Isolation and identification of molecular partners of the proteins encoded by the Drosophila tumor suppressor gene lethal(2)tumorous imaginal discs

Ziel dieser Arbeit war es, die funktionelle Bedeutung des Drosophila melanogaster tumor suppressor Gens lethal(2)tumorous imaginal discs (l(2)tid) durch die Identifikation von molekularen Partnern der vom Gen kodierten Proteine zu etablieren. Mit dem Screening einer Expressionsbibliothek mittels des Hefe-Di-Hybrid-Systems wurde das Protein Patched (Ptc) als ein neues Tid-bindendes Protein identifiziert. Ptc ist ein Zentralregulator der Hedhehog-Signalkette. Diese ist in der Entwicklung konserviert und in manchen humanen Krebsarten verwickelt. Die Tid/Ptc-Interaktion wurde mittels unabhängigen biochemischen Methoden wie dem GST-pulldown-Test oder der Immunopräzipitation überprüft. Außerdem ergaben funktionelle Studien in tumorosen Imaginalscheiben einen möglichen inhibitorischen Effekt von Tid über die Hh Signaltransduktion.Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Tid und dem E-APC-Protein (Adenomatous polyposis coli) bewiesen. Polakis und seine Gruppe zeigten durch Studien mit dem Hefe-Di-Hybrid-System und in vitro, dass das hTid mit dem APC-Protein interagiert. Um dies auch auf Drosophila-Ebene zu überprüfen, wurden Immunopräzipitation-Studien mit den Drosophila-Gegenstücken durchgeführt. Diese Studien zeigen zum ersten Mal eine direkte Interaktion beider Proteine in vivo.

Molekulare Evolution der Intermediärfilament-Proteine des Flussneunauges Lampetra fluviatilis

Über cDNA-Banken und RT-PCR wurden erstmals 15 Intermediärfilament-Proteine (IF-Proteine) des Flussneunauges Lampetra fluviatilis (Agnatha, kieferlose Wirbeltiere) kloniert und sequenziert: drei Typ I-Keratine, vier Typ II-Keratine, fünf keratinartige IF-Proteine (drei Kγ, zwei Kα), die Typ III-Proteine Vimentin und Desmin sowie ein Typ IV-Neurofilament-Protein (NF).Die IF-Proteine wurden aus verschiedenen Organen isoliert und durch zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) aufgetrennt. Biochemische sowie massenspektrometrische Analysen anhand der 2D-PAGE ermöglichten in Kombination mit den Sequenzdaten die Identifizierung von Vimentin, Desmin sowie aller sequenzierten Keratine bis auf zwei der fünf Kα/Kγ-Proteine. Die meisten Keratine ließen sich darüber hinaus in die Kategorien „E“ (von „epidermal“) und „S“ (von „simple epithelial“) einteilen.Von den sequenzierten Keratinen ist das IIS-Keratin K8 wahrscheinlich ortholog zu den bekannten K8-Sequenzen höherer Vertebraten. Die Bezeichnung K18 für das einzige IS-Keratin des Neunauges in Anlehnung an das IS-Keratin K18 des Menschen basiert auf der stets beobachteten Koexpression mit K8 in einfachen Epithelien.Die Sequenz des Neunaugen-Vimentins zeigt große Übereinstimmungen mit den bekannten Desminsequenzen der Vertebraten. Die keratinartigen Proteine Kα und Kγ sind bis jetzt nur von Agnathen (Neunaugen und Schleimaale) bekannt.In molekularen Stammbäumen können K8, K18, Vimentin, Desmin und das NF_L des Neunauges gut als Außengruppe definiert werden.

Molekulare Untersuchung des Wolf-Hirschhorn-Syndroms

Das Wolf-Hirschhorn-Syndrom (WHS) ist ein komplexes und variables Fehlbildungs- Retardierungssyndrom, das durch Deletion in der distalen Chromosomenregion 4p16.3 hervorgerufen wird und dessen Ätiologie und Pathogenese bisher weitgehend unverstanden sind. Die Zielsetzung in der vorliegenden Arbeit bestand in der Identifizierung und vorläufigen Charakterisierung neuer Gene, die an der Entstehung des Syndroms beteiligt sein könnten. Die Wolf-Hirschhorn-Syndrom-kritische Region (WHSCR) konnte zu Beginn der vorliegenden Arbeit auf einen ca. 2 Mb großen Bereich zwischen den Markern D4S43 und D4S142 eingegrenzt werden. Für die Identifizierung neuer Gene wurden zunächst drei größere genomische Cosmid-/PAC-Contigs (I-III) im Bereich der Marker D4S114 bis D4S142 erstellt und mittels Exonamplifikation auf transkribierte Bereiche (Exons) untersucht. Es konnten insgesamt 67 putative 'Exons' isoliert werden, von denen einige bereits bekannten Genen (ZNF141, PDEB, MYL5, GAK, DAGK4 und FGFR3) entsprechen. Zwei dieser Gene konnten im Rahmen dieser Arbeit erstmals (DAGK4) bzw. genauer (GAK) in die distale Region 4p16.3 kartiert werden. Die restlichen Exons können aufgrund von Homologievergleichen und/oder EST-cDNA-Homologien vermutlich neuen Genen oder auch Pseudogenen (z. B. YWEE1hu) zugeordnet werden. Durch die im Verlaufe der vorliegenden Arbeit publizierte weitere Eingrenzung der WHSCR auf einen 165 Kb-großen Bereich proximal des FGFR3-Gens konzentrierten sich weitere Untersuchungen auf die detaillierte Analyse der WHSCR zwischen dem Marker D4S43 und FGFR3. Mit Hilfe von Exonamplifikation bzw. computergestützter Auswertung vorliegender Sequenzdaten aus diesem Bereich ('GRAIL', 'GENSCAN' und Homologievergleiche in den EST-Datenbanken des NCBI) konnten mehrere neue Gene identifiziert werden. In distaler-proximaler Reihenfolge handelt es sich dabei um die Gene LETM1, 51, 43, 45, 57 und POL4P. LETM1 kodiert für ein putatives Transmembran-Protein mit einem Leucin-Zipper- und zwei EF-Hand-Motiven und könnte aufgrund seiner möglichen Beteiligung an der Ca2+-Homeostase und/oder der Signal-transduktion zu Merkmalen des WHS (Krampfanfällen, mentale Retardierung und muskuläre Hypotonie) beitragen. Das Gen 51 entspricht einem in etwa zeitgleich durch Stec et al. (1998) und Chesi et al. (1998) als WHSC1 bzw. MMSET bezeichnetem Gen und wurde daher nicht weiter charakterisiert. Es wird genauso wie das Gen 43, das zeitgleich von Wright et al. (1999b) als WHSC2 beschrieben werden konnte und eine mögliche Rolle bei der Transkriptionselongation spielt, ubiquitär exprimiert. Das in der vorliegenden Arbeit identifizierte Gen 45 zeigt demgegenüber ein ausgesprochen spezifisches Expressionsmuster (in Nervenzellen des Gehirns sowie in Spermatiden). Dies stellt zusammen mit der strukturellen Ähnlichkeit des putativen Genprodukts zu Signalmolekülen einen interessanten Zusammenhang zu Merkmalen des WHS (beispielsweise Kryptorchismus, Uterusfehlbildungen oder auch neurologische Defekte) her. Demgegenüber handelt es sich bei dem Gen 57 möglicherweise um ein trunkiertes Pseudogen des eRFS-Gens auf Chromosom 6q24 (Wallrapp et al., 1998). Das POL4P-Gen schließlich stellt allein aufgrund seiner genomischen Lokalisation sowie seiner möglichen Funktion (als DNA-Polymerase-ähnliches Gen) kein gutes Kandidatengen für spezifische Merkmale des Syndroms dar und wurde daher nicht im Detail charakterisiert. Um die Beteiligung der Gene an der Ätiologie und Pathogenese des Syndroms zu verstehen, ist die Entwicklung eines Mausmodells (über das Einfügen gezielter Deletionen in das Mausgenom) geplant. Um dies zu ermöglichen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Charakterisierung der orthologen Region bei der Maus vorgenommen. Zunächst wurden die orthologen Gene der Maus (Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p) identifiziert. Durch die Erstellung sowie die genaue Kartierung eines murinen genomischen P1/PAC-Klon-Contigs konnte gezeigt werden, daß die murinen Gene Fgfr3, Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p sowie einige weitere der überprüften EST-cDNA-Klone der Maus in einem durchgehenden Syntänieblock zwischen Mensch (POL4P bis FGFR3) und Maus (Mmu 5.20) enthalten sind, der in seiner genomischen Ausdehnung in etwa den Verhältnissen beim Menschen (zwischen POL4P und FGFR3) entspricht.

