Effect of drug physicochemical properties on the release from liposomal systems in vitro and in vivo

Liposomes were discovered about 40 years ago by A. Bangham and since then they became very versatile tools in biology, biochemistry and medicine. Liposomes are the smallest artificial vesicles of spherical shape that can be produced from natural untoxic phospholipids and cholesterol. Liposome vesicles can be used as drug carriers and become loaded with a great variety of molecules, such as small drug molecules, proteins, nucleotides and even plasmids. Due to the variability of liposomal compositions they can be used for a large number of applications. In this thesis the β-adrenoceptor antagonists propranolol, metoprolol, atenolol and pindolol, glucose, 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) and Er-DTPA were used for encapsulation in liposomes, characterization and in vitro release studies. Multilamellar vesicles (MLV), large unilamellar vesicles (LUV) and smaller unilamellar vesicles (SUV) were prepared using one of the following lipids: 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), Phospholipone 90H (Ph90H) or a mixture of DSPC and DMPC (1:1). The freeze thawing method was used for preparation of liposomes because it has three advantages (1) avoiding the use of chloroform, which is used in other methods and causes toxicity (2) it is a simple method and (3) it gives high entrapping efficiency. The percentage of entrapping efficiencies (EE) was different depending on the type and phase transition temperature (Tc) of the lipid used. The average particle size and particle size distribution of the prepared liposomes were determined using both dynamic light scattering (DLS) and laser diffraction analyzer (LDA). The average particle size of the prepared liposomes differs according to both liposomal type and lipid type. Dispersion and dialysis techniques were used for the study of the in vitro release of β-adrenoceptor antagonists. The in vitro release rate of β-adrenoceptor antagonists was increased from MLV to LUV to SUV. Regarding the lipid type, β-adrenoceptor antagonists exhibited different in vitro release pattern from one lipid to another. Two different concentrations (50 and 100mg/ml) of Ph90H were used for studying the effect of lipid concentration on the in vitro release of β-adrenoceptor antagonists. It was found that liposomes made from 50 mg/ml Ph90H exhibited higher release rates than liposomes made at 100 mg/ml Ph90H. Also glucose was encapsulated in MLV, LUV and SUV using 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), Phospholipone 90H (Ph90H), soybean lipid (Syb) or a mixture of DSPC and DMPC (1:1). The average particle size and size distribution were determined using laser diffraction analysis. It was found that both EE and average particle size differ depending on both lipid and liposomal types. The in vitro release of glucose from different types of liposomes was performed using a dispersion method. It was found that the in vitro release of glucose from different liposomes is dependent on the lipid type. 18F-FDG was encapsulated in MLV 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), Phospholipone 90H (Ph90H), soybean lipid (Syb) or a mixture of DSPC and DMPC (1:1). FDG-containing LUV and SUV were prepared using Ph90H lipid. The in vitro release of FDG from the different types of lipids was accomplished using a dispersion method. Results similar to that of glucose release were obtained. In vivo imaging of FDG in both uncapsulated FDG and FDG-containing MLV was performed in the brain and the whole body of rats using PET scanner. It was found that the release of FDG from FDG-containing MLV was sustained. In vitro-In vivo correlation was studied using the in vitro release data of FDG from liposomes and in vivo absorption data of FDG from injected liposomes using microPET. Erbium, which is a lanthanide metal, was used as a chelate with DTPA for encapsulation in SUV liposomes for the indirect radiation therapy of cancer. The liposomes were prepared using three different concentrations of soybean lipid (30, 50 and 70 mg/ml). The stability of Er-DTPA SUV liposomes was carried out by storage of the prepared liposomes at three different temperatures (4, 25 and 37 °C). It was found that the release of Er-DTPA complex is temperature dependent, the higher the temperature, the higher the release. There was an inverse relationship between the release of the Er-DTPA complex and the concentration of lipid.

