten hCAT-Isoformen in Abh��ngigkeit von der Substratkonzentration zu. ��berraschenderweise wurden f��r die untersuchten hCAT-Isoformen Leck-Str��me in Abwesenheit von BAS nachgewiesen. An hCAT-2B-exprimierenden Oozyten wurde eine erh��hte Leitf��higkeit f��r K+-Ionen gezeigt. Die physiologische Bedeutung dieser Kanalfunktion ist jedoch noch v��llig ungekl��rt. Im zweiten Abschnitt wurde der Mechanismus der Proteinkinase C (PKC)-vermittelten Inhibition der hCAT-1-Transportaktivit��t untersucht. Hierf��r wurden hCAT-1.EGFP-Konstrukte in Oozyten und in U373MG Glioblastom-Zellen exprimiert. Mit Hilfe konfokaler Mikroskopie und Western-Blot-Analysen von biotinylierten Zelloberfl��chen-Proteinen wurde gezeigt, dass die PKC-vermittelte Reduktion der hCAT-1-Transportaktivit��t auf einer Reduktion der hCAT-Expression an der Zelloberfl��che beruht. ��hnliche Ergebnisse wurden auch mit dem endogen in humanen DLD-1 Kolonkarzinom-Zellen exprimierten hCAT-1 erzielt. Der PKC-Effekt war auch noch nach Entfernung der putativen PKC-Erkennungsstellen am hCAT-1-Protein vorhanden. Daher reguliert die PKC die hCAT-1-Transportaktivit��t vermutlich ��ber einen indirekten Mechanismus, d. h. nicht ��ber eine direkte Phosphorylierung des hCAT-1-Proteins. Die Ver��nderung der Zelloberfl��chenexpression stellt einen neuen Regulationsmechanismus f��r die CAT-Proteine dar, der erkl��ren kann, warum sich Modifikationen in der CAT-Proteinexpression oft nicht in entsprechenden Ver��nderungen der Transportaktivit��t widerspiegeln.

Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenstr��me an nozizeptiven Spinalganglienneuronen der Ratte