Domänen des Kapsidproteins L2 humanpathogener Papillomviren für die Interaktion mit viralen und zellulären Bindungspartnern

Die Kapsidproteine L1 und L2 von humanen Papillomviren (HPV) werden im Cytoplasma infizierter Keratinocyten synthetisiert und gelangen unabhängig voneinander in den Kern (Florin et al. 2002b). L2 lokalisiert in speziellen Kerndomänen, sog. ND10, und induziert die Reorganisation dieser Kernstrukturen: L2-abhängig akkumuliert der transkriptionelle Modulator Daxx verstärkt in ND10 und außerdem kommt es zum Ausschluss des transkriptionellen Aktivators Sp100 aus diesen Domänen (Florin et al. 2002a). Im Anschluss an diese Umorganisation im Kern induziert L2 die Lokalisation des Kapsidproteins L1 in ND10 (Florin et al. 2002b). Da auch die Replikation und Transkription von Papillomviren in oder in unmittelbarer Nähe von ND10 stattfinden, werden ND10 als Orte der Papillomvirus-Morphogenese diskutiert (Swindle et al. 1999). Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass L1 und L2 im Cytoplasma der Zellen mit Chaperonen interagieren, und dass der Kerntransport von L2 von der L2/Hsc70-Assoziation abhängig ist. Hsc70, das mit dem C-Terminus von L2 assoziiert ist, wird in virusähnliche Partikel (VLPs) eingebaut. Erst durch die Verpackung von DNA in die Kapside kommt es zum Ausschluss von Hsc70 aus dem Papillomvirus-Kapsid. Ergebnisse dieser Arbeit lassen zudem vermuten, dass L2 über seinen C-Terminus mit Mikrotubuli interagieren kann, falls diese Aminosäure-Region in L2 nicht durch das Chaperon maskiert wird. Mit Hilfe dieser Erkenntnisse wurde eine Modellvorstellung für die Rolle von L2 während der Infektion und der Morphogenese von HPV entwickelt. Die ND10-Lokalisationsdomäne (NDLD) in L2 konnte wie bei keinem Protein zuvor auf eine sehr kurze Sequenz von 22 Aminosäuren eingeengt werden. Welcher Mechanismus für die ND10-Lokalisation verantwortlich ist, muss dagegen noch geklärt werden. Alle L2-Mutanten, die ND10-Lokalisation zeigen, induzieren auch die Reorganisation dieser Domänen. Dies spricht dafür, dass L2 direkt in ND10 die Veränderungen hervorruft und wahrscheinlich keine zusätzlichen Domänen in L2 daran beteiligt sind. Es konnten zwei L1-Interaktionsdomänen in L2 kartiert werden. Diese beiden Regionen in L2 konnten nicht genauer lokalisiert werden und umfassen möglicherweise mehrere L1-Interaktionsdomänen. Der Einbau von L2 in die Kapside kann nur im Kern infizierter Zellen stattfinden. Hierfür ist die Lokalisation der Kapsidproteine in ND10 nicht notwendig. Weiterführende Versuche müssen jedoch noch klären, inwieweit ND10 trotzdem unerlässlich für eine produktive Morphogenese sind. Zudem wurde klar, dass die ersten 150 Aminosäuren im L2-Protein für das L1/L2-Verhältnis in Kapsiden verantwortlich sind. In Virionen beträgt dieses Verhältnis 30:1, d. h. zwölf L2-Moleküle werden in die Partikel aus 360 L1-Molekülen eingebaut. Bei der Verwendung der Deletionsmutante L2-150/467 beträgt dieses Verhältnis 5:1. Weitere Analysen, welche Regionen von L1 und L2 miteinander interagieren und wodurch die Beschränkung des L1/L2-Verhältnisses in Papillomviren zustande kommt, können genauere Einblicke in den Aufbau der Kapside und speziell die Lage von L2 im Kapsid liefern.