Solubility and permeability as in vitro predictors for in vivo performance of fenofibrate IR solid dosage forms

This current work focused on the simulation of in vivo dissolution and permeation in order to be able to predict the in vivo performance of orally administered fenofibrate immediate release formulations. Therefore, the effects of the formulation surfactants on in vivo solubility and permeation of fenofibrate under physiologically relevant excipient concentrations were emphasized.rnIt was shown that the surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS) may decrease rather than increase the solubility of fenofibrate in vivo. This was related to the interference of SDS with the vesicular system of the biorelevant medium, FaSSIFmod, and therefore its solubilization capacity. rnMoreover, in vitro permeation studies revealed that SDS concentrations inversely correlated with fenofibrate permeability. Through combination of the observed permeation and solubility data a good in vitro/in vivo correlation regarding Cmax values in humans could be established for five fenofibrate formulations which were based on the same manufacturing technique.rnBesides the experimental part, the major characteristics and their potential implementation in a dissolution/permeation device were discussed based on the promising realization of the in vitro solubility and permeation methods. rn

Entwicklung eines pharmakologischen Modells zur Prüfung immuntherapeutischer Antikörper mit dreidimensionalen Tumorzellkulturen in vitro

In den letzten Jahren hat die Tumorbehandlung mit immunologischen Präparaten an Bedeutung gewonnen. Der allgemeine Ablauf der Testung eines Arzneimittelkandidaten sieht vor, zunächst in Zellkulturversuchen und Tierversuchen Wirkweise und Sicherheit, sowie voraussichtliche Abbauwege und mögliche Gefahren so beurteilen zu können, dass sie für einen Einsatz im Menschen in Frage kommen. Zur präklinischen in vitro-Testung werden dabei in der Regel Monolayer-Zellkulturen oder Einzelzellsuspensionen eingesetzt. Der Einsatz von 3D-Zellkulturmodellen, welche den Aufbau von Mikrometastasen oder intervaskuläre Areale in Tumoren exakter widerspiegeln, führt zu wesentlich besseren Voraussagen bezüglich der klinischen Wirksamkeit neuer Präparate. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung eines neuen 3D-Zellkulturbasierten Systems zur Testung trifunktionaler bispezifischer Antikörper für die Tumorbehandlung, welches sich auch auf andere vergleichbare Präparate übertragen lässt.rnIn meiner Arbeit konnte ich mehrere humane Tumorzelllinien definieren, mit denen es gelang, stabile Co-Kulturen von Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) mit Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturisierten Spinner-Flaschen zu etablieren. Spinner-Flaschen, in denen die im Kulturmedium befindlichen Immunzellen, MCTS und Therapeutika ständig frei zirkulieren, sind besonders für eine wirklichkeitsnahe Nachbildung der in vivo-Simulation mit disseminierten Tumorzellen oder mit malignem Aszites geeignet. Diese Art der Kultivierung erlaubte Beobachtungszeiten von ≥20 Tagen für eine große Bandbreite Analysemethoden. Zu den mit dem erstellten Protokoll standardmäßig durchführbaren