Die freien Endigungen von Spinalganglienneuronen sind f��r die Detektion schmerzhafter Reize verantwortlich. Dabei rufen thermische, chemische oder mechanische Reize Ionenstr��me ��ber die Membran und dadurch Membranpotential��nderungen hervor. Diese noxisch induzierten Str��me sind in gro��em Ausma�� durch chemische Substanzen und andere Reize modulierbar. Der Ionenkanal TRPV1 ist f��r die Detektion zahlreicher chemischer Reize und zumindest eines Teils der noxischen Hitzereize verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige der Mechanismen gekl��rt, die zur schnellen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenstr��me f��hren. Hierf��r wurden akut dissoziierte Spinalganglienneurone der Ratte als Modell ihrer peripheren Endigung verwendet und mittels Ganzzellableitung in der patch-clamp-Technik untersucht. Die Verwendung von Trypsin w��hrend der Pr��paration von Spinalganglienneuronen hat keinen funktionellen Einfluss auf hitze- oder capsaicininduzierte Str��me, verbessert aber die Untersuchungsbedingungen f��r das patch-clamp-Verfahren. Bei 144 akut dissoziierten Spinalganglienneuronen wurden die Stromantworten auf drei im Abstand von 40 s durch ��bersp��len mit 45,3 bis 46,3��C hei��er Extrazellularl��sung applizierte einsek��ndige Hitzereize gemessen. Dabei lie��en sich repetitiv reproduzierbare hitzeinduzierte Einw��rtsstr��me von etwa 160 pA erzielen; es konnte keine Tachyphylaxie und nahezu keine Inaktivierung beobachtet werden. Direkt vor dem zweiten Hitzereiz wurden die Neurone f��r zwei Sekunden mit Extrazellularl��sung ��bersp��lt, die Kontrolll��sung, 0,5 ��M Capsaicin, 10 ��M Natriumnitroprussid oder 10 ��M YC-1 enthielt. Es fand sich kein Hinweis, dass Stickstoffmonoxid oder die Guanylatzyklase einen signifikanten Beitrag zur Sensibilisierung von hitzeinduzierten Str��men in Spinalganglienneuronen leisten, wobei ein durch den Versuchsaufbau bedingtes Auswaschen zytosolischer Faktoren, die f��r den Signalweg notwendig sind, nicht ausgeschlossen werden kann. Bei einer Konzentration von 0,5 ��M l��st Capsaicin f��r zwei Sekunden einen sehr kleinen Einw��rtsstrom von etwa 33 pA aus und f��hrt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung von hitzeinduzierten Einw��rtsstr��men in Spinalganglienneuronen (p<0,01). Das Ausma�� der Sensibilisierung ist proportional zur Gr����e des capsaicininduzierten Stromes (r=���0,7, p<0,001). Konstant halten der intrazellul��ren Calciumkonzentration mittels des Calciumchelators BAPTA verhindert die capsaicininduzierte Sensibilisierung hitzeinduzierter Str��me an Spinalganglienneuronen. Demzufolge beruht die capsaicininduzierte Sensibilisierung trotz der schnellen Kinetik nicht auf einer synergistischen Wirkung der beiden Agonisten Capsaicin und Hitze auf ihren gemeinsamen Rezeptor; vielmehr ist sie von einer Erh��hung der intrazellul��ren freien Calciumkonzentration abh��ngig. Funktionelle ��nderungen der zellul��ren Funktion werden h��ufig durch Proteinkinasen vermittelt. Die zur Gruppe der MAP-Kinasen geh��rende ERK (extracellular signal related kinase) wird bei Membrandepolarisation und Calciumeinstrom in die Zelle durch MEK (MAPK/extracellular signal related kinase kinase) aktiviert. Blockade der MEK/ERK-Kaskade durch den spezifischen MEK-Hemmstoff U0126 f��hrt ebenfalls zu einer Aufhebung der Sensibilisierung der Hitzeantworten durch Capsaicin. Applikation von Capsaicin f��hrt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenstr��me an nozizeptiven Spinalganglienneuronen. Diese Sensibilisierung wird durch einen Calciumeinstrom in die Zelle und die dadurch eintretende Aktivierung von Proteinkinasen hervorgerufen. Die MEK/ERK-Kaskade ist ein sehr schnell (deutlich unter 2 s) aktivierbares intrazellul��res Signalsystem, welches bei der Regulation der Empfindlichkeit nozizeptiver Spinalganglienneurone eine entscheidende Rolle spielt; die schnelle Kinetik ist dabei nur durch eine membranst��ndige oder zumindest membrannahe Lokalisation dieser Proteinkinasen erkl��rbar. Durch Applikation zehnsek��ndiger Hitzereize l��sst sich ebenfalls eine Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenstr��me ausl��sen, die ebenso ausgepr��gt ist, wie die Sensibilisierung durch 0,5 ��M Capsaicin (p<0,005). Durch das immer gr����ere Verst��ndnis der Funktionsweise des nozizeptiven Systems ergeben sich st��ndig neue Ans��tze f��r die Entwicklung neuer Analgetika. So k��nnte durch Modulation spezifischer intrazellul��rer Proteinkinasen der Phosphorylierungszustand und damit die Aktivierbarkeit von Ionenkan��len, die der Transduktion noxischer Reize dienen, positiv beeinflusst werden. Neuere, noch spezifischere Inhibitoren der MEK k��nnen der Forschung und sp��ter auch der Therapie neue M��glichkeiten er��ffnen.

Synthese, 18 F-Markierung, 11 C-Markierung und Evaluierung Hydantoin-substituierter Indolcarbons��uren zur Visualisierung des NMDA-Rezeptorstatus mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)