Untersuchung der Pigment- und Proteinzusammensetzung der peripheren Lichtsammelantenne des Photosystem I

Die Lichtsammelantenne des PSI (LHCI) ist hinsichtlich ihrer Protein- und Pigmentzusammensetzung weniger gut untersucht als die des PSII. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb zunächst die Isolation von nativen LHCI-Subkomplexen optimiert und deren Pigmentzusammensetzung untersucht. Zusätzlich wurde die Pigmentbindung analysiert sowie das Pigment/Protein-Verhältnis bestimmt. Die Analyse der Proteinzusammensetzung des LHCI erfolgte mittels einer Kombination aus ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese mit Westernblotanalysen mit Lhca-Protein-spezifischen Antikörpern und massenspektrometrischen Untersuchungen. Dabei stellte sich heraus, dass der LHCI mehr Proteine bzw. Proteinisoformen enthält als bisher vermutet. So gelang durch die massenspektrometrischen Untersuchungen die Identifizierung zweier bisher noch nicht nachgewiesener Lhca-Proteine. Bei diesen handelt es sich um eine Isoform des Lhca4 und ein zusätzliches Lhca-Protein, das Tomaten-Homolog des Lhca5 von Arabidopsis thaliana. Außerdem wurden in 1D-Gelen Isoformen von Lhca-Proteinen mit unterschiedlichem elektrophoretischen Verhalten beobachtet. In 2D-Gelen trat zusätzlich eine große Anzahl an Isoformen mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten auf. Es ist zu vermuten, dass zumindest ein Teil dieser Isoformen physiologischen Ursprungs ist, und z.B. durch differentielle Prozessierung oder posttranslationale Modifikationen verursacht wird, wenn auch die Spotvielfalt in 2D-Gelen wohl eher auf die Probenaufbereitung zurückzuführen ist. Mittels in vitro-Rekonstitution mit anschließenden biochemischen Untersuchungen und Fluoreszenzmessungen wurde nachgewiesen, dass Lhca5 ein funktioneller LHC mit spezifischen Pigmentbindungseigenschaften ist. Außerdem zeigten in vitro-Dimerisierungsexperimente eine Interaktion zwischen Lhca1 und Lhca5, wodurch dessen Zugehörigkeit zur Antenne des PSI gestützt wird. In vitro-Dimerisierungsexperimente mit Lhca2 und Lhca3 führten dagegen nicht zur Bildung von Dimeren. Dies zeigt, dass die Interaktion in potentiellen Homo- oder Heterodimeren aus Lhca2 und/oder Lhca3 schwächer ist als die zwischen Lhca1 und Lhca4 oder Lhca5. Die beobachtete Proteinheterogenität deutet daraufhin, dass die Antenne des PSI eine komplexere Zusammensetzung hat als bisher angenommen. Für die Integration „neuer“ LHC in den PSI-LHCI-Holokomplex werden zwei Modelle vorgeschlagen: geht man von einer festen Anzahl von LHCI-Monomeren aus, so kann sie durch den Austausch einzelner LHC-Monomere erreicht werden. Als zweites Szenario ist die Bindung zusätzlicher LHC vorstellbar, die entweder indirekt über bereits vorhandene LHC oder direkt über PSI-Kernuntereinheiten mit dem PSI interagieren. In Hinblick auf die Pigmentbindung der nativen LHCI-Subfraktionen konnte gezeigt werden, dass sie Pigmente in einer spezifischen Stöchiometrie und Anzahl binden, und sich vom LHCIIb vor allem durch eine verstärkte Bindung von Chlorophyll a, eine geringere Anzahl von Carotinoiden und die Bindung von ß-Carotin an Stelle von Neoxanthin unterscheiden. Der Vergleich von nativem LHCI mit rekonstituierten Lhca-Proteinen ergab, dass Lhca-Proteine Pigmente in einer spezifischen Stöchiometrie binden, und dass sie Carotinoidbindungsstellen mit flexiblen Bindungseigenschaften besitzen. Auch über die Umwandlung des an die einzelnen Lhca-Proteine gebundenen Violaxanthins (Vio) im Xanthophyllzyklus war nur wenig bekannt. Deshalb wurden mit Hilfe eines in vitro-Deepoxidationssystems sowohl native als auch rekonstituierte LHCI hinsichtlich ihrer Deepoxidationseigenschaften untersucht und der Deepoxidationsgrad von in vivo deepoxidierten Pigment-Protein-Komplexen bestimmt. Aus den Deepoxidationsexperimenten konnte abgeleitet werden, dass in den verschiedenen Lhca-Proteinen unterschiedliche Carotinoidbindungsstellen besetzt sind. Außerdem bestätigten diese Experimente, dass der Xanthophyllzyklus auch im LHCI auftritt, wobei jedoch ein niedrigerer Deepoxidationsgrad erreicht wird als bei LHCII. Dies konnte durch in vitro-Deepoxidationsversuchen auf eine geringere Deepoxidierbarkeit des von Lhca1 und Lhca2 gebundenen Vio zurückgeführt werden. Damit scheint Vio in diesen Lhca-Proteinen eher eine strukturelle Rolle zu übernehmen. Eine photoprotektive Funktion von Zeaxanthin im PSI wäre folglich auf Lhca3 und Lhca4 beschränkt. Damit enthält jede LHCI-Subfraktion ein LHC-Monomer mit langwelliger Fluoreszenz, das möglicherweise am Lichtschutz beteiligt ist. Insgesamt zeigten die Untersuchungen der Pigmentbindung, der Deepoxidierung und der Fluoreszenzeigenschaften, dass sich die verschiedenen Lhca-Proteine in einem oder mehreren dieser Parameter unterscheiden. Dies lässt vermuten, dass schon durch leichte Veränderungen in der Proteinzusammensetzung des LHCI eine Anpassung an unterschiedliche Licht-verhältnisse erreicht werden kann.