Analysemethoden zählen unter anderem immunhistochemische Färbungen an Sphäroid-Gefrierschnitten, Vitalitätstest, Untersuchung der Plattierungs-Effizienz, Bestimmung der Sphäroidvolumina, Zytokinbestimmungen aus dem Medienüberstand mit Cytokine Bead Arrays, PCR-Analysen immunzellspezifischer Antigene, sowie durchflusszytometrische Analysen. Diese Methodenkombination erlaubt einen sehr detaillierten Einblick in die Wirkweise und Effizienz neuer Immuntherapeutika aus verschiedensten Blickwinkeln und stellt ein reproduzierbares Testsystem zur präklinischen Testung von Immuntherapeutika dar, das zukünftig als Bindeglied zwischen Monolayer-Zellkulturen und klinischen Prüfungen einen festen Platz einnehmen könnte.rnMit dem beschriebenen 3D-Zellkultur-System wurden in der vorliegenden Arbeit die trifunktionalen bispezifischen Antikörper catumaxomab (unter dem Handelsnamen Removab® für die Behandlung maligner Ascites zugelassen) und ertumaxomab (derzeit in klinischen Prüfungen) hinsichtlich ihrer Wirkweise untersucht. Die Antikörper besitzen im Gegensatz zu herkömmlichen monoklonalen Antikörpern zwei verschiedene Bindungsarme, einer gegen CD3 auf T-Zellen, der zweite gegen EpCAM respektive Her2/neu - beides weit verbreitete Tumorantigene - gerichtet. An ihrem Fc-Teil besitzen sie eine dritte Bindungskapazität, über welche sie an Fcγ RI, -IIa und -III positive akzessorische Zellen binden. Diese Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T-Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Dies stellt eine wirkungsvolle Therapieoption unter Ausnutzung der körpereigenen, immunologischen Abwehr dar. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass beide Antikörper eine Größenreduktion der Sphäroide mit den entsprechenden Tumorantigenen in gleichem Maße bewirkten und die Plattierungseffizienz durch ertumaxomab dosisabhängig reduziert wurde. Mit dem erstellten Testsystem konnte der Wirkmechanismus von catumaxomab auf Sphäroide der Zelllinie FaDu (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) detaillierter gezeigt werden: catumaxomab wirkte dosisabhängig auf die Reduktion der Sphäroidvolumina und die zunehmende Infiltration von CD45+ Zellen, die als T-, NK- und/oder dendritische Zellen identifiziert wurden. Des Weiteren rief die catumaxomab-Gabe eine verstärkte Ausschüttung der Zytokine IL-2, IFN-γ und TNF-α hervor. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass catumaxomab die zelluläre Immunantwort aktiviert.rnDie Standard-Tumorbehandlung beinhaltet die Gabe von Chemotherapeutika. Oft werden dafür Zytostatika mit dem unerwünschten Nebeneffekt auch gesunde proliferierende Zellen anzugreifen verwendet. Dies kann prinzipiell auch die Wirksamkeit der Antikörper-Therapie beeinflussen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zusätzlich vergleichende Kombinations-Versuche mit catumaxomab und einem gängigen Zytostatikum - Cisplatin - durchgeführt. Mit Untersuchungen der Sphäroidvolumina, Vitalitätstests und Plattierungseffizienz konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von catumaxomab bei gleichzeitiger Anwendung beider Therapeutika aufrecht erhalten bleibt und diese sogar additiv verstärkt wird. Eine Kombinationstherapie im Menschen ist daher denkbar.rnrn