Der N-methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA), als Vertreter ionotroper Glutamat-Rezeptoren, ist essentiell f��r physiologische Lern- und Ged��chtnisvorg��nge und eine krankhafte ��beraktivierung wird als potentielle Ursache f��r eine Reihe von akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen angesehen. Hierbei sind f��r die akuten Erkrankungen vor allem der Schlaganfall und f��r die chronischen Erkrankungen Morbus Parkinson sowie die Alzheimer��sche Demenz zu nennen. Durch seine einzigartige spannungsabh��ngige Mg2+-Blockade und der Notwendigkeit der gleichzeitigen Anwesenheit der endogenen Liganden Glutamat und Glycin zur Rezeptoraktivierung, stellt dieser Rezeptorkomplex daher ein sehr interessantes molekulares Target dar. NMDA-Rezeptor-Antagonisten der Glycin-Bindungsstelle und der verschiedenen allosterischen Bindungsstellen k��nnten als Neuroprotektiva bei den verschiedenen Krankheiten eine symptomatische Verbesserung bewirken und zur Therapie eingesetzt werden. Eine visuelle Darstellung des Rezeptors im Rahmen von Vorsorgeuntersuchungen ist jedoch derzeit nicht m��glich. Zur Visualisierung dieser Prozesse mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wurden basierend auf einer Hydantoin-substituierten Indol-2-carbons��ure als Leitstruktur, im Rahmen dieser Arbeit Fluorethoxy- und Methoxy-substituierte Derivate dargestellt und in pharmazeutischen und radiopharmazeutischen Studien evaluiert. Dazu wurde die Affinit��t und Spezifit��t zum Rezeptor in einem [3H]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassay und die Lipophilie als Parameter f��r die Hirng��ngigkeit ermittelt. Anhand dieser Resultate wurden geeignete Markierungsvorl��ufer synthetisiert, welche eine phenolische Hydroxylfunktion besitzen und eine radioaktive Markierung mit den sekund��ren Markierungsvorl��ufern 2-[18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [11C]Methyliodid ([11C]CH3I) erm��glichen. Unter Verwendung von 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ure wurde in einer Einstufenreaktion mit [18F]FETos die Zielverbindung 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ure in radiochemischen Ausbeuten von 6 % erhalten. Daher wurde eine alternative Markierung des Ethylester-gesch��tzten Derivates 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ureethylester in einer Zweistufensynthese mit [18F]FETos und [11C]CH3I untersucht. Unter Verwendung dieser Strategie wurden unter optimierten Bedingungen 4,6-Dichlor-3-((3-4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ureethylester und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxy-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)-methyl)-indol-2-carbons��ureethylester in radiochemischen Ausbeuten von 27 ��� 38 % erhalten. Die anschlie��ende Entfernung der Schutzgruppe f��hrte unter Bildung von Neben- und Zersetzungsreaktionen zu 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ure und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbons��ure in radiochemischen Gesamtausbeuten von 5 ��� 7 %. Die ��berpr��fung des biochemischen Konzepts in vivo durch ��-PET-Studien und durch autoradiographische Experimente an Rattenhirnschnitten, deuten auf eine niedrige in vivo-Aktivit��t hin, welche sich auf eine nicht ausreichende Passage der Blut-Hirn-Schranke zur��ckf��hren l��sst.

Mechanismen und funktionelle Konsequenzen der Chlorid-Hom��ostase in unreifen Neuronen des Neocortex

GABA, der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im adulten Gehirn, bewirkt im unreifen Nervensystem eine Membrandepolarisation, vermutlich aufgrund der erh��hten intrazellul��ren Chloridkonzentration ([Cl-]i) in unreifen Nervenzellen. GABAerge Membrandepolarisationen sind essentiell f��r die korrekte Entwicklung des zentralen Nervensystems und die Entstehung kortikaler Netzwerkaktivit��t. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe elektrophysiologischer und immunohistochemischer Methoden die Regulation der Chlorid-Hom��ostase in unreifen Neuronen des Neokortex untersucht. Die Experimente wurden an Cajal-Retzius (CR) Zellen, einem transienten Zelltyp der Marginalzone, in akuten Hirnschnittpr��paraten neonataler Ratten (P0-P3) durchgef��hrt. Es konnte gezeigt werden, dass CR Zellen eine hohe native [Cl-]i von ~30 mM aufweisen. Die hohe [Cl-]i wurde ausschlie��lich durch Bumetanid sensitiven und Na+-abh��ngigen aktiven Cl--Transport aufrechterhalten, was auf eine Cl--Akkumulation durch den Kationen-Chlorid-Cotransporter NKCC1 schlie��en l��sst. Diese pharmakologischen Hinweise konnten durch den Nachweis der Expression von NKCC1 in der gesamten Marginalzone, speziell in CR Zellen, best��tigt werden. Die Transportgeschwindigkeit der NKCC1-abh��ngigen Cl--Akkumulation war gering, was auf eine limitierte Transportkapazit��t schlie��en l��sst. In ��bereinstimmung mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Cl--Leitf��higkeit in CR Zellen ��u��erst klein ist, so dass die NKCC1-abh��ngige Cl--Akkumulation ausreichend war, um unter Ruhebedingungen eine hohe [Cl-]i zu gew��hrleisten. Aufgrund dieser hohen [Cl-]i waren GABAA-Rezeptor vermittelte Antworten in CR Zellen exzitatorisch. Die Kapazit��t des NKCC1-vermittelten Cl--Transportes in CR Zellen konnte durch h��herfrequente Stimulation ��berschritten werden, was dazu f��hrte, dass die [Cl-]i abnahm und GABAerge Antworten unter diesen Bedingungen inhibitorisch wurden. Die inhibitorische Wirkung von GABA in CR Zellen wurde ��berwiegend durch die Reduktion des Eingangswiderstandes der Zelle vermittelt und beruhte nicht auf einer Verschiebung der Aktionspotentialschwelle.