Untersuchungen zum infektiösen Aufnahmeweg des humanen Papillomvirus HPV33

Nicht-umhüllte humane Papillomviren binden an Heparansulfatproteoglykane (HSPG) der Zelloberfläche und werden durch Endocytose in Zielzellen aufgenommen. Um eine effiziente Infektion zu etablieren, muss die virale DNA in den Zellkern transportiert werden. Auf welche Art und Weise hierbei die Endosomenmembran überwunden wird, war bislang völlig unklar. Die Suche nach potentiellen membrandestabilisierenden Eigenschaften der Kapsidproteine L1 und L2 von HPV führte im Vorfeld der vorliegenden Dissertation zur Identifizierung eines carboxyterminalen Peptids des minoren L2-Proteins, welches als sehr mikrobizid und fungizid beschrieben werden konnte. Es ist gekennzeichnet durch einen Bereich basischer und einen Bereich hydrophober Aminosäuren. Da das minore L2-Protein für den Infektionsprozess von Papillomviren essentiell ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Rolle des C-terminalen Peptids für den Transport des infektiösen Materials durch die zelluläre Membranbarriere genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das carboxyterminale L2-Peptid von HPV33 nach externer Zugabe eine cytotoxische Wirkung auf höhere eukaryotische Zellen hat. Es lokalisiert an zellulären Membranen und induziert eine pH-abhängige Reduktion des ATP-Gehalts von Säugerzellen. Weiter wurde nachgewiesen, dass das Peptid die Cytoplasmamembran permeabilisieren und für kleine, hydrophile Substanzen wie Propidiumjodid durchlässig machen kann. Mutationen innerhalb des Peptids verdeutlichten die Notwendigkeit beider Bereiche, basischer und hydrophober Aminosäuren, für den membrandestabilisierenden Effekt. Im Folgenden wurde die intrazelluläre Aktivität des L2-Peptids mit Hilfe von GFP2-Peptid-Fusionen analysiert. Das Peptid ist in der Lage, eine Integration des globulären GFP-Dimers in Membranen zu vermitteln, was bei einem hohen Prozentsatz der exprimierenden Zellen zum Absterben führt. Auch wt 33L2 weist im Gegensatz zu C-terminalen Deletions- und Punktmutanten die Fähigkeit zur Membranassoziation auf. Abschließend wurde der Effekt von Mutationen innerhalb dieses L2-Peptids auf die Infektiösität von L1/L2-Pseudovirionen beschrieben. Die Mutationen haben keinen Einfluss auf den Einbau des L2-Proteins in die Pseudovirionen und auf die DNA-Verpackung. Die Virusmorphogenese ist somit nicht negativ beeinträchtigt. Die Infektiösität der HPV33- wie auch von HPV16-Pseudovirionen mit C-terminal mutiertem L2-Protein ist jedoch auf das Niveau von solchen reduziert, die nur aus dem majoren L1 bestehen und geht gegen Null. Zusammenfassend kann man festhalten, dass das minore Kapsidprotein L2 von HPV am Carboxyterminus eine membrandestabilisierende Aktivität besitzt, welche unter Papillomviren konserviert und für eine effektive Infektion essentiell ist.

Charakterisierung von T-Zell-Antworten gegen humane Nierenzellkarzinome sowie Identifizierung von HLA-G als tumorassoziiertes Antigen und Immunevasionsmechanismus des Nierenzellkarzinoms

Humane Nierenzellkarzinom-(NZK)-Zelllinien wurden etabliert, um sie zur Generierung von autologen zytotoxischen T-Zelllinien einzusetzen. Erst nach Modifikation mit dem kostimulierenden B7-1-Molekül wurden mit der NZK-Zelllinie MZ1257RC autologe, tumorspezifische T-Zelllinien generiert und charakterisiert. Die Aufklärung eines T-Zell-definierten TAA eines autologen, zytotoxischen T Zellklons wurde mittels Expressionsklonierung einer hergestellten cDNS-Expressionsbank begonnen. Nach in vitro-Sensibilisierung von peripheren Blutmonozyten mit der autologen NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde die HLA-Klasse I-restringierte T Zelllinie XIE6 generiert, die die autologe und verschiedene allogene NZK- sowie Zervixkarzinom-Zelllinien, jedoch nicht autologe Nierenzellen lysiert. Die T Zellen exprimieren TZR Vβ13.6-Ketten und sezernieren GM-CSF und IL-10 nach Antigenstimulation. Jedoch ist die NZK-Zelllinie MZ2733RC wenig sensitiv gegenüber autologen und allogenen Effektorzellen. Erst die Blockade ihrer HLA Klasse I-Moleküle auf der Zelloberfläche erhöht ihre Sensitivität gegenüber allogenen lymphokin-aktivierten Killer-Zellen. Verantwortlich dafür können nicht-klassische HLA Klasse Ib-Moleküle, insbesondere HLA-G sein, dessen Transkripte in der RNS der NZK-Zellen, jedoch nicht in Nierenzellen detektiert wurden. In einer detaillierten Studie wurden HLA-G-Transkripte in NZK-Zelllinien (58%), in NZK-Biopsien (80%), und nur in wenigen Nierenepithelbiopsien (10%) nachgewiesen. In der NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde eine konstitutive HLA-G1-Proteinexpression beobachtet, die durch eine IFN-γ-Behandlung induzierbar ist.

Überexpression und Charakterisierung des extrazellulären Teils der humanen alpha-Sekretase ADAM10

„ÜBEREXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DES EXTRAZELLULÄREN TEILS DER HUMANEN alpha-SEKRETASE ADAM10“ ALEXANDRA LEPTICH Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei enzymatisch aktive lösliche Proteinvarianten der humanen alpha-Sekretase ADAM10 in Insektenzellen exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Dabei entsprach eine der löslichen ADAM10-Varianten dem extrazellulären Bereich des Typ-I-Membranproteins, d.h. ihr fehlte die Transmembran- und cytoplasmatische Domäne. Die zweite Variante stimmt mit einer im menschlichen Gehirn auf mRNA-Ebene nachgewiesenen Splicevariante überein, die zusätzlich noch durch das Fehlen der Cystein-reichen Domäne gekennzeichnet ist. Die alpha-Sekretase ADAM10 spielt eine wichtige Rolle bei der nicht-amyloidogenen Prozessierung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP). Dabei erfolgt dessen Spaltung innerhalb der beta-Amyloidsequenz, so dass die Produktion von Abeta-Peptiden und damit die Bildung von Amyloid-Plaques während der Alzheimer’schen Erkrankung verhindert wird. Nach der Expression der beiden löslichen ADAM10-Proteine in Insektenzellen erfolgte die Reinigung der prozessierten und damit reifen Enzymform der jeweiligen ADAM10-Proteinvariante mittels Lektin-Affinitätschromatographie. Die anschließende Charakterisierung der beiden löslichen ADAM10-Proteine erfolgte durch einen auf HPLC-Analyse basierenden Enzymtest. Dabei wurden verschiedene sich von der beta-Amyloid-Sequenz ableitenden Peptidsubstrate in vitro eingesetzt, die zum einen den Aminosäuren 11-28 der Abeta-Sequenz, zum anderen dem kompletten Abeta40-Peptid entsprachen und damit die charakteristische alpha-Sekretasespaltstelle des Amyloid-Vorläufer-Proteins enthielten. Des Weiteren kamen jeweils entsprechende Peptidsubstrate zum Einsatz, die an den Positionen 21 und 22 der Abeta- Peptidsequenz vorkommenden Mutationen trugen. Die gewählten Abeta-Substrate konnten durch die löslichen Varianten der alpha-Sekretase ADAM10 an der alpha-Sekretasestelle gespalten werden. Dabei konnte bei den Abeta11-28-Peptiden deutlich die in der Literatur beschriebene Abhängigkeit der Spaltung von der a-helicalen Struktur des Substrats beobachtet werden, während bei den längeren Abeta40-Peptide diesbezüglich kein Zusammenhang hergestellt werden konnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ADAM10 hauptsächlich als alpha-Sekretase wirkt, weniger als ein Abeta-degradierendes Enzym. Ferner konnte unter Verwendung entsprechender muriner und humaner Abeta-Peptide eine verstärkte Spaltung der murinen Substrate Abeta1-28 und Abeta1-40 durch den extrazellulären Teil von ADAM10 in vitro gezeigt werden. Dieser Versuch bestätigt die Annahme, dass es bei Nagetieren durch die Bevorzugung der nichtamyloidogenen Prozessierung von APP durch die alpha-Sekretase ADAM10 zu keiner Bildung von Amyloid-Plaques kommt. Ein Einfluss auf die Spaltung von membrangebundenem APP und damit der Bildung von neuroprotektivem sAPPalpha durch die löslichen ADAM10-Proteine konnte im Zellsystem nicht beobachtet werden. Vielmehr scheint hier die Membranverankerung von Enzym und Substrat eine wichtige Voraussetzung zu bilden. Des Weiteren konnten die löslichen ADAM10-Proteine durch ein für die Inhibierung von ADAM10 spezifische Hydroxamat-Derivat in ihrer enzymatischen Aktivität gehemmt werden. Die exprimierten ADAM10-Proteine weisen die charakteristischen Eigenschaften der alpha-Sekretase ADAM10 auf, wobei deutlich wurde, dass das Fehlen der Cystein-reichen Domäne keinen Einfluss auf die Fähigkeit der katalytischen Domäne zur Substrat- und Inhibitorbindung hatte. Auch die Stabilität des Enzyms wurde durch das Fehlen der Domäne nicht negativ beeinträchtigt. Eine wichtige Aufgabe stellt nun der Nachweis der löslichen ADAM10-Proteine sowie die Identifizierung ihrer potentiellen Substrate und deren Lokalisation in vivo dar.

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual’s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Identifizierung und Charakterisierung neuer Proteine des Abwehrsystems der Porifera - ein Apoptoseregulator und ein antimikrobielles Protein aus dem Schwamm Suberites domuncula

Aufgrund ihrer Lebensweise und -umgebung sind effiziente Strategien zur Abwehr bedrohender Einflüsse essentiell für die Porifera. Eine dieser Strategien stellen die Apoptose in höheren Metazoen, sowie ein effizientes Immunsystem dar. Diese sichern sowohl das Überleben des Organismus als auch die Entfernung beschädigter, infizierter oder redundanter Zellen. Bei Untersuchungen der Porifera auf Moleküle, die an diesen Prozessen beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren beachtliche Erfolge erzielt werden. So konnten das in der Apoptose involvierte Protein GCDD2 (proapoptotisch), die antiapoptotischen GCBHP1 und GCBHP2 Proteine (Wiens et al., 2001), sowie ein LPS induzierbarer TNF (Wiens et al., 2007) und zwei Caspasen (Wiens et al., 2003) in Schwämmen identifiziert werden. Um diese essentiellen Mechanismen besser verstehen zu können, sollte ein möglicher Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor identifiziert werden. Hierzu wurde die SpongeBase Datenbank nach Proteinen mit Todesdomänen durchsucht und diese unter Anwendung von PCR- und Screening-Techniken in einer cDNA-Bank des marinen Schwammes S. domuncula komplettiert. Im Anschluss an ihre Sequenzierung wurde ein Klon ausgewählt, dessen Todesdomäne größte Homologie zu einem TNFR zeigte. Dieser Klon SD_TNFR-like (Suberites domuncula TNFR-homologes Protein) wurde anschließend diversen Sequenz- und Strukturanalysen unterzogen. Diese offenbarten die Existenz zweier funktional bedeutsamer Domänen (Ubiquitin-like und Todesdomäne). Vor allem die Todesdomäne impliziert eine Beteiligung des Proteins an apoptotischen Prozessen. Über einen „Yeast Two Hybrid Screen“ sollten Proteine identifiziert werden, welche mit dem Ausgangsprotein interagieren. Hierbei wurde ein Protein identifiziert, das Ähnlichkeit mit einem antimikrobiellen Peptid aufweist. Dieses Protein kann analog zu einer Gruppe von antimikrobiellen Peptiden, den α-helikalen kationischen Peptiden, in drei Teile gespalten werden. Das Signalpeptid sowie ein anionisches Propeptid werden abgespalten und es entsteht ein kationisches, antimykotisch wirksames Peptid. Beide Proteine sollten, sofern sie in die Abwehrreaktionen involviert sind, durch Inkubation mit mikrobiellen Strukturen vermehrt exprimiert werden. Eine Überprüfung der Transkription mittels Northern Blot Analysen bestätigte dies für das SD_TNFR-like nach Inkubation mit LPS und TNF- α sowie für SD_Brevinin-like nach Inkubation mit LPS, PAM und Hefe. Mit der Herstellung eines rekombinanten SD_TNFR-like-Proteins wurde die Immunisierung von Kaninchen und die folgende Gewinnung eines polyklonalen SD_TNFR-like-Antikörpers ermöglicht. Dieser gestattete den Nachweis der SD_TNFR-like -Expression mittels Western Blot-Analysen sowie die stressinduzierte erhöhte Expression mittels Dot Blot-Analysen auch auf Proteinebene. Um die Funktion des SD_TNFR-like Proteins zu charakterisierten, wurde ein Test mit RAW-Blue™-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse implizieren, dass das Protein Teil der Immunreaktion analog der der TLR- bzw. NLR- Reaktion ist. Auch die Interaktion mit einem antimikrobiellen Protein, welches für das Überleben des Organismus und die Bekämpfung der Mikroorganismen sorgt, deutet auf eine solche Beteiligung hin. Zusätzlich wird diese These durch ein Ergebnis der Strukturanalysen unterstützt, nämlich die Identifizierung einer TRAF2 Bindestelle. TRAF2 ist ein Adapterprotein der TNFR und aktiviert Überlebensfaktoren über den NF - B-Weg. Immunohistochemische Analysen zeigten, dass das SD_TNFR-like Protein im Organismus vor allem um die Bakteriozysten, um verschiedene Mikroorganismen und am Rand des Schwammes exprimiert wird, was ebenfalls für eine immunologische Funktionsweise spricht. Auch im restlichen Gewebe wird es kontinuierlich, auch ohne vorherige LPS Inkubation exprimiert. Diese Akkumulation zeigt deutlich, dass das Protein in einen Schutzmechanismus gegen äußere Bedrohungen involviert ist. Es scheint dabei direkt an den eindringenden Mikroorganismen zu wirken. Das SD_TNFR-like ist demnach ein potentieller Bestandteil der Immunantwort des Schwammes, welches Apoptose verhindern und Überlebensmechanismen aktivieren kann. Das SD_Brevinin-like Protein besitzt antimykotische Aktivität, wie in einem antimikrobiellen Test gezeigt werden konnte. Weiterhin scheint es für das SD_TNFR-like Protein als positiver bzw. negativer Regulator von Bedeutung zu sein, der eine Reaktion entweder beendet oder die Expression von Überlebensfaktoren verstärkt. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen demonstrieren somit die Identifizierung eines neuen Schwammproteins, welches eine Rolle in der Immunantwort spielt, sowie eines neuen antimikrobiellen Peptids, welches die Wirkung des TNFR-like moduliert. Es müssen jedoch noch weitere Funktionsanalysen folgen, um den Mechanismus des SD_TNFR-like Proteins und seine Regulation genauer charakterisieren zu können