In-vitro-Studien zur Generierung bi-spezifischer T-Zellen durch T-Zell-Antigenrezeptor-Gentransfer

In der Dissertation konnte gezeigt werden, dass von einem pp65(495-503)-spezifischen Doppelketten-TZR (2-Plasmide-retrovirales Vektorsystem) ein Potential der Fremdinteraktion mit spezifitätsfremden humanen gp100(280-288)- und AML(14-22)- sowie murinen MDM2(81-88)- und p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen TZRa und -b Ketten besteht. Folglich zeichneten sich essentielle Optimierungsverfahren ab. Für die Generierung von bi-spezifischen T-Zellenrnwurden zwei Strategien etabliert. Das erste Verfahren hatte zur Voraussetzung, dass der Donor und Rezipient einen HCMV-seropositiven Status aufweisen würden. Es ließen sich pp65(495-503)-spezifische T-Zellen aus HCMV-seropositiven Blutproben expandieren, die eine effiziente pp65(495-503)-Spezifität charakterisierte. In der zweiten Strategie wurde die Situation behandelt, dass der Donor HCMV-seronegativ und der Rezipient HCMV-seropositiv wären.rnHierbei wurde das Verfahren der simultanen Kotransfektion mit einem pp65(495-503)- und p53(264-272)-spezifischen TZR etabliert. Bei der Verwendung beider Strategien konnten effizient p53(264-272)-Tumorantigen und pp65(495-503)-bi-spezifische T-Zellen generiert werden.rnHinzukommend konnte der Einfluss einer möglichen Kompetition um CD3 undrnFehlinteraktion mit den endogenen TZRa und -b Ketten dargelegt werden. Des Weiteren erfolgten Interaktionsanalysen mit einem p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR. Die Analysen erfolgten sowohl unter nicht-kompetitiven Bedingungen in der humanen Jurkat-76 Zelllinie, welche den genomischen Verlust von endogenen TZRa und -b Ketten kennzeichnete, als auch unter kompetitiven Bedingungen in den humanen T-Zellen, die endogene TZRa und -b Ketten besitzen. In dem 2-Plasmide-retroviralen Vektorsystem konnte gezeigt werden, dass unter nicht-kompetitiven Bedingungen der p53(264-272)- Tumorantigen-spezifische Einzelketten-TZR in erhöhtem Maße mit der murinen MDM2(81-88)-sowie homologen p53(264-272)- als auch mit den humanen TZRa Ketten der Spezifitäten AML(14-22), gp100(280-288) und pp65(495-503) (Vb3-Analyse) interagieren konnte. Interessanterweise zeigte sich im 1-Plasmid-retroviralen Vektorsystem ein geringeres Interaktionsverhalten mit murinen und vor allem humanen TZRa Ketten. Das Interaktionspotential schien TZR Subfamilien-abhängig zu sein. Essentiell war es, dass der p53(264-272)-Tumorantigenspezifische Einzelketten-TZR eines 1-Plasmid-retroviralen Vektorsystems, trotz minimaler Beeinflussungen, stets an der Zelloberfläche exprimiert werden konnte und sich kein vollständiger Verlust der p53(264-272)-Spezifität verzeichnen ließ. Aufgrund der Verdrängung der Va-Domäne des p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR durch eine Volllängen-TZRa-Kette, erfolgte die Optimierung der Va/Vb-Interaktion des Einzelketten-TZR (1-Plasmid-retrovirales Vektorsystem). Es konnte ein neuartiger p53(264-272)-Tumorantigenspezifischer Einzelketten-TZR mit einer zusätzlichen künstlichen Disulfidbrücke zwischen Va(Q51C) und dem C-terminalen Ende des SL7-Linkers (G16C) generiert werden. Dieser Einzelketten-TZR zeigte im Vergleich zum Ausgangskonstrukt eine stärkere Va/Vb-Bindung, ausgelesen an einer effizienten Reduktion der residuellen Kettenfehlinteraktion, sowie eine effiziente TZR-Expression und Funktionalität, als auch eine vergleichbare TZR-MHC:Peptid-Affinität. Zusammenfassend konnten pp65(465-503)- und p53(264-272)-Tumorantigen-bi-spezifische T-Zellen generiert werden, die eine effiziente duale Spezifität aufwiesen. Auch konnte detailliert das Interaktionsverhalten eines p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR mit spezifitätsfremden TZRa Ketten dargelegt sowie eine Optimierung eines p53(264-272)-Tumorantigen-spezifischen Einzelketten-TZR (1-Plasmid-retrovirales Vektorsystem) erzielt werden.

Etablierung eines high content imaging-basierten in vitro Testsystems zur Evaluierung genotoxischer Substanzen