Asymmetrisches Dimethylarginin als kardiovaskul��rer Risikofaktor : Transportmechanismen und Auswirkungen einer Akkumulation

Die vorliegende Dissertation besch��ftigt sich mit dem Membrantransporter-vermittelten Export von asymmetrischem Dimethyl-L-Arginin (ADMA) aus der Endothelzelle. Da ADMA-Plasmakonzentrationen mit Erkrankungen wie koronaren Herzkrankheiten, Atherosklerose, Bluthochdruck und Endotheldysfunktion in Verbindung gebracht werden, ist ein effektiver ADMA-Export aus der Zelle heraus unabdingbar. Um den Mechanismus hierf��r aufzukl��ren, wurden die immortalisierte Endothelzelllinie EA.hy926 und weitere prim��re Endothelzellen (humane Umbilikalvenenendothelzellen und Endothelzellen der gro��en und kleinen Herzgef����e) auf die Expression basischer Aminos��uretransporter mittels einer qRT-PCR hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle getesteten Endothelzellen die Aminos��uretransporter hCAT-1, y+LAT1 und y+LAT2 exprimierten. Basierend auf ADMA-Exportdaten, die mit entsprechenden Transporter-��berexprimierenden Xenopus laevis-Oozyten gewonnen wurden, wurde festgestellt, dass alle drei Membrantransporter ADMA exportieren konnten. Der physiologisch wichtige Exportweg f��r intrazellul��r anfallendes ADMA scheint dabei der via y+L zu sein, da es sich hierbei um einen aktiven Exportmechanismus handelt, der im Gegentransport von im humanen Plasma reichlich vorhandenen neutralen Aminos��uren und Natriumionen den nach innen gerichteten Natriumgradienten ausnutzt. Die Wichtigkeit des Membrantransportes f��r die Kontrolle intrazellul��rer ADMA-Konzentrationen wurde in vitro durch Entzug von extrazellul��ren Austauschsubstraten und einer daraus resultierenden Blockade der Transportfunktion gezeigt. Hierbei wurde innerhalb von zwei Stunden ein 2,5-facher Anstieg der intrazellul��ren ADMA-Konzentration festgestellt, die bei Pr��senz von Austauschsubstrat f��r die Transporter nicht auftrat. Die Relevanz der y+LATs f��r den ADMA-Export wurde durch Herunterregulation dieser Proteine mittels siRNA sichtbar: Unter diesen Bedingungen konnte ADMA auch in Anwesenheit von Austauschsubstrat f��r das System y+L weniger effektiv exportiert werden. Eine wichtige Aufgabe des humanen Endothels ist die Bildung bioaktiven Stickstoffmonoxids, das unter anderem eine Vasodilatation der Gef����e bewirkt. F��r diese NO-Synthese wird L-Arginin als Substrat von der endothelialen NO-Synthase ben��tigt. ADMA stellt einen kompetitiven Inhibitor dar, dessen erh��htes intrazellul��res Vorkommen m��glicherweise hemmend auf die NO-Synthase wirken k��nnte. Es konnten hier allerdings keine Auswirkungen eines um das 4-fache gestiegenen, intrazellul��ren ADMA-Spiegels auf die T��tigkeit der endothelialen NO-Synthase festgestellt werden. M��glicherweise bedarf es eines noch weiter zu Gunsten des ADMAs verschobenen, intrazellul��ren L-Arginin:ADMA-Verh��ltnisses, um eine Hemmung der NO-Synthase festzustellen. Dies k��nnte bei einem pathologischen Transporterausfall eintreten, der intrazellul��r permanent h��here ADMA-Konzentrationen zur Folge h��tte. Des Weiteren h��tte ein Anstieg der Arginaset��tigkeit und damit einhergehend ein Substratdefizit f��r die NO-Synthase den gleichen Effekt. Der translationale Ansatz mit humanen peripheren mononukle��ren Blutzellen von Patienten aus der 2. Medizinischen Klinik zeigte die Tendenz einer Korrelation zwischen dem ADMA-Exportverm��gen und der Endothelfunktion und brachte zudem die Erkenntnis eines individuell ��u��erst variablen ADMA-Exportverm��gens zutage.