Aufbau und Simulation des KAOS-Spektrometers für Koinzidenzmessungen in der assoziierten Kaonproduktion

Mit der Erweiterung des Elektronenbeschleunigers MAMI um eine dritte Stufe ist es möglich geworden, am Institut für Kernphysik Teilchen mit offener Strangeness zu produzieren. Für deren Nachweis ist die Drei-Spektrometeranlage der Kollaboration A1 um das von der GSI in Darmstadt übernommene KAOS-Spektrometer erweitert worden. Untersucht wird damit die elementare Reaktion p(e,e' K+)Lambda/Sigma0 wobei das auslaufende Elektron und das Kaon nachgewiesen werden müssen. Wird als Target nicht Wasserstoff verwendet, besteht die Möglichkeit dass sich ein Hyperkern bildet. Spektroskopische Untersuchungen an diesen bieten die Möglichkeit das Potential von Hyperonen in Atomkernen und die Hyperon-Nukleon-Wechselwirkung zu untersuchen. Aufgrund der hervorragenden Strahlqualität bei der Elektroproduktion können hier Massenauflösungen von einigen hundert keV/c² erreicht werden. Mit Hilfe von GEANT4 wurden die Detektoren und die Abbildungseigenschaften des Spektrometers simuliert. Geeignete Ereignisgeneratoren wurden implementiert. Es wurde untersucht, wie mögliche Treffermuster in den Detektoren aussehen, die von einem Trigger auf FPGA-Basis selektiert werden müssen. Ebenso konnte hieraus eine erste Abbildung der Spurkoordinaten auf die Targetkoordinaten und den Teilchenimpuls gewonnen werden. Für das Hyperkernprogramm muss KAOS unter 0° Vorwärtsrichung betrieben werden und der Primärstrahl mit Hilfe einer Schikane durch den Dipol gelenkt werden. Die Simulation zeigt hier eine nur moderate Erhöhung der Strahlenbelastung, vor allem im Bereich des Strahlfängers. Somit ist es möglich, KAOS als doppelseitiges Spektrometer in der Spektrometerhalle zu betreiben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die für sämtliche Detektoren nötige Auslese- und Steuerungselektronik in das vorhandene Datenerfassungssystem und das Steuerungssystem eingebunden. In zwei Strahlzeiten im Herbst 2008 wurden Kaonen im Winkelbereich von 20°-40° mit Impulsen zwischen 400MeV/c und 600MeV/c nachgewiesen. Die aus der Simulation gewonnenen Daten zum Trigger und zur Abbildung kamen zum Einsatz. Es konnte die für eine gute Teilchenidentifikation nötige Zeitauflösung von ca. 1ns FWHM erreicht werden. Die erreichte Winkel- und Impulsauflösung war ausreichend um Lambda und Sigma0-Hyperonen im Spektrum der fehlenden Masse leicht trennen zu können.