Zur Registrierung von Pharmazeutika ist eine umfassende Analyse ihres genotoxischen Potentials von Nöten. Aufgrund der Vielzahl genotoxischer Mechanismen und deren resultierenden Schäden wird ein gestaffeltes Testdesign durch die ICH-Richtlinie S2(R1) „Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use S2(R1)“ definiert, um alle genotoxischen Substanzen zu identifizieren. Die Standardtestbatterie ist in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung aufgrund des geringen Durchsatzes und des Mangels an verfügbarer Substanzmenge vermindert anwendbar. Darüber hinaus verfügen in vitro Genotoxizitätstests in Säugerzellen über eine relativ geringe Spezifität. Für eine vollständige Sicherheitsbeurteilung wird eine in vivo Testung auf Kanzerogenität benötigt. Allerdings sind diese Testsysteme kosten- und zeitintensiv. Aufgrund dessen zielen neue Forschungsansätze auf die Verbesserung der Prädiktivität und die Erfassung des genotoxischen Potentials bereits in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung ab. Die high content imaging (HCI)-Technologie offeriert einen Ansatz zur Verbesserung des Durchsatzes verglichen mit der Standardtestbatterie. Zusätzlich hat ein Zell-basiertes Modell den Vorteil Daten relativ schnell bei gleichzeitig geringem Bedarf an Substanzmenge zu generieren. Demzufolge ermöglichen HCI-basierte Testsysteme eine Prüfung in der frühen Phase der pharmazeutischen Arzneimittelentwicklung. Das Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines neuen, spezifischen und sensitiven HCI-basierten Testsytems für Genotoxine und Progenotoxine in vitro unter Verwendung von HepG2-Zellen gewesen. Aufgrund ihrer begrenzten metabolischen Kapazität wurde ein kombiniertes System bestehend aus HepG2-Zellen und einem metabolischen Aktivierungssystem zur Testung progenotoxischer Substanzen etabliert. Basierend auf einer vorherigen Genomexpressionsprofilierung (Boehme et al., 2011) und einer Literaturrecherche wurden die folgenden neun unterschiedlichen Proteine der DNA-Schadensantwort als putative Marker der Substanz-induzierten Genotoxizität ausgewählt: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) p-ATM (Ser1981), p-ATR (Ser428), p-CDC2 (Thr14/Tyr15), GADD45A und p-Chk2 (Thr68). Die Expression bzw. Aktivierung dieser Proteine wurde 48 h nach Behandlung mit den (pro-) genotoxischen Substanzen (Cyclophosphamid, 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen, Aflatoxin B1, 2-Acetylaminofluoren, Methylmethansulfonat, Actinomycin D, Etoposid) und den nicht-genotoxischen Substanzen (D-Mannitol, Phenforminhydrochlorid, Progesteron) unter Verwendung der HCI-Technologie ermittelt. Die beste Klassifizierung wurde bei Verwendung der folgenden fünf der ursprünglichen neun putativen Markerproteine erreicht: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) und p-ATM (Ser1981). In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurden die fünf ausgewählten Proteine mit Substanzen, welche von dem European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) zur Beurteilung der Leistung neuer oder modifizierter in vitro Genotoxizitätstests empfohlen sind, getestet. Dieses neue Testsystem erzielte eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 86 %, was in einer Prädiktivität von 84 % resultierte. Der synergetische Effekt dieser fünf Proteine ermöglicht die Identifizierung von genotoxischen Substanzen, welche DNA-Schädigungen durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Mechanismen induzieren, mit einem hohen Erfolg. Zusammenfassend konnte ein hochprädiktives Prüfungssystem mit metabolischer Aktivierung für ein breites Spektrum potenziell genotoxischer Substanzen generiert werden, welches sich aufgrund des hohen Durchsatzes, des geringen Zeitaufwandes und der geringen Menge benötigter Substanz zur Substanzpriorisierung und -selektion in der Phase der Leitstrukturoptimierung eignet und darüber hinaus mechanistische Hinweise auf die genotoxische Wirkung der Testsubstanz liefert.

Genexpressionsanalyse boviner mesenchymaler Stammzellen und deren in-vitro-differenzierten Folgelinien