Regulatory T cell-mediated suppression of Th9 cell development and effector function

T helper (Th) 9 cells are an important subpopulation of the CD4+ T helper cells. Due to their ability to secrete Interleukin-(IL-)9, Th9 cells essentially contribute to the expulsion of parasitic helminths from the intestinal tract but they play also an immunopathological role in the course of asthma. Recently, a beneficial function of Th9 cells in anti-tumor immune responses was published. In a murine melanoma tumor model Th9 cells were shown to enhance the anti-melanoma immune response via the recruitment of CD8+ T cells, dendritic cells and mast cells. In contrast to Th9 effector cells regulatory T cells (Tregs) are able to control an immune response with the aid of different suppressive mechanisms. Based on their ability to suppress an immune response Tregs are believed to be beneficial in asthma by diminishing excessive allergic reactions. However, concerning cancer they can have a detrimental function because Tregs inhibit an effective anti-tumor immune reaction. Thus, the analysis of Th9 suppression by Tregs is of central importance concerning the development of therapeutic strategies for the treatment of cancer and allergic diseases and was therefore the main objective of this PhD thesis.rnIn general it could be demonstrated that the development of Th9 cells can be inhibited by Tregs in vitro. The production of the lineage-specific cytokine IL-9 by developing Th9 cells was completely suppressed at a Treg/Th9 ratio of 1:1 on the transcriptional (qRT-PCR) as well as on the translational level (ELISA). In contrast, the expression of IRF4 that was found to strongly promote Th9 development was not reduced in the presence of Tregs, suggesting that IRF4 requires additional transcription factors to induce the differentiation of Th9 cells. In order to identify such factors, which regulate Th9 development and therefore represent potential targets for Treg-mediated suppressive mechanisms, a transcriptome analysis using ���next-generation sequencing��� was performed. The expression of some genes which were found to be up- or downregulated in Th9 cells in the presence of Tregs was validated with qRT-PCR. Time limitations prevented a detailed functional analysis of these candidate genes. Nevertheless, the analysis of the suppressive mechanisms revealed that Tregs probably suppress Th9 cells via the increase of the intracellular cAMP concentration. In contrast, IL-9 production by differentiated Th9 cells was only marginally affected by Tregs in vitro and in vivo analysis (asthma, melanoma model). Hence, Tregs represent very effective inhibitors of Th9 development whereas they have only a minimal suppressive influence on differentiated Th9 cells.rn

Physiologische Untersuchungen an der St��bchenbahn der Nagerretina

AII Amakrinzellen sind Interneurone in der Retina und ein wichtiges Element der St��bchenbahn von S��ugetieren. Bei ihren Antworten auf Lichtreize generieren sie Aktionspotentiale, obwohl die ihnen vor- und nachgeschalteten Bipolarzellen graduierte Membranpotentiale aufweisen. Um die Verarbeitung der Lichtsignale in der St��bchenbahn der S��uger besser zu verstehen wurden in der vorliegenden Arbeit Membranstr��me von AII Amakrinzellen und Ver��nderungen der intrazellul��ren Kalziumkonzentration mittels Indikatorfarbstoffe bei M��usen simultan gemessen.Die spannungsabh��ngigen Kalziumkan��le waren durch eine negative Aktivierungsschwelle und eine sehr langsame Inaktivierung gekennzeichnet�� ausserdem wurden sie von Dihydropyridinen (Agonisten und Antagonisten) moduliert. Sie fanden sich vor allem auf den keulenf��rmigen Forts��tzen von AII Amakrinzellen. Lokale Applikationen von Glutamat, AMPA oder Kainat l��sten einw��rtsgerichtete Str��me aus. Diese Str��me gingen einher mit einer Erh��hung der Fluoreszenz und zwar vor allem in den distalen Dendriten. NMDA l��ste keine Ver��nderung der Kalziumkonzentration aus und nur in wenigen F��llen Str��me (7 von 23).Diese Befunde deuten darauf hin, dass es sich bei den ionotropen Glutamat-Rezeptoren auf AII Amakrinzellen um solche vom AMPA Typ handelt. Diese befinden sich, sofern sie kalziumpermeabel sind (oder durch andere Mechanismen zu einer Erh��hung der [Ca2+]i f��hren) auf den distalen Dendriten nahe der Ganglienzellschicht.