Klonierung und Charakterisierung der Luziferase und des Luziferin regenerierenden Enzyms aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula

Bereits 1971 erkannte Reiswig bei einigen Schwämmen in der Kontraktion des Osculums eine Reaktion auf Licht. Nachfolgend konnte für eine Reihe von Schwämmen die Existenz von Lichtreaktionen beobachtet werden (Wapstra & van Soest, 1987). In dieser Arbeit sollten Gene eines Luziferin/Luziferase Systems im marinen Schwamm Suberites domuncula identifiziert werden, die eine Rolle bei der Bio¬lumineszenz spielen. Mit Hilfe der PCR-Technik konnten die in der cDNA-Bank identifizierten Fragmente einer Luziferase und eines Luziferin regenerierenden Enzyms erfolgreich vervollständigt, kloniert und analysiert werden. Datenbank¬analysen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergeben sowohl für die Luziferase als auch für das Luziferin regenerierende Enzym Ähnlichkeiten zu den entsprechenden Proteinen aus Leuchtkäfern, wie z. B. Photinus pyralis. Ausgehend von der cDNA wurden zunächst beide Enzyme in E. coli rekombinant exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Für die Luziferase gelang es, spezifische Antikörper herzustellen, die im Anschluss an den im Western Blot durchgeführten Nachweis eine Identifizierung in histologischen Schwamm¬schnitten ermöglichte. Weitere Analysen konnten für Suberites domuncula sowohl im Schwammgewebe, im Proteinextrakt als auch für das rekombinante Protein die Licht-generierende Fähigkeit nachweisen. Das ermittelte in vitro Biolumineszenz-Emissionsspektrum der rekombinanten Luziferase weist eine Lichtemission im gelb-grünen Bereich des Spektrums mit einem Maximum bei 548 nm und einer Schulter bei 590 nm auf. Ausserdem bestätigte die Funktionanalyse des rekombinanten Enzyms die für Luziferasen bekannte ATP- und Temperatur¬abhängigkeit sowie den stimulierenden Effekt von Coenzym A. Die Existenz einer bioaktiven Luziferase in einem der ältesten, rezent vertretenen Metazoa deutet darauf hin, dass sich die Oxygenasefunktion der Luziferasen bereits früher entwickelte, als bisher von Viviani* vermutet. Die bisherigen Daten über die optischen Eigenschaften der Spiculae liefern gemeinsam mit den Ergebnissen dieser Arbeit – einer Licht-emittierenden Luziferase in S. domuncula – die Voraussetzungen für die mögliche Existenz eines Photorezeptionssystems in Schwämmen.

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-Out

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-OutrnrnBei Dmxl1 handelt es sich um ein neuartiges Gen aus Mus musculus. Das ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bioinformatisch untersuchte Gen DMXL1 ist das zu Dmxl1 homologe Gen des Menschen. Beide Gene bestehen aus 43 Exons, das murine Dmxl1 codiert für eine mRNA von 10992 bp bzw. 12210 bp, das humane DMXL1 kodiert für eine cDNA von 11082 bp, der offene Leserahmen umfasst bei der Maus 9042 bp. In der Maus konnte ein mögliches alternatives Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Zwischen beiden Spezies sind die Exonpositionen und ihre Längen hoch konserviert. Dmxl1 liegt auf dem Crick-Strang von Chromosom 18 Bande C, der translatierte Bereich erstreckt sich auf genomischer Ebene über 129558 bp und die Orientierung verläuft in Richtung Centromer. Dmxl1 und DMXL1 gehören damit zu den größten bekannten Genen in Maus und Mensch. Bei beiden Spezies liegen die DmX-Homologen genomisch innerhalb eines Bereichs der Isochoren-Klasse L1 in einer Gen-armen Region. Die Anzahl der repetitiven Elemente innerhalb der Genregion von Dmxl1 liegt 6% unter dem erwarteten Wert eines L1 Isochors, die Anzahl beim Menschen liegt 4% über dem erwarteten Wert. Um die mögliche Promotorstruktur von Dmxl1 darzustellen, wurden umfangreiche in silico-Analysen der Region um den putativen Transkriptionsstart vorgenommen. Mit Hilfe der gewonnenen Daten konnte ein Transkriptionstartpunkt identifiziert werden. Zudem wurde eine Promotorstruktur erarbeitet, bei der angenommen werden kann, dass sie eine gute Näherung an die tatsächlich vorhandenen Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren darstellt. Die mit bioinformatischen Werkzeugen erzeugte virtuelle Promotor- und Enhancerstruktur zeigt das Potenzial, Dmxl1 basal und ubiquitär zu exprimieren. Gleichzeitig zeigen diese Daten, dass Dmxl1 vermutlich in einigen Geweben der Keimbahn, im Fettgewebe, dem blutbildenen System und während der Embryogenese hochkomplex reguliert werden kann. Eine regulierte Expression zur Steuerung des Energiestoffwechsels ist ebenfalls wahrscheinlich. Diese Ergebnisse passen sehr gut zu den experimentell ermittelten Daten und den beobachteten Phänotypen Dmxl1-chimärer Mäuse.rnDie abgeleitete Aminosäuresequenz umfasst in der Maus 3013 AS, im Menschen 3027 AS, der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigt eine Identität von 89,3 % und eine Similarität von 94,7 % zwischen beiden Spezies. Im Dmxl1/DMXL1-Protein von Maus und Mensch konnten mindestens 24 und maximal 36 WD-Wiederholungseinheiten identifiziert werden, zudem wurden eine Reihe weiterer konservierter Proteinmotive gefunden. Die in silico-Strukturanalysen beider abgeleiteter Aminosäuresequenzen lässt vermuten, dass sich C- und N-terminal WD-Propellerstrukturen befinden. In dieser Arbeit gelang eine C-terminale Rekonstruktion einer 10-blättrigen Propellerstruktur, denkbar ist jedoch auch eine Struktur mit mindestens drei WD-Propellern, wenn eine prädominante Struktur mit Propellern aus jeweils sieben Propellerblättern angenommen wird.rnDas primäre Ziel dieser Arbeit, die Etablierung einer stabilen Mauslinie mit diruptiertem Dmxl1-Gen konnte aufgrund einer beobachteten Haploinsuffizienz nicht erreicht werden. Trotz zahlreicher Transformationen von Maus-Stammzelllinien konnte letztlich nur eine stabil transformierte Linie mit einem Dmxl1-Null-Allel identifiziert werden, was auch zu den theoretischen Daten und den angenommenen Aufgaben von Dmxl1 als komplex und diffizil reguliertes Multifunktions-Protein passt. Aus der transformierten Mauszelllinie konnten chimäre Mäuse entwickelt werden, die in Abhängigkeit von dem Ausmaß des Chimärismus phänotypisch massive Schädigungen aufwiesen. Neben einer Teilsterilität wurden massive Fettleibigkeit und ein ausgeprägter Hypogonadismus beobachtet. Keines der Tiere war in der Lage das Dmxl1-Null-Allel zu transduzieren. Die Tiere waren nur sehr eingeschränkt fertil, die wenigen Nachkommen entsprachen genotypisch und phänotypisch ausschließlich den verwendeten Blastocysten.rn