Mesenchymale Stamzellen (MSC) sind Vertreter der adulten Stammzellen. Sie bergen durch ihre große Plastizität ein immenses Potential für die klinische Nutzung in Form von Stammzelltherapien. Zellen dieses Typs kommen vornehmlich im Knochenmark der großen Röhrenknochen vor und können zu Knochen, Knorpel und Fettzellen differenzieren. MSC leisten einen wichtigen Beitrag im Rahmen regenerativer Prozesse, beispielsweise zur Heilung von Frakturen. Breite Studien demonstrieren bereits jetzt auch bei komplexeren Erkrankungen (z.B. Osteoporose) therapeutisch vielversprechende Einsatzmöglichkeiten. Oft kommen hierbei aus MSC gezielt differenzierte Folgelinien aus Zellkulturen zum Einsatz. Dies bedingt eine kontrollierte Steuerung der Differenzierungsprozesse in vitro. Der Differenzierung einer Stammzelle liegt eine komplexe Veränderung ihrer Genexpression zugrunde. Genexpressionsmuster zur Erhaltung und Proliferation der Stammzellen müssen durch solche, die der linienspezifischen Differenzierung dienen, ersetzt werden. Die mit der Differenzierung einhergehende, transkriptomische Neuausrichtung ist für das Verständnis der Prozesse grundlegend und wurde bislang nur unzureichend untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine transkriptomweite und vergleichende Genexpressionsanalyse Mesenchymaler Stammzellen und deren in vitro differenzierten Folgelinien mittels Plasmid - DNA Microarrays und Sequenziertechniken der nächsten Generation (RNA-Seq, Illumina Plattform). In dieser Arbeit diente das Hausrind (Bos taurus) als Modellorganismus, da es genetisch betrachtet eine hohe Ähnlichkeit zum Menschen aufweist und Knochenmark als Quelle von MSC gut verfügbar ist. Primärkulturen Mesenchymaler Stammzellen konnten aus dem Knochenmark von Rindern erfolgreich isoliert werden. Es wurden in vitro Zellkultur - Versuche durchgeführt, um die Zellen zu Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zu differenzieren. Zur Genexpressionsanalyse wurde RNA aus jungen MSC und einer MSC Langzeitkultur („alte MSC“), sowie aus den differenzierten Zelllinien isoliert und für nachfolgende Experimente wo nötig amplifiziert. Der Erfolg der Differenzierungen konnte anhand der Genexpression von spezifischen Markergenen und mittels histologischer Färbungen belegt werden. Hierbei zeigte sich die Differenzierung zu Osteoblasten und Adipozyten erfolgreich, während die Differenzierung zu Chondrozyten trotz diverser Modifikationen am Protokoll nicht erfolgreich durchgeführt werden konnte. Eine vergleichende Hybridisierung zur Bestimmung differentieller Genexpression (MSC vs. Differenzierung) mittels selbst hergestellter Plasmid - DNA Microarrays ergab für die Osteogenese mit Genen wie destrin und enpp1, für die undifferenzierten MSC mit dem Gen sema3c neue Kandidatengene, deren biologische Funktion aufzuklären in zukünftigen Experimenten vielversprechende Ergebnisse liefern sollte. Die Analyse der transkriptomweiten Genexpression mittels NGS lieferte einen noch umfangreicheren Einblick ins Differenzierungsgeschehen. Es zeigte sich eine hohe Ähnlichkeit im Expressionsprofil von jungen MSC und Adipozyten, sowie zwischen den Profilen der alten MSC (eine Langzeitkultur) und Osteoblasten. Die alten MSC wiesen deutliche Anzeichen für eine spontane Differenzierung in die osteogene Richtung auf. Durch Analyse der 100 am stärksten exprimierten Gene jeder Zelllinie ließen sich für junge MSC und Adipozyten besonders Gene der extrazellulären Matrix (z.B col1a1,6 ; fn1 uvm.) auffinden. Sowohl Osteoblasten, als auch die alten MSC exprimieren hingegen verstärkt Gene mit Bezug zur oxidativen Phosphorylierung, sowie ribosomale Proteine. Eine Betrachtung der differentiellen Genexpression (junge MSC vs. Differenzierung) mit anschließender Pathway Analyse und Genontologie Anreicherungsstatistik unterstützt diese Ergebnisse vor allem bei Osteoblasten, wo nun jedoch zusätzlich auch Gene zur Regulation der Knochenentwicklung und Mineralisierung in den Vordergrund treten. Für Adipozyten konnte mit Genen des „Jak-STAT signaling pathway“, der Fokalen Adhäsion, sowie Genen des „Cytokine-cytokine receptor interaction pathway“ sehr spannende Einsichten in die Biologie dieses Zelltyps erlangt werden, die sicher weiterer Untersuchungen bedürfen. In undifferenzierten MSC konnte durch differentielle Genexpressionsanalyse die Rolle des nicht kanonischen Teils des WNT Signalweges als für die Aufrechterhaltung des Stammzellstatus potentiell äußerst einflussreich ermittelt werden. Die hier diskutierten Ergebnisse zeigen beispielhaft, dass besonders mittels Genexpressionsanalyse im Hochdurchsatzverfahren wertvolle Einblicke in die komplexe Biologie der Stammzelldifferenzierung möglich sind. Als Grundlage für nachfolgende Arbeiten konnten interessante Gene ermittelt und Hypothesen zu deren Einfluss auf Stammzelleigenschaften und Differenzierungsprozesse aufgestellt werden. Um einen besseren Einblick in den Differenzierungsverlauf zu ermöglichen, könnten künftig NGS Analysen zu unterschiedlichen Differenzierungszeitpunkten durchgeführt werden. Zudem wären weitere Anstrengungen zur erfolgreichen Etablierung der chondrogenen Differenzierung zur vollständigen Analyse der Genexpression des trilinearen Differenzierungspotentials von MSC wünschenswert.