Uptake mechanism, intracellular trafficking and endo-lysosomal pH monitoring of polystyrene nanoparticles

What is the intracellular fate of nanoparticles (NPs) taken up by the cells? This question has been investigated for polystyrene NPs of different sizes with a set of molecular biological and biophysical techniques.rnTwo sets of fluorescent NPs, cationic and non-ionic, were synthesized with three different polymerization techniques. Non-ionic particles (132 ��� 846 nm) were synthesized with dispersion polymerization in an ethanol/water solution. Cationic NPs with 120 nm were synthesized by miniemulsion polymerization Particles with 208, 267 and 603 nm were produced by seeding the 120 nm particle obtained by miniemulsion polymerization with drop-wise added monomer and polymerization of such. The colloidal characterization of all particles showed a comparable amount of the surface groups. In addition, particles were characterized with regard to their size, morphology, solid content, amount of incorporated fluorescent dye and zeta potential. The fluorescent intensities of all particles were measured by fluorescence spectroscopy for calibration in further cellular experiments. rnThe uptake of the NPs to HeLa cells after 1 ��� 24 h revealed a much higher uptake of cationic NPs in comparison to non-ionic NPs. If the same amount of NPs with different sizes is introduced to the cell, a different amount of particles is present in the cell medium, which complicates a comparison of the uptake. The same conclusion is valid for the particles��� overall surface area. Therefore, HeLa cells were incubated with the same concentration, amount and surface area of NPs. It was found that with the same concentration always the same polymer amount is taking up by cells. However, the amount of particles taken up decreases for the biggest. A correlation to the surface area could not be found. We conclude that particles are endocytosed by an excavator-shovel like mechanism, which does not distinguish between different sizes, but is only dependent on the volume that is taken up. For the decreased amount of large particles, an overload of this mechanism was assumed, which leads to a decrease in the uptake. rnThe participation of specific endocytotic processes has been determined by the use of pharmacological inhibitors, immunocytological staining and immunofluorescence. The uptake of NPs into the endo-lysosomal machinery is dominated by a caveolin-mediated endocytosis. Other pathways, which include macropinocytosis and a dynamin-dependent mechanism but exclude clathrin mediated endocytosis, also occur as competing processes. All particles can be found to some extent in early endosomes, but only bigger particles were proven to localize in late endosomes. No particles were found in lysosomes; at least not in lysosomes that are labeled with Lamp1 and cathepsin D. However, based on the character of the performed experiment, a localization of particles in lysosomes cannot be excluded.rnDuring their ripening process, vesicles undergo a gradual acidification from early over late endosomes to lysosomes. It is hypothesized that NPs in endo-lysosomal compartments experience the same change in pH value. To probe the environmental pH of NPs after endocytosis, the pH-sensitive dye SNARF-4F was grafted onto amino functionalized polystyrene NPs. The pH value is a ratio function of the two emission wavelengths of the protonated and deprotonated form of the dye and is hence independent of concentration changes. The particles were synthesized by the aforementioned miniemulsion polymerization with the addition of the amino functionalized copolymer AEMH. The immobilization of SNARF-4F was performed by an EDC-coupling reaction. The amount of physically adsorbed dye in comparison to covalently bonded dye was 15% as determined by precipitation of the NPs in methanol, which is a very good solvent for SNARF-4F. To determine influences of cellular proteins on the fluorescence properties, a intracellular calibration fit was established with platereader measurements and cLSM imaging by the cell-penetrable SNARF-4F AM ester. Ionophores equilibrated the extracellular and intracellular pH.rnSNARF-4F NPs were taken up well by HeLa cells and showed no toxic effects. The pH environment of SNARF-4F NPs has been qualitatively imaged as a movie over a time period up to 1 h in pseudo-colors by a self-written automated batch program. Quantification revealed an acidification process until pH value of 4.5 over 24 h, which is much slower than the transport of nutrients to lysosomes. NPs are present in early endosomes after min. 1 h, in late endosomes at approx. 8 h and end up in vesicles with a pH value typical for lysosomes after > 24 h. We therefore assume that NPs bear a unique endocytotic mechanism, at least with regards to the kinetic involvedrn