Methylierung von anorganischem Quecksilber im Intestinaltrakt des Kompostwurms Eisenia foetida

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Methylierung von Quecksilber in Intestinaltrakt des Kompostwurms Eisenia foetida untersucht. Des Weiteren wurden aerobe und anaerobe Mikroorganismen aus dem Darmtrakt von Eisenia fotida isoliert, identifiziert und auf ihr Potential zur Methylierung von Quecksilber getestet. Die Bestimmung von Methylquecksilber erfolgte mittels GC-ICPMS (Gaschromatographie mit induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie) und GC-AFS (Gaschromatographie- Atomfluoreszenzspektrometrie). Für die GC-ICPMS erfolgte die Quantifizierung des Methylquecksilbers mittels der Isotopenverdünnungsmethode. Die Extraktion des Methylquecksilbers aus dem Wurmgewebe erfolgte durch einen alkalischen Aufschluss mit TMAH (Tetramethylammoniumhydroxid) und anschließender Derivatisierung des Methylquecksilbers durch Natriumtetrapropylborat. Für die Extraktion des gebildeten Methylquecksilbers aus Bakterienkulturen wurde eine Extraktion mit einer methanolischen Kaliumhydroxidlösung verwendet. Wie bei dem Wurmgewebe wurde das Methylqueckilsber ebenfalls mit Natriumtetrapropylborat derivatisiert.rnrnFür die Untersuchung einer in vivo Methylquecksilberbildung in bodenlebenden Invertebraten wurde der Kompostwurm Eisenia foetida als Modellorganismus verwendet. Die Tiere wurden aus einer Kultur in einen Boden überführt, der mit anorganischem Quecksilber versetzt wurde. Nach zehn Tagen Inkubationszeit wurden die Würmer entnommen und das Methylquecksilber extrahiert. Um eine mögliche Methylierung von Quecksilber durch Bodenorganismen auszuschließen wurde sowohl steriles als auch unsteriles Bodenmaterial verwendet. In den Wurmproben aus dem unsterilen Bodenmaterial konnte eine Konzentration an Methylquecksilber von 17,4 ng/g Trockengewicht (Boden ohne Zugabe von Quecksilber) und 62,4 ng/g Trockengewicht (Boden mit Quecksilberzugabe). Bei den Wurmproben aus sterilem Bodenmaterial lag die Konzentration an Methylquecksilber bei 17,2 ng/g Trockengewicht (Boden ohne Zugabe von Quecksilber) und 51,9 ng/g Trockengewicht (Boden mit Quecksilberzugabe).rnrnBei den Bakterienkulturen konnte in Reinkulturen keine Methylierung von Quecksilber nachgewiesen werden. In einer fakultativ anaeroben Mischkultur konnte eine Methylierung von Quecksilber beobachtet werden. Für die Identifizierung der Mikroorganismen wurde die 16s rDNA mittels PCR amplifiziert und anschließend über eine DGGE aufgetrennt. Die Banden wurden ausgeschnitten und sequenziert. Dabei konnten drei Enterobacteriaceen identifiziert werden.rn

Die Kristallstruktur zweier Atmungsproteine: das Hämoglobin des Meerschweinchens und das 24-mere Hämocyanin des Kaiserskorpions

Im Verlauf der vorgestellten Arbeit konnten die Kristallstrukturen zweier Atmungsproteine gelöst werden. Da diese Strukturen mit verschiedenen Auflösungen gelöst wurden, wurden für die beiden Modelle unterschiedliche Methoden verwendet.rnrnDie Kristalle des Hämoglobins des Meerschweinchens Cavia porcellus erlaubten eine Messung von Streureflexen bis zu einer Auflösung von 1.7 Ǻ. Damit konnten das Molecular Replacement und das folgende Refinement mit geringen Vorgaben durchgeführt werden.rnAnhand der ermittelten Struktur konnte gezeigt werden, dass die Höhenadaptation des Hämoglobins des Meerschweinchens auf einer Stabilisierung des R2-Zustandes und einer gleichzeitigen Destabilisierung des T-Zustandes beruht. Die zu Grunde liegenden Aminosäureaustausche konnten identifiziert und der resultierende Mechanismus postuliert werden. Die Durchführung von Mutagenese-Experimenten am Hämoglobin des Meerschweinchens könnte die vorgestellte Hypothese bestätigen.rnrnDie Kristallstruktur des 24-meren Hämocyanins aus Pandinus imperator konnte durch eine Kombination von Röntgenkristallographie und Homologiemodellierung mit einer Auflösung von 6.5 Ǻ gelöst werden. Allerdings wäre die Bestimmung der Phasen durch Molecular Replacement ohne die vor kurzem publizierte Kryo-EM Struktur nicht möglich gewesen [Cong et al., 2009].rnDamit ist es durch die Kombination verschiedener Methoden erstmalig gelungen die Struktur eines Hämocyanins dieser Größe (Mw = 1.7 MDa) zu lösen. Die Auflösung von 6.5 Ǻ, eine für die Kristallographie relativ geringe Auflösung, erlaubte die Bestimmung des Cα-Traces des Proteins mit hoher Genauigkeit.rnDurch die Kristallstruktur konnte das zu Grunde liegende Kryo-EM Modell aus [Cong et al., 2009] bestätigt werden. Insbesondere die Position der α-Helices konnte mittels Kristallographie mit einer höheren Genauigkeit bestimmt werden. Durch die Verwendung von OMIT-Maps wurde sichergestellt, dass die Struktur nicht "kopiert" wurde. Die Übereinstimmung ist deshalb auf die Struktur des Hämocyanins im gemessenen Kristall zurückzuführen, nicht auf einen Bias bei der Auswertung.rnAnhand der Kristallstruktur konnten für die Kooperativität im Trimer potentiell entscheidende Aminosäuren identifiziert werden. Diese Aminosäuren könnten im Vergleich zur bekannten trimeren Struktur aus Limulus polyphemus zur Ausbildung zusätzlicher Bindungen zwischen den Untereinheiten führen. Diese Bindungen könnten eine wichtige Rolle beim Konformationsübergang zwischen dem T- und R-Zustand spielen.rn